Name: Une méthode pour évaluer les fonctions effectrices induite par le Fc induites par les anticorps spécifiques d’hémagglutinine de grippe (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: Découvrez une méthode pour évaluer les fonctions effectrices Fc induites par des anticorps anti-hémagglutinine de grippe. Ce protocole rapide, réalisable en 24 heures, utilise des cellules HEK293 et mesure la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps.

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Ce projet a été financé en partie avec des fonds fédéraux depuis le National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, sous CEIRS contrat P01AI097092-04S1 (P.E.L.).

Les expériences réalisées dans ce manuscrit ont été faites code institutionnel suivant Icahn School of Medicine de l’éthique et des règlements.
1. expression de l’hémagglutinine Virus Influenza par Transfection ou Infection
Transfection :
<ol><li>Cellules humaines embryonnaires de rein (HEK 293 t) plaque à une densité de 2 x 104 cellules/puits dans une culture de tissus blanche traitement plaque 96 puits et laisser reposer pendant 4 h dans un incubateur à 37 °C (avec 5 % de CO2).</li>
	<li>Transfecter cellules avec 100 ng d’ADN codant pour l’hémagglutinine virale et 0.2 μl de réactif de transfection par puits dans un volume total de 50 μL. NOTE : Les plasmide et transfectant réactif sont dilués dans 1 x moyen de sérum réduit Opti-Minimum essentiel médiatique (MEM).</li>
	<li>Après incubation des plaques dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 18 heures, retirez le support de la transfection.</li>
</ol>2. infection
<ol><li>Des cellules de rein canin plaque A549 ou Madin Darby à une densité de 2 x 104 cellules/puits dans une culture de tissu blanche traitement plaque 96 puits et croître pendant au moins 18 h dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2.</li>
	<li>Virus dilué dans 1 x MEM et infecter des cellules à une multiplicité d’infection de 0,33 dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2pendant 1 heure, 1 ou 3. Volume total doit être égal à 100 μL. Remarque : 10 x MEM est dilué avec de l’eau pour faire un 1 x stock travail MEM pour la dilution des virus mentionnée ci-dessus.</li>
	<li>Après l’infection, enlever l’inoculum et ajouter 100 μL de 1 x MEM dans la plaque en l’absence de la trypsine.</li>
	<li>La croissance des cellules infectées pendant 18 à 24 heures dans une étuve à 37 °C avec 5 % de CO2.</li>
</ol>3. Evaluer l’Activation FcRg/NFAT-négociée de l’activité de la luciférase par anticorps monoclonaux ou sérums
<ol><li>Tout d’abord, remplacer les milieux de culture des cellules transfectées ou infectés par 25 µL de médias de dosage (1 x RPMI 1640 additionné de 4 % (vol/vol) faible IgG fœtale bovine sérums).</li>
	<li>Dans une plaque à 96 puits distincte, effectuer des dilutions en quatre volets des anticorps d’intérêt à partir de 30 μg/mL à partir du support d’essai. Effectuer des dilutions en géométrie et un schéma exemple est illustré dans la Figure 1 a. Assurez-vous d’inclure un contrôle qui exclut les anticorps (aucun contrôle de l’anticorps) ainsi qu’un contrôle de fond (tampon seul). Remarque : pour les deux le « aucun anticorps » et contrôles de fond, ajouter 25 µL de tampon au lieu d’anticorps.</li>
	<li>Transférer 25 μL des anticorps en série dilués d’étape 3.2 aux puits correspondants sur la plaque de cellules transfectées ou les cellules infectées.</li>
	<li>Incuber les plaques dans un incubateur à 37 °C pendant 15 min (avec 5 % de CO2).</li>
	<li>Ajouter 25 μL de la cellule de Jurkat effecteur mis à jour l’approprié exprimant FcgRIV murine ou humaine FcgRIIIa (75 000 cellules/puits). Volume total pour chaque bien doit être de 75 µL et la concentration finale de départ de l’anticorps est à 10 µg/mL (Figure 1 b). Remarque : Pour le contrôle de fond, ajouter 25 µL de tampon au lieu de cellules effectrices. Pour examiner la phagocytose de médiation cellulaire dépendante des anticorps, une cellule modifiée de Jurkat exprimant la FcgRIIa humaine peut être utilisée.</li>
	<li>Incuber les plaques dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % de CO2 pendant 6 h.</li>
	<li>Dégel et tampon de substrat de luciférase chaud dans une eau de 37 °C pendant environ 1 h avant utilisation. Remarque : Pour rendre la mémoire tampon de substrat luciférase, reconstituer substrat test luciférase lyophilisée dans du tampon fourni. Le tampon de substrat reconstitué peut être stocké à-30 °C à-10 °C jusqu'à six semaines.</li>
	<li>Ajouter 75 μL/puits de tampon de substrat de luciférase à tous les puits sauf le contrôle arrière-plan.</li>
	<li>Lire sur un luminomètre.</li>
	<li>Calculer l’induction de pli par l’équation suivante : plier induction = (valeur de la valeur-Background Induced) / (aucune valeur de valeur-fond mAb).</li>
</ol>

<ol><li>Hobson, D., Curry, R. L., Beare, A. S., Ward-Gardner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+serum+haemagglutination-inhibiting+antibody+in+protection+against+challenge+infection+with+influenza+A2+and+B+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hygiene%22%5BJournal%5D)">The role of serum haemagglutination-inhibiting antibody in protection against challenge infection with influenza A2 and B viruses.</a> J Hygiene. 70 (04), 767-777 (1972).</li>
<li>Throsby, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosubtypic+neutralizing+monoclonal+antibodies+cross-protective+against+H5N1+and+H1N1+recovered+from+human+IgM%2B+memory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells.</a> PloS One. 3 (12), e3942(2008).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324 (5924), 246-251 (2009).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Conserved+Neutralizing+Epitope+on+Group+2+Influenza+A+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.</a> Science. 333 (6044), 843-850 (2011).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pan-H1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Broadly+Neutralizing+Monoclonal+Antibody+That+Targets+the+Fusion+Domain+of+Group+2+Influenza+A+Virus+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin.</a> J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).</li>
<li>Friesen, R. H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+solution+to+group+2+influenza+virus+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A common solution to group 2 influenza virus neutralization.</a> PNAS. 111 (1), 445-450 (2014).</li>
<li>Dreyfus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Conserved+Protective+Epitopes+on+Influenza+B+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses.</a> Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).</li>
<li>Krammer, F., Palese, P., Steel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Universal+Influenza+Virus+Vaccine+Design+and+Antibody+Mediated+Therapies+Based+on+Conserved+Regions+of+the+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microb+and+Immunol%22%5BJournal%5D)">Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin.</a> Curr Top Microb and Immunol. , Chapter 408 (2014).</li>
<li>Impagliazzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+trimeric+influenza+hemagglutinin+stem+as+a+broadly+protective+immunogen%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen.</a> Science. , (2015).</li>
<li>Nachbagauer, R., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Microbiology+and+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microb+Infect%22%5BJournal%5D)">Clinical Microbiology and Infection.</a> Clin Microb Infect. , 1-7 (2017).</li>
<li>Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+universal+influenza+virus+vaccine+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+virology%22%5BJournal%5D)">Novel universal influenza virus vaccine approaches.</a> Current opinion in virology. 17, 95(2016).</li>
<li>Steel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+vaccine+based+on+the+conserved+hemagglutinin+stalk+domain%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain.</a> mBio. 1 (1), (2010).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly+protective+stalk-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies.</a> J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Tan, G. S., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+Stalk-Reactive+Antibodies+Are+Boosted+following+Sequential+Infection+with+Seasonal+and+Pandemic+H1N1+Influenza+Virus+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin Stalk-Reactive Antibodies Are Boosted following Sequential Infection with Seasonal and Pandemic H1N1 Influenza Virus in Mice.</a> J Virol. 86 (19), 10302-10307 (2012).</li>
<li>Hai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+viruses+expressing+chimeric+hemagglutinins%3A+globular+head+and+stalk+domains+derived+from+different+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Influenza viruses expressing chimeric hemagglutinins: globular head and stalk domains derived from different subtypes.</a> J Virol. 86 (10), 5774-5781 (2012).</li>
<li>Dunand, C. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+Neutralizing+and+Non-Neutralizing+Human+H7N9+Influenza+Vaccine-Induced+Monoclonal+Antibodies+Confer+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection.</a> Cell Host and Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly-Reactive+Neutralizing+and+Non-neutralizing+Antibodies+Directed+against+the+H7+Influenza+Virus+Hemagglutinin+Reveal+Divergent+Mechanisms+of+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Path%22%5BJournal%5D)">Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection.</a> PLoS Path. 12 (4), e1005578(2016).</li>
<li>DiLillo, D. J., Tan, G. S., Palese, P., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+hemagglutinin+stalk-specific+antibodies+require+Fc%CE%B3R+interactions+for+protection+against+influenza+virus+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing hemagglutinin stalk-specific antibodies require FcγR interactions for protection against influenza virus in vivo.</a> Nat Med. 20 (2), 143-151 (2014).</li>
<li>DiLillo, D. J., Palese, P., Wilson, P. C., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+anti-influenza+antibodies+require+Fc+receptor+engagement+for+in+vivo+protection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing anti-influenza antibodies require Fc receptor engagement for in vivo protection.</a> J Clin Invest. 126 (2), 605-610 (2016).</li>
<li>Potter, C. W., Oxford, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+immunity+to+influenza+infection+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+Med+Bull%22%5BJournal%5D)">Determinants of immunity to influenza infection in man.</a> Brit Med Bull. 35 (1), 69-75 (1979).</li>
<li>Memoli, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Antihemagglutinin+and+Antineuraminidase+Antibodies+as+Correlates+of+Protection+in+an+Influenza+A%2FH1N1+Virus+Healthy+Human+Challenge+Model%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Antihemagglutinin and Antineuraminidase Antibodies as Correlates of Protection in an Influenza A/H1N1 Virus Healthy Human Challenge Model.</a> mBio. 7 (2), e00417(2016).</li>
<li>Jegaskanda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+cross-reactive+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+toward+2009+pandemic+influenza+A+virus+subtype+H1N1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Age-associated cross-reactive antibody-dependent cellular cytotoxicity toward 2009 pandemic influenza A virus subtype H1N1.</a> J Infect Dis. 208 (7), 1051-1061 (2013).</li>
<li>Jegaskanda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-Reactive+Influenza-Specific+Antibody-Dependent+Cellular+Cytotoxicity+Antibodies+in+the+Absence+of+Neutralizing+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-Reactive Influenza-Specific Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Antibodies in the Absence of Neutralizing Antibodies.</a> J Immunol. 190 (4), 1837-1848 (2013).</li>
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<li>He, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+Neutralizing+Anti-Influenza+Virus+Antibodies%3A+Enhancement+of+Neutralizing+Potency+in+Polyclonal+Mixtures+and+IgA+Backbones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Broadly Neutralizing Anti-Influenza Virus Antibodies: Enhancement of Neutralizing Potency in Polyclonal Mixtures and IgA Backbones.</a> J Virol. 89 (7), 3610(2015).</li>
<li>Kristensen, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Responses+with+Fc-Mediated+Functions+after+Vaccination+of+HIV-Infected+Subjects+with+Trivalent+Influenza+Vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Antibody Responses with Fc-Mediated Functions after Vaccination of HIV-Infected Subjects with Trivalent Influenza Vaccine.</a> J Virol. 90 (12), 5724-5734 (2016).</li>
<li>Greenberg, S. B., Criswell, B. S., Six, H. R., Couch, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+cytotoxicity+to+influenza+virus-infected+cells.+II.+Requirement+for+antibody+and+non-T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+%28Baltimore%2C+Md.+%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte cytotoxicity to influenza virus-infected cells. II. Requirement for antibody and non-T lymphocytes.</a> J Immunol (Baltimore, Md. : 1950). 119 (6), 2100-2106 (1977).</li>
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</ol>

Auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

La méthode décrite ici permet de mesurer la capacité d’un anticorps monoclonal spécifique HA de pratiquer la FcγRIV murin. L’antigène cible, hémagglutinine de virus de la grippe, est exprimée à la surface des cellules après l’infection par le virus ou la transfection d’ADN plasmidique. L’essai est plus favorable à l’utilisation de différentes protéines virales exprimées à la surface en combinaison avec d’autres FcγRs (humains ou murin). En outre, nous avons utilisé des échantillons de sérums pour évaluer la capacité des ...

L’immunité prévue par le vaccin contre la grippe saisonnière a traditionnellement été évaluée par l’hemagglutination inhibition (HI) test1, qui mesure la présence d’anticorps qui ciblent le site de liaison du récepteur de l’hémagglutinine. Ces anticorps HI-active peuvent conférer une immunité stérilisante, mais sont généralement étroites dans leur largeur de protection, en accordant l’immunité à seulement un peu select souches du virus grippal. L’isolement et la caractérisation d’anticorps monoclonaux largement qui reconnaissent l’hémagglutinine (HA) suggèrent que le développement d’un vaccin antigrippal universel est à portée de main2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8. l’un des objectifs majeurs d’un vaccin antigrippal universel est d’induire une réponse anticorps forte vers les régions conservées de la grippe virus9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16. globalement réactifs anticorps qui reconnaissent ces épitopes conservés, composé de neutralisants et non neutralisants anticorps17,18, auraient dû être divulgués d’exiger des interactions Fc-FcγR pour optimal protection in vivo et mettre en évidence la contribution de l’immunité à médiation Fc à l’immuno-réaction globale à l’influenza virus19,20.
Corrélats de protection sont essentiels dans l’évaluation de l’immunité aux infections. Ces mesures permettent des scientifiques et cliniciens estimer l’efficacité des vaccins, l’importance des données et la durée du traitement. Le seul corrélat établi de protection contre l’infection par le virus grippal est essai d’inhibition de l’hémagglutination. Un titre de 01:40 est associé à une réduction de 50 % du risque de maladie1,21 – et reflète la présence d’anticorps inhibant l’agglutination en ciblant le récepteur liaison site situé sur la tête globulaire de l’AP. Toutefois, il convient également de noter que les lymphocytes-T peuvent être un meilleur corrélat de protection contre l’infection par le virus de grippe chez les personnes âgées. Fait intéressant, un récent rapport suggère que l’inhibition de l’activité neuraminidase peut-être être un meilleur prédicteur de l’immunité grippe22. Heureusement, typique en vitro tests comme les tests d’inhibition de neutralisation ou de la neuraminidase peuvent mesurer les anticorps propres à tige ou neuraminidase HA. La plupart de ces dosages classiques en vitro , cependant, seulement prend en compte la fonction de la région de liaison de l’antigène de l’anticorps et ne mesure pas le rôle de la région Fc. En outre, la contribution des anticorps non neutralisants qui protègent via Fc récepteur engagement in vivo ne sont pas dépistés17,18. Afin de mesurer la protection conférée par les anticorps qui stimulent l’immunité à médiation Fc comme la cytotoxicité de cellule dépendante médiée par anticorps (ADCC), il faut un dosage fiable in vitro .
La méthode décrite ci-dessous évalue la capacité des anticorps monoclonaux murins pour induire des fonctions Fc-négociée par l’utilisation d’une lignée de cellules Jurkat transgénique exprimant une activation murin tapez 1 FcR, FcγRIV. Engagement d’anticorps de la FcγR transduit signalisation intracellulaire ce facteur nucléaire de déclencheurs de l’activité de la luciférase de médiée par les T-cellules activées. Le test a plusieurs avantages par rapport aux techniques traditionnelles qui nécessitent l’isolement et de culture de cellules effectrices primaires et de l’utilisation de la cytométrie pour détecter l’activation induite par le Fc effecteur fonctions19,23,24 ,25,26. Tout d’abord, le protocole décrit ici peut être facilement adapté pour intégrer les différentes cibles virales, FcγRs et anticorps provenant de différentes espèces (humains et murins). Deuxièmement, l’utilisation d’une cellule modifiée de Jurkat ligne exprimant un FcγR avec un gène de rapporteur luciférase sous un facteur nucléaire des lymphocytes T activés (NFAT) permet un dosage de grand format qui peut être facilement analysé à l’aide d’un lecteur de luminescence de mesure. Ici, la traditionnelle activation des cellules effectrices primaires est remplacée par l’induction de la luciférase-NFAT sur engagement des anticorps d’un FcγR sur la surface de la cellule Jurkat. Ce dosage de format de plaque à 96 puits permet la mesure de jusqu'à quatre différents échantillons en géométrie avec sept dilutions – un nombre d’échantillons pouvant être encombrant selon les techniques traditionnelles. Il y a des points supplémentaires à considérer pour cette analyse qui peut-être affecter la conception d’expériences et l’interprétation des données. La cible virale doit être exprimée à la surface cellulaire afin que la reconnaissance d’anticorps. Pour atténuer ce, l’antigène cible (par exemple une protéine virale interne) peut-être être directement enduit sur la surface d’une plaque. Toutefois, cela n’a pas encore été rigoureusement testé. En outre, la lignée Jurkat modifiée exprime qu’un seul type d’activation FcγR et n’exprime aucune inhibition FcγRs, tandis que les lignées cellulaires primaires expriment tous les récepteurs dans un contexte physiologique.
Nous avons déjà utilisé ce test pour démontrer que l’épitope spécificité dans un contexte polyclonaux joue un rôle crucial dans la régulation des fonctions effectrices induite par le Fc et que l’activation optimale de la réponse à médiation cellulaire dépendante des anticorps requiert deux points de Contacter le27,28. Nous décrivons ici une méthode qui évalue la capacité des anticorps monoclonaux spécifiques à tige d’engager et d’activer le murin activation FcγRIV. Bien qu’il y a des exceptions29,30, un grand nombre d’anticorps largement cible la région de tige sur le plan antigénique conservée de l’hémagglutinine et joue ainsi un rôle important dans le développement d’une grippe universelle vaccin.

<table><tbody><tr><td>A549 cellules&nbsp ;</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>Cellules épithéliales basales alvéolaires humaines adénocarcinomiques Cellules</td></tr><tr><td>HEK 293T ATCC</td><td></td><td>CRL-3216</td><td>Cellules rénales embryonnaires humaines</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies&nbsp ;</td><td>11668019</td><td>Réactif de transfection</td></tr><tr><td>1X Opti-MEM Sérum réduit ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à 96 puits traitée par culture de tissus blancs</td><td>Corning, Inc.&nbsp ;</td><td>3917</td><td>Plaques de dosage</td></tr><tr><td>10X MEM</td><td>Gibco</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat cell exprimant le FcgRIV</td><td>murin Le kit Promega</td><td>M1201</td><td>comprend des cellules, un système de dosage Bio-Glo Luciferase, des cellules Jurkat sériques 1X RPMI et à faible IgG</td></tr><tr><td>exprimant le FcgRIIIa</td><td>Promega</td><td>G7010</td> le <td>kit comprend des cellules, un système de dosage Bio-Glo Luciferase, un sérum 1X RPMI et un sérum</td></tr> <tr><td>à faible IgG</td> Le kit <td>Promega</td><td>G9901</td> comprend <td>des cellules, un système de dosage Bio-Glo Luciferase, un luminomètre sérique 1X RPMI et à faible IgG</td></tr><tr><td>Lecteur</td> multimode <td>BioTek</td><td>Synergy H1 Lecteur de</td><td>plaques de luminescence</td></tr> Système de <tr><td>dosage Bio-Glo Luciferase</td><td>Promega</td><td>G7940</td><td>Contient un tampon de dosage de luciférase et un substrat de dosage de luciférase</td></tr><tr><td>Cellules rénales canines de Madin Darby</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td>Cellules rénales canines</td></tr></tbody></table>

une méthode pour évaluer les fonctions effectrices induite par le fc induites par les anticorps spécifiques d’hémagglutinine de grippe

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Les anticorps jouent un rôle crucial dans la réponse immunitaire innée et adaptative contre des pathogènes viraux par le biais de leurs domaines de liaison de l’antigène et Fc-régions de couplage. Ici, nous décrivons comment mesurer l’activation du Fc fonctions effectrices par anticorps monoclonal ciblant l’hémagglutinine de virus de la grippe à l’aide d’une lignée de cellules Jurkat génétiquement modifiée exprimant une activation de type Fc 1-FcγR. à l’aide de cette méthode, la contribution des interactions spécifiques de Fc-FcγR conférés par immunoglobulines peut être déterminée à l’aide d’un test in vitro .

Nous avons démontré qu’une tige spécifique mAb, 6F12, mais pas de tête spécifique une tête spécifique mAb, PY102, a été capable d’activer les cellules tueuses naturelles primaires par ses CD107a et l’interféron γ19. Pour modéliser la capacité d’un anticorps spécifique au pédoncule à activer des cellules humaines primaires de NK, nous montrons qu’une tige spécifique mAb, 6F12, peut activer robuste la cellule Jurkat modifiée exprimant le murin FcγRIV par ~ 14 fois. En revanche, le mAb tête spécifiqu...

Les auteurs décrivent une méthode pour mesurer l’activation des fonctions effectrices Fc-médiée par les anticorps qui ciblent l’hémagglutinine du virus influenza. Ce test peut également être adapté afin d’évaluer la capacité des anticorps monoclonaux ou polyclonaux sérums ciblant d’autres glycoprotéines de surface virales à provoquer l’immunité induite par le Fc.

Une méthode pour évaluer les fonctions effectrices induite par le Fc induites par les anticorps spécifiques d’hémagglutinine de grippe

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

L'objectif général de ce protocole est d'évaluer la capacité d'un anticorps ou d'un échantillon de sérum à activer une fonction effectrice médiée par le fragment Fc. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l'immunologie et de la vaccinologie en mesurant l'activation de l'immunité dépendante des anticorps et médiée par le fragment Fc. Le principal avantage de cette technique est que l'expérience peut être réalisée en moins de 24 heures, du traitement des échantillons à l'analyse des données.La démonstration de cette procédure sera assurée par Mark Bailey, étudiant diplômé du laboratoire de Peter Palese. Afin d'induire l'expression de l'hémagglutinine du virus de la grippe par transfection, semez d'abord des cellules rénales embryonnaires humaines 293 à une concentration de deux fois 10 à la puissance 4 cellules par puits dans une plaque de culture tissulaire blanche à 96 puits. Après quatre heures à 37 °C et 5 % de CO2, transfectez les cellules avec 100 nanogrammes d'ADN codant pour l'hémagglutinine virale et 0,2 microlitre de réactif de transfection par puits, dans un volume total de 50 microlitres de milieu optimal à faible teneur en sérum 1X.Ajouter les complexes ADN-liposomes dans chaque puits pour transfecter et replacer la plaque dans l’incubateur pendant encore 18 heures. Pour induire l’expression de l’hémagglutinine du virus de la grippe par infection, semer les cellules A549 à une concentration de deux fois 10 à la puissance quatre cellules par puits dans une plaque de culture tissulaire blanche de 96 puits, puis incuber pendant au moins 18 heures à 37 degrés Celsius et 5 % CO2. À la fin de l’incubation, diluer le virus de la grippe à une multiplicité d’infection de trois dans 100 microlitres de milieu MEM 1X par puits et infecter les cellules A549 pendant une heure dans l’incubateur de culture cellulaire.À la fin de l'incubation, remplacer l'inoculum par 100 microlitres de milieu MEM 1X frais sans virus et remettre les cellules dans l'incubateur pendant encore 18 à 24 heures. Pour évaluer la capacité des anticorps spécifiques d'intérêt à cibler les cellules exprimant l'hémagglutinine, remplacer le surnageant des cultures cellulaires affectées par le virus par 25 microlitres de milieu de dosage de la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC). Ensuite, dans une plaque 96 puits distincte, effectuer quatre dilutions complètes des anticorps d'intérêt en triplets dans du milieu ADCC frais, en partant de 10 microgrammes par millilitre selon le schéma, en prenant soin d'inclure les témoins de fond et sans anticorps.Lorsque tout l'anticorps a été dilué, transférez 25 microlitres de l'anticorps dilué dans les puits correspondants appropriés de la plaque cellulaire expérimentale et placez la plaque dans l'incubateur de culture cellulaire. Après 15 minutes, ajoutez 7,5 fois 10 à la puissance 4 cellules effetrices modifiées de type Jurkat exprimant le récepteur Fc approprié par puit, dans 25 microlitres de milieu ADCC, pour un volume final de 75 microlitres de milieu ADCC par puit. Replacez la plaque dans l'incubateur de culture cellulaire pendant six heures, en décongelant le tampon de substrat de luciférase dans un bain-marie à 37 degrés Celsius durant la dernière heure de l'incubation.Lorsque le tampon est prêt, ajouter 75 microlitres de tampon de substrat de luciférase dans tous les puits sauf dans le puit témoin de fond et lire la plaque sur un luminomètre. L'induction relative de la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps dans les cultures de cellules transfectées ou infectées peut alors être calculée. Dans cette expérience, un anticorps monoclonal spécifique du stock a activé de manière robuste et modifié des cellules Jurkat exprimant le récepteur Fc gamma murin quatre d'environ 14 fois par rapport aux anticorps monoclonaux spécifiques de la tête et aux anticorps IgG témoins.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de mettre en place une expérience permettant d'évaluer la capacité de certains anticorps d'intérêt à activer l'immunité médiée par la région Fc.

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Immunologie et infection

Une méthode simple fente blot a été développé pour la quantification de l'hémagglutinine de la grippe virale et la neuraminidase utilisant des anticorps ciblant universelle leurs séquences les plus conservées identifiées par l'analyse bioinformatique. Cette approche innovatrice pourrait fournir une alternative utile pour la détermination quantitative de tous hémagglutinine et la neuraminidase virale.

Analyses quantitatives de tous influenza de type A hémagglutinines virales et les neuraminidases utilisant des anticorps Universal en simples essais slot blot

Cette méthode décrit l'utilisation de système d'imagerie infrarouge à base de colorants pour la détection du virus H1N1 dans broncho-alvéolaire (LBA) des souris infectées avec une sensibilité élevée. Cette méthodologie peut être effectuée dans un 96 - ou 384 puits de plaque, il faut &lt;volume de 10 ul de matériel d'essai et a le potentiel pour le dépistage simultané de plusieurs agents pathogènes.

Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

La vidéo présente un test d’inhibition de l’hémagglutination pour détecter les anticorps sériques dirigés contre des antigènes spécifiques. La confirmation de l’inhibition de l’hémagglutination dans le puits d’essai et de l’hémagglutination dans le puits témoin est obtenue par des motifs visuels distincts. Ce test joue un rôle crucial dans l’évaluation de la réponse immunitaire, l’efficacité des vaccins et l’étude des infections virales en virologie et en immunologie.

Le test d’inhibition de l’hémagglutination pour détecter les anticorps sériques dirigés contre un antigène cible

Cette vidéo présente un test mesurant l’activation des fonctions effectrices des lymphocytes T par les anticorps. L’ajout d’un anticorps monoclonal spécifique de l’hémagglutinine (HA) du virus de la grippe à des cellules de mammifères transfectées exprimant l’HA entraîne la formation de complexes immuns avec l’HA. Lors de l’introduction de lymphocytes T modifiés exprimant des récepteurs Fc et un rapporteur de luciférase, les lymphocytes T sont activés par les complexes anticorps-HA, et cette...

Mesure de l’activation des fonctions effectrices médiées par Fc par les anticorps HA

Cette vidéo présente un test mesurant les titres d’anticorps inhibiteurs de la neuraminidase grippale (NA) dans un échantillon de sérum. Un échantillon de sérum contenant des anticorps contre NA est ajouté à une plaque de micropuits recouverte de fétuine. Lors de l’ajout du virus, les anticorps empêchent le NA viral de fendre le fœtuin et d’exposer sa fraction galactose. Une lectine conjuguée à la peroxydase est ensuite ajoutée, qui se lie au galactose exposé. Le titre d’anticorps inhibiteurs...

Un test pour mesurer les titres d’anticorps d’inhibition de la neuraminidase de la grippe

À l’aide d’une stratégie de microréseau de glycanes imprimée, un test conventionnel sur plaque à 96 puits a été miniaturisé pour l’analyse de l’avidité de l’hémagglutinine du virus de la grippe A et de la spécificité des récepteurs contenant de l’acide sialique.

A miniaturisé Glycan Microarray Assay pour l&#39;évaluation Avidité et Spécificité du virus grippal A Hémagglutinines

Nous décrivons le dosage des lectines enzymatiques (ELLA) pour mesurer les titres d’anticorps inhibiteurs de la neuraminidase de la grippe (NA) dans les sérums. Le test utilise l’agglutinine d’arachide pour quantifier les résidus de galactose qui deviennent accessibles lorsque NA élimine l’acide sialique des plaques à 96 puits enrobées de fétuine.

Mesure de la grippe neuraminidase Inhibition Titres d&#39;anticorps par-enzymatique lectine Assay

Les protocoles présentés décrivent comment effectuer un test d’inhibition hémagglutination afin de quantifier les titres d’anticorps spécifiques à la grippe d’échantillons de sérum des destinataires de vaccin contre la grippe. Le premier dosage détermine la concentration optimale d’antigène viral par hémagglutination. Le deuxième essai quantifie les titres d’anticorps spécifiques à la grippe par l’inhibition de l’hémagglutination.

Un test d’Inhibition (HI) hémagglutination optimisé pour quantifier les titres d’anticorps spécifiques à la grippe

Virus de l’influenza (IAVs) sont des agents pathogènes respiratoires humains importants. Pour comprendre le pouvoir pathogène de IAVs et d’effectuer des essais précliniques de nouveau vaccin approches, modèles animaux imitant la physiologie humaine sont nécessaires. Nous décrivons ici les techniques pour évaluer l’IAV pathogenèse, humorale et l’efficacité du vaccin en utilisant un modèle de souris de l’infection.

Études de Virus influenza de type A dans un modèle murin d’Infection

Nous présentons un protocole pour l'utilisation d'un microarray protéique construit en imprimant des antigènes grippaux sur des lames enduites de nitrocellulose pour sonder simultanément le sérum pour plusieurs isotypes d'anticorps contre plus de 250 antigènes de différentes souches virales, permettant de mesurer l'étendue des anticorps sériques entre les sous-types de virus.

Utilisation d'un microréseau d'antigène de la grippe pour mesurer l'étendue des anticorps sériques à travers les sous-types de virus

Cet article décrit les protocoles d’évaluation de la réponse de Tfh et de GC B dans le modèle murin de l’infection par le virus de la grippe.

Évaluation des cellules d’aide folliculaire t et de la réponse du Centre germinal pendant l’infection virale de la grippe A chez la souris

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Une méthode pour évaluer les fonctions effectrices induite par le Fc induites par les anticorps spécifiques d’hémagglutinine de grippe

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