Une méthode générale pour la détection des Nitrosamide Formation du métabolisme In Vitro des Nitrosamines par Cytochrome P450s

L’objectif global de cette méthodologie est de déterminer si les cytochromes P450 peuvent oxyder de manière processive n nitrosamines en n nitosamides in vitro. Cette méthode profite au domaine de la toxicologie en évaluant si les nitosamines sont directement métabolisées en nitrosamides. Parce que les nitrosamides sont relativement stables dans l’ADN alkylate, ils pourraient jouer un rôle dans la cancérogenèse.

Le principal avantage de cette technique est l’utilisation d’un spectromètre de masse très sensible qui donne des limites de détection inférieures à celles précédemment atteintes pour des tests similaires de métabolisme des nitrosamines in vitro. Pour commencer cette procédure, placez dans un four une fiole à fond rond de 25 millilitres contenant une barre d’agitation magnétique. Sécher pendant 16 heures à 140 degrés Celsius.

Après cela, transférez le ballon dans une hotte et refroidissez-le sous un courant d’azote gazeux. Ajoutez 31,8 milligrammes de norcotinine, cinq millilitres d’anhydride acétique et un millilitre d’acide acétique dans le ballon et commencez à remuer. Transvasez le ballon dans un bain d’eau glacée.

Ajouter 33,3 milligrammes de nitrite de sodium. Continuez à remuer pendant 2,5 heures, puis versez la réaction dans 18 millilitres d’eau glacée pour éteindre la réaction. Transférez immédiatement la solution dans un entonnoir séparateur contenant 18 millilitres de DCM et extrayez la solution aqueuse.

Extrayez la couche aqueuse deux fois de plus, en utilisant 9 millilitres de DCM à chaque fois. Ensuite, séchez les matières organiques accumulées à plus de 100 milligrammes de sulfate de magnésium pendant deux minutes. Après le filtrage, utilisez un évaporateur rotatif pour concentrer la solution à 30 degrés Celsius afin d’obtenir une huile jaune brute.

Purifier le composé brut à l’aide de la chromatographie sur colonne, comme indiqué dans le protocole de texte. Après cela, dissolvez le composé pur dans un millilitre de chloroforme deutéré. À l’aide de la RMN, confirmez la structure et la molarité de la solution comme indiqué dans le protocole texte.

Conservez cette solution dans l’obscurité à une température comprise entre deux et huit degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Confirmez ensuite la masse parentale exacte et déterminez les masses ioniques produites de la solution NNC pure par perfusion directe sur un spectromètre de masse à haute résolution, comme indiqué dans le protocole texte. Pour commencer, retirez les réactifs nécessaires d’un congélateur à 80 degrés Celsius et décongelez-les sur de la glace.

Une fois décongelés, utilisez un tampon de réaction de 0,5 pour diluer les baculosomes dans les systèmes de régénération du NADPH 1-10 et 1-50 respectivement, dans un tube d’un millilitre. Ensuite, ajoutez trois microlitres de la solution mère de NADP dans un tube d’un millilitre contenant 97 microlitres d’un tampon de réaction de 0,5. Pour chaque incubation, préparez un tube d’un millilitre en ajoutant 40 microlitres d’une solution de NNN à quatre micromolaires faite avec un tampon de réaction.

Ajouter 50 microlitres de solution enzymatique contenant cinq picomoles de P450 2A6 dans chaque tube. Préincuber au bain-marie à 37 degrés pendant deux minutes. Ajoutez ensuite 10 microlitres de solution de NADP+ dilué dans chaque tube.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant une à 30 minutes. Après cela, ajoutez d’abord 10 microlitres de sulfate de zinc normal 3.0, puis ajoutez 10 microlitres d’hydroxyde de baryum normal 3.0 pour éteindre la réaction. Vortex la solution pour former un précipité blanc.

Ensuite, centrifugez à huit mille G pendant quatre minutes. Recueillir immédiatement le surnageant et analyser deux microlitres par chromatographie liquide, spectrométrie de masse en tandem haute résolution à ionisation nanoélectronébulaire positive. Dans cette étude, la norcotinine est nitrosée en NNC proprement et à haut rendement, ce qui produit une norme à utiliser dans l’expérience in vitro.

Le succès de la réaction est vérifié par une analyse spectroscopique, y compris la spectrométrie de masse en tandem à haute résolution, qui a confirmé que la masse du parent se situe à moins de cinq parties par million de la valeur théorique. La fragmentation du NNC par spectrométrie de masse en tandem est ensuite utilisée pour déterminer les masses d’ions produits les plus abondantes. Comme on peut le voir, les deux ions produits les plus abondants sont 134 et 162, avec une détection de masse précise à cinq décimales.

Le NNC synthétisé est ensuite utilisé comme étalon pour le test métabolique in vitro P450. Dans les conditions utilisées, le NNC synthétique élue au bout d’environ 17,5 minutes, avec des pics bien résolus dans les canaux ioniques et ioniques produits du parent. Conformément au témoin positif, la formation de NNC est observée dans les incubations d’une minute, cinq minutes et 10 minutes.

Si elle est correctement effectuée, l’analyse inspectroscopique de synthèse de nitrosamide peut être effectuée en environ six heures. De même, le test in vitro avec plusieurs incubations ne devrait pas prendre plus de huit heures. Les implications de cette technique s’étendent à l’évaluation du risque de cancers liés au tabac, car la mesure des biomarqueurs liés aux nitrosamides pourrait être informative sur l’activation individuelle des nitrosamines.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de traiter rapidement les incubations d’enzymes. Les nitrosamides s’hydrolysent dans ces conditions et ne devraient pas attendre longtemps avant l’analyse des spécifications de masse. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des étalons de nitrosamide et d’évaluer s’ils sont formés in vitro par le système approprié de nitrosamine cytochrome P450.

N’oubliez pas que travailler avec des NNN, des NNC ou des cancérogènes apparentés peut être dangereux. Ces composés doivent toujours être manipulés dans une hotte tout en portant une blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité et des gants. De plus, tous les déchets cancérigènes doivent être correctement stockés et étiquetés.