Cellule entière courants induits par l’Application de la bouffée de GABA dans des tranches de cerveau

L’objectif global de cette technique de puff est d’effectuer l’administration pharmacologique dans l’enregistrement d’un patch-clamp de cellules entières. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’électrophysiologie, telles que l’administration pharmacologique. Le principal avantage de cette technique est que la concentration de médicament autour du site d’enregistrement augmente rapidement, empêchant ainsi la désensibilisation des récepteurs membranaires.

En général, les personnes novices dans cette méthode auront du mal car la préparation de la coupe aiguë du cortex préfrontal et la position de la micropipette à bouffée sont relativement difficiles. Pour commencer cette procédure, écrasez la solution de coupe congelée pour obtenir une gadoue. Gardez la solution de gadoue sur de la glace et faites-la bouillonner avec 95 % d’oxygène, 5 % de dioxyde de carbone.

Ensuite, placez la tête disséquée dans un bécher rempli de solution de coupe glacée et retirez-la après quelques secondes. Coupez le crâne le long de la ligne médiane dans une direction caudale-rostrale avec des ciseaux fins et retirez les parties latérales du crâne. Ensuite, retirez le cerveau à l’aide d’une spatule fine et déposez-le dans la solution de coupe glacée.

Ensuite, placez le cerveau sur le couvercle d’une boîte de Pétri de neuf centimètres remplie de glace. Rincez le cerveau avec une solution de coupe glacée. Ensuite, coupez le cervelet et le bulbe olfactif avec une lame de rasoir.

Ensuite, appliquez de la colle cyanoacrylate sur le porte-échantillon Vibratome. Placez délicatement le bloc cérébral sur la goutte de colle, côté rostral vers le haut, et plongez-le immédiatement dans la solution de découpe glacée. Réglez le porte-lame à un angle de 15 degrés par rapport au plan horizontal.

Sectionnez les tissus cérébraux en tranches coronales de 350 microns. Ensuite, transférez les lames dans la chambre de récupération remplie d’ACSF et incubez-les pendant une heure avec un bouillonnement constant de 95 % d’oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone. Dans notre expérience, la préparation de la coupe aiguë du cortex préfrontal est également essentielle dans la procédure.

Une tranche de cerveau saine signifie des neurones actifs qui peuvent être étroitement patchés. Dans cette procédure, fabriquez des micropipettes en verre borosilicaté à utiliser comme électrodes d’enregistrement ou micropipettes à bouffée. Pour l’enregistrement des électrodes, les résistances de pointe sont de l’ordre de quatre à six mégaohms, tandis que les micropipettes à soufflage ont des diamètres d’extrémité de deux à cinq micromètres.

Ajoutez un bloqueur de canaux sodion à l’ACSF pour bloquer les potentiels de canal sodion rapide et donc d’action, et maintenez un débit constant de cette solution de deux à trois millilitres par minute dans la chambre d’enregistrement. Bullez l’ACSF avec 95 % d’oxygène, 5 % de dioxyde de carbone en permanence pour assurer la viabilité des tranches. Transférez une tranche de cerveau dans la chambre d’enregistrement, à l’aide d’une pipette Pasteur dont la pointe fine est taillée pour s’adapter à la taille de la tranche.

Ensuite, placez une ancre en forme de tranche de platine au-dessus de la tranche pour la maintenir sur la plate-forme. Après cela, remplissez les micropipettes d’enregistrement avec la solution interne et remplissez les micropipettes avec du GABA à 10 micromolaires, 50 micromolaires et 100 micromolaires, ou ACSF comme contrôle du véhicule. Pour éviter le blocage par des débris, appliquez une légère pression positive à l’aide d’une seringue d’un millilitre avant d’immerger l’électrode d’enregistrement dans l’ACSF.

Sous un microscope, positionnez l’électrode d’enregistrement et gonflez la micropipette de manière à ce que les pointes apparaissent au centre du moniteur. Ensuite, identifiez un neurone cible. Ajustez la mise au point du microscope tout en abaissant progressivement la micropipette et placez-la au-dessus du neurone enregistreur à un angle de 45 degrés.

Maintenez la distance entre l’extrémité de la micropipette et le neurone cible dans la plage de 20 à 40 micromètres. Approchez lentement et prudemment le neurone avec l’électrode d’enregistrement, puis relâchez la pression positive. Appliquez une aspiration faible et brève à travers le tube relié au porte-électrode pour créer un joint gigaohm.

Maintenez la tension à zéro millivolts. Après la formation du joint gigaohm, compensez la capacité rapide et lente manuellement ou automatiquement. Ensuite, appliquez une aspiration brève et forte à travers le tube pour passer en mode cellule entière.

Par la suite, enregistrez les courants IPSC évoqués en mode pince de tension. Administrez des bouffées GABA simples ou appariées à travers la micropipette à bouffées contrôlée par un générateur de pas de tension Master-8. Modifiez la durée de la bouffée pour obtenir les meilleurs résultats de courants IPSC évoqués, et mesurez les courants IPSC évoqués dans le modèle de dépression induite par le LPS.

On voit ici l’échantillon d’IPSC induits par 10, 50 et 100 GABA micromolaires. Et voici les courbes de réponse de la durée de bouffée. Les courants répétitifs évoqués par le GABA à 50 bouffées micromolaires à des intervalles d’une, deux ou trois secondes sont illustrés ici.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’obtenir des tranches de cerveau saines. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’administration pharmacologique pour explorer l’effet du médicament en électrophysiologie.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de procéder à l’administration pharmacologique dans l’enregistrement d’un patch-clamp sur cellule entière. N’oubliez pas que travailler avec TTX peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que le port de gants, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.