Une méthode pour évaluer les fonctions effectrices induite par le Fc induites par les anticorps spécifiques d’hémagglutinine de grippe

L’objectif général de ce protocole est d’évaluer la capacité d’un anticorps ou d’un échantillon de sérum à activer la fonction effectrice médiée par Fc. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’immunologie et de la vaccinologie en mesurant l’activation de l’immunité médiée par Fc dépendante des anticorps. Le principal avantage de cette technique est que l’expérience peut être réalisée dans les 24 heures qui suivent la préparation du matériau jusqu’à l’analyse des données.

La démonstration de cette procédure sera faite par Mark Bailey, étudiant diplômé du laboratoire de Peter Palese. Pour induire l’expression de l’hémagglutinine du virus de la grippe par transfection, la première plaque de 293 cellules de rein embryonnaire humain à deux fois 10 à la quatrième cellule par concentration de puits dans une culture de tissu blanc traitée à 96 puits. Après quatre heures à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2, transfectez les cellules avec 100 nanogrammes d’ADN codant pour l’hémagglutinine virale et 0,2 microlitre de réactif de transfection par puits et un volume total de 50 microlitres de milieu sérique 1 fois plus réduit que l’on puisse optimum.

Ajoutez des complexes de liposomes d’ADN dans chaque puits pour transfecter et remettez la plaque dans l’incubateur pendant 18 heures supplémentaires. Pour induire l’expression de l’hémagglutinine du virus de la grippe par infection, la plaque A549 cellules à deux fois 10 à la quatrième cellule par puits concentration dans une culture de tissus blancs traitée à 96 puits pour une incubation d’au moins 18 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. À la fin de l’incubation, diluez le virus de la grippe jusqu’à une infection multiplicielle de trois dans 100 microlitres de milieu 1X MEM par puits et infectez les cellules A459 pendant une heure dans l’incubateur de culture cellulaire.

À la fin de l’incubation, remplacez l’inoculum par 100 microlitres de milieu MEM 1X frais sans virus et retournez les cellules dans l’incubateur pendant 18 à 24 heures supplémentaires. Pour évaluer la capacité d’anticorps spécifiques d’intérêt à cibler les cellules exprimant l’hémagglutinine, remplacez le surnageant des cultures cellulaires affectées par le virus par 25 microlitres de milieu de test ADCC (Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity). Ensuite, dans une plaque séparée à 96 puits, effectuez quatre dilutions complètes des anticorps d’intérêt en triple exemplaire dans un milieu ADCC frais en commençant à 10 microgrammes par millilitre selon le schéma et en prenant soin d’inclure le bruit de fond et aucun témoin d’anticorps.

Lorsque tout l’anticorps a été dilué, transférez 25 microlitres de l’anticorps dilué dans les puits correspondants appropriés dans la plaque cellulaire expérimentale et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire. Après 15 minutes, ajoutez 7,5 fois 10 aux quatrièmes cellules effectrices Jurkat modifiées exprimant le récepteur Fc approprié par puits dans 25 microlitres de milieu ADCC pour un volume final de 75 microlitres de milieu ADCC par puits. Remettez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant six heures, en décongelant le tampon de substrat de luciférase dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant la dernière heure de l’incubation.

Lorsque le tampon est prêt, ajoutez 75 microlitres de tampon de substrat de luciférase à tous les puits sauf le puits de contrôle d’arrière-plan et lisez la plaque sur un luminomètre. L’induction de la cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps dans les cultures cellulaires transfectées ou infectées peut alors être calculée. Dans cette expérience, un anticorps monoclonal spécifique à la souche a activé et modifié de manière robuste les cellules Jurkat exprimant le récepteur gamma Fc murin quatre d’environ 14 fois par rapport aux anticorps monoclonaux et aux anticorps IgG témoins spécifiques à la tête.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mettre en place une expérience pour évaluer la capacité d’anticorps d’intérêt spécifiques à activer l’immunité médiée par Fc.