Name: Visualisation des pièges extracellulaires de Macrophage à l’aide de la microscopie confocale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Apprenez à visualiser les pièges extracellulaires de macrophage par microscopie confocale. Cette méthode permet d'étudier les réponses inflammatoires et immunitaires in vitro et in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été financé par des subventions de la Monash University, National Health et Medical Research Council et le poumon de Monash et Institut sommeil. Les auteurs tiennent à remercier le personnel de l’immunologie clinique santé de Monash, Judy Callaghan, Alex Fulcher, Kirstin Elgass et Camden Lo de Monash Micro Imaging (MMI) de l’aide avec l’imagerie de la microscopie confocale, et les auteurs reconnaissent les installations MMI de l’Université Monash. Les auteurs remercient les installations et une assistance scientifique et technique de la plate-forme de l’histologie de Monash.

ce protocole suit approuvés dans des expériences : les humains (1) par l’éthique Comité de Monash Centre médical et les animaux (2) par le Comité d’éthique de l’Université de Melbourne.
 1. Lavage broncho-alvéolaire (LBA) Macrophages <ol><li>BAL d’usage pour obtenir les macrophages pulmonaires en : (1) homme soumet par bronchoscopie 6 et la souris (2) à l’aide d’aspiration trachéale intra 13 . 
	NOTE : Acquisition des macrophages entraîne généralement une activation de ces cellules. Les macrophages proviennent de patients qui nécessitent une bronchoscopie pour enquêter sur un éventuel problème médical et pas tous les sujets peuvent convenir pour l’analyse des METs (cela devra être déterminé pour chaque projet).
	<ol><li>Prendre la solution de BAL et la centrifuger (500 x g pendant 10 min) pour former une boulette, laver deux fois avec le milieu de culture (Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) avec 5 % de sérum de veau foetal et 1 % L-glutamine) à température ambiante et puis diluer dans 4 mL de medi de culture des cellules Umm.</li>
		<li>Si nécessaire, demande officielle numération différentielle ; la plupart des cellules (généralement &#62; 80 %) seront des macrophages 6. 
		NOTE : Ceci sera généralement interprété par un service clinique histologie l’aspect morphologique des types différents de cellules 6.</li>
		<li>Effectue une cellule viable macrophage compte sur la solution de BAL utilisant le bleu Trypan exclusion et un hémocytomètre. 
		NOTE : Solution de BAL est obtenue chez l’homme et de la souris comme indiqué à l’étape 1.1.</li>
		<li>Ajouter 1-4 x 10 5 macrophages aux plaques 24 puits sur lamelles couvre-objet en 500 µL de milieu de culture par puits et laisser une nuit à 37 ° C ; les cellules respectera les lamelles couvre-objet. Pour les échantillons humains, ajouter des antibiotiques (par exemple, la pénicilline et la streptomycine, 10 4 U/mL) pour prévenir la contamination bactérienne.</li>
	</ol></li></ol> 2. Immunofluorescence Labeling/microscopie des Macrophages BAL Remarque : les cellules sont respectées sur les lamelles comme indiqué plus haut.
<ol><li>Enlever le milieu de culture et laver les cellules avec en solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Difficulté des cellules dans le fixateur de paraformaldéhyde/periodate/lysine (PLP) de 2 % pendant 10 min.</li>
	<li>Laver les cellules brièvement dans du PBS et puis permeabilize à 0,2 % Tween 20 dans du PBS pendant 20 min.</li>
	<li>Cellules de bloc de sérums de poulet 10 % à 5 % sérum d’albumine bovine (BSA) dilué dans du PBS pendant 30 min.</li>
	Anticorps <li>incuber avec contrôle primaire et isotype pendant 1 h à température ambiante à des concentrations de 1/100 (plus de détails spécifiques sont répertoriés dans la Table des matières) à 37 ° C. 
	Remarque : Pour les échantillons de BAL, un marqueur spécifique des macrophages est habituellement pas nécessaire.</li>
	<li>Après l’ajout d’anticorps primaires, laver les cellules dans du PBS et incuber encore avec l’anticorps secondaires correspondants pendant 40 min à température ambiante.</li>
	<li>Laver les sections dans PBS et monter avec milieu de montage à base DAPI de visualisation en utilisant un microscope confocal (comme mentionné ci-dessus) au laser les excitations 405, 488, 561 et 647 nm et un 40 X, 1,0 NA huile objectif.</li>
</ol> 3. Des échantillons de tissus pulmonaires Remarque : pour les études in vivo des tissus pulmonaires, étudier les échantillons après l’exposition pertinente (par exemple, tel que décrit par O &#39; Sullivan et al. 7). l’exposition qui est le plus pertinente pour cette expérience sont les micro-organismes infectieux, en particulier les bactéries. Les souches de souris qui pourraient être utilisés pour cette méthode sont les souris C57BL/6 ou BALB/c, 10-12 semaines, poids 25 à 30 g et mâle.
<ol><li>Euthanasier souris, via une injection intrapéritonéale de kétamine (400 mg/kg) et de xylazine (40 mg/kg). Ouvrir la cavité thoracique et exposer les poumons et le cœur à l’aide de ciseaux et pinces chirurgicales.
	<ol><li>En infusion chaude PBS à l’aide d’une aiguille de calibre 21 dans le ventricule droit de laver le sang des vaisseaux pour 30 s, puis laisser infuser 10 mL de fixateur PLP 2 % pendant 30 s (dans le ventricule droit).</li>
		<li>Utilisez chaud PBS (42 ° C) pour lavage de la cavité thoracique ouverte. Intubation de la trachée avec une aiguille de calibre 21 et un bout de tube de 0,8 mm coupé à la taille et à injecter 800 µL de préchauffé (à 42 ° C), à bas point de fusion point solution à 3 % d’agarose.</li>
		<li>Tie au large de la trachée avec de la soie tressée (USP 4.0). Placez le fil autour de la trachée, juste en dessous du point d’insertion de la canule et fixez-le via un nœud simple. Pour solidifier l’agarose, administrer des PBS glacée autour des poumons. Retirer les poumons et le cœur comme une pâté de maisons de la cavité thoracique à l’aide de ciseaux et dissection non tranchante. Retirez chaque poumon individuellement et puis corrigez-les pendant 16 h 2 % PLP ou formol à 4 ° C.</li>
		<li>Stocker les échantillons dans du PBS à 4 ° C jusqu’au tissu de sectionnement. Ces méthodes d’obtention des tissus pulmonaires ont été décrites précédemment 13.</li>
	</ol></li> <li>Pour préparer le tissu pulmonaire échantillons utilisent les étapes suivantes.
	<ol><li>Tissus de tissus (réséqués à l’étape 3.1) fix pulmonaires dans 10 % de formol tamponné naturelles pendant 24 h à température ambiante. Transfert à 75 % d’éthanol et mettre dans un robot de tissu sur un cycle de 12 h, (2,5 h à 75 % EtOH, 3 h en EtOH absolue, 3,5 h à solvant 3 b et pendant 3 h à la paraffine).</li>
		<li>Embed en paraffine standard pour créer des blocs (FFIP) fixés au formol, paraffine, qui sont stockés à température ambiante. 
		Remarque : À ce stade, il est généralement commode couper les sections de poumon pour lames standards.</li>
		<li>Couper les sections de poumon FFIP à 4-5 µm d’épaisseur à l’aide d’un microtome et monter sur facturé, enduits diapositives comme décrits par O &#39; Sullivan et al. 7</li> <li>montage de diapositives, mettre 3 gouttes de milieu de montage sur les lamelles de 60 x 24 mm (taille 1.5), inverser la diapositive sur la lamelle couvre-objet et faire sortir l’excès du milieu. Hermétiquement sceller avec du vernis à ongles et conserver à température ambiante.</li>
	</ol></li></ol> 4. Préparation/microscopie des échantillons de tissu de poumon <ol><li>à la cire, réhydrater et prétraitement de l’échantillon de tissu de poumon FFIP avec la solution de l’antigène.
	<ol><li>Anhydre le FFIP glisse pendant 60 min à 60 ° C. Mettez ensuite les lames dans une solution de xylène pour 30 min et le transfert de solution d’éthanol 70 % pendant 5 min à température ambiante. Rincer à l’eau du robinet.</li>
		<li>Place dans une pellicule plastique résistant à la chaleur et sous réserve de la recherche d’HIER-antigène dans un autocuiseur pendant 10 min à 10 m/mol/L Tris, 1 mmol/EDTA pH 9,0. Cool pendant 20 min. Laver deux fois dans l’eau du robinet pendant 5 min sur un rocker, puis une fois avec du PBS sur base berçante.</li>
		<li>Bloc avec du sérum de poulet de 10 % à 5 % BSA/PBS pendant 30 min à température ambiante.</li>
	</ol></li> <li>Tacher le tissu.
	<ol><li>Pour définir les METs dans les macrophages, ajouter des anticorps primaires (MMP-9, H3Cit et F4/80) à 1 % BSA/PBS pendant 16 h à 4 ° C à la dilution de 1/100 (des détails précis sur les quantités d’anticorps sont répertoriés dans la Table des matières). Laver deux fois avec du PBS pendant 5 min sur une base berçante.</li>
		Anticorps <li>Achieve détection par fluorescence par incubation avec secondaires correspondant à 1 % BSA/PBS pendant 40 min à température ambiante. Les anticorps sont : anti-souris poulet (1) 488 (vert), anti-chèvre poulet (2) 594 (rouge) et (3) âne anti-souris 647 (rouge sombre).</li>
		<li>Laver les sections dans du PBS et monter avec DAPI-contenant du milieu de montage pour la coloration de la chromatine.</li>
	</ol></li> <li>Obtenir les images fluorescentes utilisant un laser confocal à balayage tête attachée à un microscope inversé.
	Lasers nm <ol><li>Excite la préparation avec la 405, 488, 561 et 647. Capturer des images de 512 x 512 pixels seul plan en cliquant sur la ligne séquentielle, nivellement button (2 ligne moyenne) à l’aide de 20 X 0,1 air de NA et NA 40 X 1.0 huile objectifs.</li>
		<li>Obtenir au moins dix champs de vue par la section d’analyse et de données pour chacun des résultats (c.-à-d. 10 haute puissance champs de vision (HFOV) pour le contrôle, 10 pour l’échantillon stimulée, etc., pour chaque souris). 
		Remarque : Pour obtenir un échantillon représentatif de l’ensemble du domaine, un système de matrice peut être utilisé dans laquelle le domaine est divisé en différentes sections et pour chaque échantillon différent la même matrice est utilisée pour sélectionner des champs de vue (par exemple, le champ peut être divisé en 9 sections et sur le centre et les 4 coins, deux VOHF sont prélevés).</li>
	</ol></li></ol> 5. En trois dimensions (3d) imagerie de METs Remarque : METs étant 3D structures, en prenant plusieurs z-pile des images, qui sont reconstituées, peuvent donner des informations précieuses.
<ol><li>Section les spécimens de poumon de blocs de paraffine, à 200 µm en utilisant un vibratome à une amplitude fixée à 1,8 mm et la vitesse de 0,1 à 0,5 mm/s.</li>
	<li>Bloc de tissu pulmonaire avec 20 % du sérum respectif (10 % de sérum de veau foetal et le sérum de poulet 10 %) et ensuite permeabilize dans du PBS complétée et 3,75 % Triton X 100 de 7 h à température ambiante sous agitation modérée.</li>
	<li>Tacher les sections pendant 16 h à 4 ° C avec les anticorps primaires pertinentes (MMP-9, H3Cit et F4/80) dans 200 µL de volume dans des tubes de microcentrifuge (concentrations d’anticorps sont répertoriées dans la Table des matières).</li>
	<li>Laver les sections dans du PBS, 3 fois pendant 10 min avant l’incubation avec l’anticorps secondaires pertinents à température ambiante pendant 1 h.</li>
	<li>Tacher les sections de poumon pour DAPI (1:5 000) dans la solution pendant 20 min, avant d’ajouter les lamelles au microscope slides dans du PBS.</li>
	<li>Obtenir des images de fluorescence à l’aide d’un microscope confocal inversé (40 x 1.3 NA) équipé de 405 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm et 635 nm lasers.</li>
	<li>Enregistrer 3D z-piles de 0,54 µm d’épaisseur avec z-découpe optimale pour l’objectif 40 x 1,3 à huile NA. 
	Remarque : Le logiciel utilisé variera selon le microscope individuel. Un exemple de comment le logiciel peut être utilisé pour un microscope est fourni en supplémentaire 1 fichier.</li>
</ol> 6. Analyse d’image Remarque : l’analyse des échantillons nécessite l’utilisation d’un logiciel d’analyse d’imagerie spécifique et exemples sont répertoriés dans la Table des matières. Alors que le programme spécifique utilisé dépendra de l’analyse des résultats, les points énumérés ci-dessous sont importants.
<ol><li>Analyse des BAL échantillons <ol><li>définir le nombre de macrophages en sélectionnant la couche bleue pour DAPI et en assignant une taille minimale pour les cellules (par exemple, &#62; 18 µm de diamètre). Grâce au logiciel pertinent, mesurer le nombre de macrophages par domaine.</li>
		<li>Compter le nombre de cellules qui présentent les caractéristiques d’une EMU par la présence de chromatine extracellulaire détectée par DAPI avec co-expression d’autres marqueurs (par exemple, MMP12, PAD2 et H3Cit). 
		Remarque : Le nombre de marqueurs qui peuvent être analysées dépend du nombre de lasers disponibles, mais idéalement en plus DAPI, au moins deux autres marqueurs doivent être inclus. Les autres produits moins les paramètres spécifiques à l’expression de la MET (p. ex., nombre de cellules avec la chromatine extracellulaire et un noyau élargi) peut être utilisé.</li>
		<li>Pour comparer l’expression MET en BAL échantillons (entre le contrôle, fumée et groupes de fumée/DNase traité), analysent un minimum de 100 macrophages BAL par exemple.</li>
		<li>Pour mesurer les anticorps secondaire et isotype contrôler les niveaux de fluorescence ; mesurer un minimum de 100 cellules dans chaque échantillon pour leur fluorescence. Mesurer le niveau moyen de la fluorescence de fond pour chaque marqueur (par exemple, H3Cit) à l’aide de logiciels standard.</li>
		<li>Pour définir l’expression MET, compter les cellules avec le phénotype typique (p. ex., chromatine extracellulaire avec la co-expression de H3Cit et MMP9) et pour chaque MET, mesurer le degré de fluorescence des marqueurs (par exemple, H3Cit et MMP9). Exclure les cellules produisant les METs si leur coloration n’était pas au-dessus du contrôle arrière-plan et isotype.</li>
		<li>Pour des échantillons humains de BAL, analyser un minimum de 100 cellules pour chaque échantillon pour le pourcentage des macrophages qui rendent les METs. Pour les échantillons murines, comme les cellules sont plus petites et les METs sont plus difficiles à définir, analyser un grand nombre de cellules pour chaque échantillon (par exemple, 200 macrophages).</li>
	</ol></li> <li>L’analyse des échantillons de tissus pulmonaires <ol><li>pour déterminer la présence de METs dans les tissus pulmonaires, utilisez le marqueur spécifique de macrophages par exemple F4/80.</li>
		<li>Définir la présence des METs dans les tissus pulmonaires à l’aide de la co-localisation de F4/80 dans les cellules qui expriment la chromatine extracellulaire avec d’autres paramètres figurant à l’article 6.1.</li>
		<li>Déterminer les niveaux de fluorescence de fond dans les échantillons avec l’anticorps secondaire et les contrôles de l’isotype. Exclure les METs d’analyse qui ne sont pas au-dessus de fond.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+is+immunity+the+second+function+of+chromatin%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?</a> J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).</li>
<li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).</li>
<li>Cheng, O. Z., Palaniyar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NET+balancing%3A+a+problem+in+inflammatory+lung+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+immunol%22%5BJournal%5D)">NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases.</a> Frontiers immunol. 4, 1(2013).</li>
<li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+traps+and+macrophages%3A+new+roles+for+the+versatile+phagocyte%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).</li>
<li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontypeable+Haemophilus+influenzae+induces+sustained+lung+oxidative+stress+and+protease+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression.</a> PloS one. 10 (3), e0120371(2015).</li>
<li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+%28ANCA%29-associated+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).</li>
<li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).</li>
<li>Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+PAD4+in+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation of PAD4 in NET formation.</a> Front Immunol. 3, 360(2012).</li>
<li>Lewis, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+PAD4+activity+is+sufficient+to+disrupt+mouse+and+human+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation.</a> Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).</li>
<li>Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Targeting+of+the+IL-6+Trans-Signaling%2FMechanistic+Target+of+Rapamycin+Complex+1+Axis+in+Pulmonary+Emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema.</a> Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).</li>
<li>Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+%26+microbe%22%5BJournal%5D)">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).</li>
<li>Wong, K. W., Jacobs, W. R. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+exploits+human+interferon+gamma+to+stimulate+macrophage+extracellular+trap+formation+and+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis.</a> J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucune divulgation à faire en ce qui concerne ce travail.

La méthode décrite dans la présente analyse est fondée sur celle utilisée pour définir la présence de filets14. Les macrophages sont de loin le type de cellule dominante dans les échantillons de BAL et cette méthode de collecte est particulièrement adaptée pour l’étude des METs. Si les globules rouges sont présents dans le BAL, ces cellules doivent être lysées par à l’aide de chlorure d’ammonium. La procédure de BAL généralement pour activer les macrophages et par conséquent, il est prévu qu’il y ...

Les pièges extracellulaires neutrophiles (filets), ont été d’abord décrit par Brinkmann et al. 1 ils sont principalement produits en réponse à l’infection (en particulier aux bactéries) et ont un rôle important dans l’hôte défense1,2. Ils ont également été décrits pour se produire en réponse aux maladies non infectieuses, y compris vascularite et lupus érythémateux disséminé (LED) ; et aux mitogènes phorbol 12-myrisate 13-acétate (PMA)2,3. Il a été reconnu récemment que les autres types de cellules peuvent également produire pièges extracellulaires, tels que les macrophages. Pièges extracellulaires de macrophages (METs) ne sont pas encore une entité bien définie dans la littérature4,5. Nous avons récemment établi des méthodes pour détecter la présence de METs aussi bien in vitro et in vivo,6,7. Dans cet article, on décrira la mesure des METs à l’aide de la microscopie confocale.
Caractéristiques principales de NETosis qui la distinguent des autres voies cellulaires (par exemple l’apoptose8) sont l’extrusion de la chromatine en collaboration avec : (1) la citrullination d’histones (H3Cit)9, (2) la co-expression de protéases granule10 et (3) participation des peptidyl arginine déiminase (PAD) 411,12. Macrophages expriment aussi H3Cit, protéases de granule et PAD, et ces caractéristiques peuvent être utilisés pour définir la présence des METs.
METs peuvent avoir un rôle particulièrement important dans le poumon, comme les macrophages sont la cellule dominante présente dans les alvéoles et les voies respiratoires du poumon et a le rôle initial dans la direction de la réponse immunitaire cellulaire à l’infection/inflammation. En outre, même si une grande partie du poumon est vide (par exemple, dans les alvéoles), les METs sont potentiellement en mesure d’étendre dans l’espace disponible, contrairement aux organes solides.
La méthode la plus utilisée pour définir la présence de filets est par microscopie confocale. Il n’a pas encore un moyen clairement défini pour mesurer les METs. La technique de mesure des filets a été adaptée pour mesurer la présence des METs dans le présent protocole. Les principales exigences pour cette méthode sont les accès à la microscopie confocale et logiciels d’imagerie appropriées pour l’analyse.

<table><tbody><tr><td>Échantillons humains : Anticorps primaires</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Rabbit anti-human MMP12</td><td>Novus Biological</td><td>NB110-57214</td><td>Concentration de 1:100 non quantifiable</td></tr><tr><td>Souris anti-humaine MMP9</td><td>Novus Biological</td><td>AB119906</td><td>1:200 ascite, pas de concentration donné</td></tr><tr><td>Lapin anti-humain PADI2/PAD2</td><td>Abcam</td><td>AB16478</td><td>7 ug/ml</td></tr><tr><td>Souris anti-humain PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10,1 ug/ml</td></tr><tr><td>Mouton anti-humain NE</td><td>LifeSpan Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug/ml</td></tr><tr><td>Nom</strong</td><td>>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires</td></tr><tr><td>Échantillons de souris : Anticorps primaires</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris MMP9</td><td>Abcam</td><td>AF909</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Lapin anti-souris H3Cit (Citrulline R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Rat anti-souris F4/80</td><td>Interne (hybridome)</td><td>Interne</td><td>20 ug/ml</td></tr><tr><td>Mouton anti-humain Anti-HNE /NE</td><td>Sapphire Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug/ml</td></tr><tr><td>Souris anti-humaine & timide ; &timide ; &timide ; &timide ; PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10,1 ug/ml</td></tr><tr><td>Super-frost plus lames</td><td>Menzel</td><td>S41104A</td><td></td></tr><tr><td>Dapi-prolong gold</td><td>Sondes moléculaires</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9434</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td> Entreprise </td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Anticorps secondaires</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-rabbit AF 488/</td><td>Life technologies</td><td>A-21441</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-rabbit AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-21442</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-goat AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-21468</td><td></td></tr><tr><td>Poulet anti-souris AF488</td><td>Technologies de la vie</td><td>A-21200</td><td></td></tr><tr><td>Âne anti-mouton AF 594</td><td>Techniques de la vie</td><td>A-11018</td><td></td></tr><tr><td>Poulet anti-souris AF 647</td><td>Technologies de la vie</td><td>A-21463</td><td></td></tr><tr><td>Âne anti-mouton AF 594</td><td>Technologies de la vie</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>Contrôle des</td><td></td><td></td> isotypes<td></td></tr><tr><td>Lapin IgG</td><td>Dans la maison</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lapin IgG</td><td>Dans la maison</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Souris IgG1</td><td>BD Bioscience</td><td>550878</td><td></td></tr><tr><td>Lapin IgG</td><td>Dans la maison</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Souris IgG2a</td><td>BioLegend</td><td>400201</td><td></td></tr><tr><td>Mouton IgG</td><td>Dans la maison</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software Programs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pour une intensité moyenne des fluorphores, une application bureautique standard comme Microsoft Excel peut être utilisée</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Microscopes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 Microscope confocal à balayage</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV1200</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>Catalog Number</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Sources tissulaires</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human BAL provenant de la salle de bronchoscopie du Monash Medical Centre</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Échantillons de BAL de souris et de tissus pulmonaires du Département de pharmacologie de l’Université de Melbourne.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>r8758</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Autres réactifs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sudan black</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199664</td><td></td></tr><tr><td>fixateur de paraformaldéhyde/periodate/lysine (PLP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27387</td><td></td></tr><tr><td>Xylène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2753</td><td></td></tr><tr><td>Formol naturel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42904</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576</td><td></td></tr><tr><td>Solvant 3B</td><td>Hi-Chem</td><td>2026</td><td></td></tr><tr><td>Couvre-objectifs 12 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1815</td><td></td></tr><tr><td>Couvre-carreaux 60 x 24 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6875</td><td></td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Commentaires</td></tr><tr><td>Mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>c57 noir 6</td><td>Plateforme de recherche animale Monash (MARP)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/c</td><td>MARP</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation des pièges extracellulaires de macrophage à l’aide de la microscopie confocale

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Une méthode primaire utilisée pour définir la présence de pièges extracellulaires neutrophiles (filets) est la microscopie confocale. Nous avons modifié les méthodes de microscopie confocale établies afin de visualiser les pièges extracellulaires de macrophages (METs). Ces pièges extracellulaires sont définis par la présence de la chromatine extracellulaire avec co-expression d’autres composants tels que les protéases de granule et les histones citrullinés peptidyl arginase déiminase (PAD). L’expression des METs est généralement mesurée après exposition à un stimulus et par rapport aux échantillons non stimulés. Des échantillons sont également inclus pour le contrôle de fond et isotype. Les cellules sont analysées à l’aide de logiciels d’analyse des images bien définies. Microscopie confocale peut être utilisée pour définir la présence de METs in vitro et in vivo dans les tissus pulmonaires.

METs peuvent visualiser à partir d’échantillons de BAL, dans les tissus pulmonaires et dans les sections de poumon plus épaisses avec des images 3D. Un exemple de METs visualisées dans un échantillon de BAL est illustré à la Figure 1. La morphologie des METs variera selon leur stade de maturation. La première caractéristique décelable au microscope est le mouvement du noyau jusqu’au bord de la cellule. Elle est suivie d’une chromatine extracellulaire avec aut...

Macrophage pièges extracellulaires sont une entité nouvellement décrite. Cet article se concentre sur les méthodes de microscopie confocale et comment elles sont visualisées in vitro et in vivo des échantillons pulmonaires.

Visualisation des pièges extracellulaires de Macrophage à l’aide de la microscopie confocale

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

L’objectif global de cette méthode est de démontrer comment les pièges extracellulaires des macrophages peuvent être visualisés et étudiés à l’aide de la microscopie confocale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’inflammation, telles que les réponses à l’infection et à d’autres stimuli immunitaires. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une modification d’une méthode bien établie qui a été utilisée pour étudier les pièges extracellulaires des neutrophiles.Roleen Sharma fera la démonstration de cette procédure. Après avoir obtenu des macrophages pulmonaires d’humains et de souris par lavage broncho-alvéolaire, ou BAL, selon le protocole textuel, utilisez du bleu de trypan et un hémocytomètre pour effectuer une numération cellulaire viable sur la solution BAL. Pipeter une à quatre fois 10 à 10 macrophages dans 500 microlitres de milieu de culture sur des lamelles de couverture dans les puits de plaques à 24 puits, puis incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour qu’elles adhèrent.Retirez le milieu de culture et utilisez du PBS pour laver les cellules une fois. Ajoutez ensuite 2 % de paraformaldéhyde-periodate-lysine, ou fixateur PLP, et incubez les échantillons pendant 10 minutes. Après avoir utilisé le PBS pour laver brièvement les cellules, ajoutez 0,2 % de SEIZE 20 dans du PBS et incubez les cellules pendant 20 minutes.Ensuite, pour bloquer les cellules, ajoutez 10 % de sérum de poulet dans 5 % BSA, dilué dans du PBS et incubez les échantillons à température ambiante pendant 30 minutes. Remplacez ensuite la solution en bloc par une concentration de 1 à 100 d’anticorps primaires et de contrôle isotopique et incubez les cellules à température ambiante pendant une heure. Après l’incubation, utilisez du PBS pour laver les cellules avant d’ajouter les anticorps secondaires correspondants.Ensuite, incubez les échantillons pendant 40 minutes à température ambiante. Après avoir lavé les cellules dans du PBS, montez les échantillons avec un support de montage à base de DAPI, puis visualisez les échantillons à l’aide d’un microscope confocal. Pour prétraiter les échantillons FFPE avec une solution de récupération d’antigène, séchez les lames au four à 60 degrés Celsius pendant 60 minutes.Transférez ensuite les lames dans une solution de xylène pendant 30 minutes avant de transférer les échantillons à 70 % d’éthanol à température ambiante pendant cinq minutes. Après avoir utilisé de l’eau du robinet pour rincer les lames, placez-les dans une pellicule plastique résistante à la chaleur et soumettez-les à une récupération d’antigène plus élevée en les plaçant dans un autocuiseur à Tris-EDTA pH 9,0 pendant 10 minutes. Refroidissez les échantillons pendant 20 minutes et transférez-les dans l’eau du robinet.Ensuite, placez-les sur une bascule pendant cinq minutes. Répétez le lavage à l’eau du robinet, puis lavez les diapositives une fois dans PBS sur la bascule. Pour bloquer les échantillons, ajoutez 10 % de sérum de poulet dans 5 % de BSA PBS et incubez-les à température ambiante pendant 30 minutes.Ensuite, pour définir les pièges extracellulaires des macrophages, ou MET dans les macrophages, ajoutez une dilution de un à 100 d’anticorps primaires dans 1 % de BSA PBS et incubez les lames à quatre degrés Celsius pendant 16 heures. Utilisez PBS pour laver les échantillons deux fois sur une bascule pendant cinq minutes chacune. Ajoutez les anticorps secondaires fluorescents correspondants dans 1 % de BSA PBS et incubez les lames à température ambiante pendant 40 minutes.Après les lavages PBS, utilisez un milieu de montage contenant du DAPI pour colorer la chromatine et monter les échantillons. À l’aide d’une tête de balayage laser confocale fixée à un microscope inversé, capturez des images fluorescentes à l’aide d’objectifs à air 20X 0,1 NA et 40X 1,0 NA à huile. Capturez des images à plan unique de 512 x 512 pixels en cliquant sur le bouton de nivellement séquentiel de ligne.Obtenez au moins 10 champs de vision par section pour l’analyse et des données pour chaque résultat. Pour colorer les sections dans les tubes de microcentrifugation, ajoutez les anticorps primaires pertinents dans des volumes de 200 microlitres et incubez les échantillons à quatre degrés Celsius pendant 16 heures. Lavez les sections dans du PBS trois fois pendant 10 minutes avant d’ajouter les anticorps secondaires appropriés et d’incuber les échantillons à température ambiante pendant une heure.Utilisez le DAPI pour colorer les sections pulmonaires en solution et incuber les échantillons pendant 20 minutes avant d’ajouter des lamelles de recouvrement aux coupes sur les lames de microscope dans le PBS. Utilisez un microscope confocal inversé avec un objectif 40X 1,3 NA, équipé de lasers de 405 nanomètres, 440 nanomètres, 473 nanomètres, 543 nanomètres et 635 nanomètres, pour capturer des images et enregistrer des piles Z 3D, d’une épaisseur de 0,54 micron, avec une coupe Z optimale. Enfin, analysez les images selon le protocole texte.Un exemple de MET dans un échantillon BAL est présenté ici. La première caractéristique détectable est le mouvement du noyau vers le bord de la cellule, comme on le voit dans ce MET à un stade antérieur qui a une forme à peu près sphérique. S’ensuit une chromatine extracellulaire avec d’autres médiateurs co-exprimés, tels que H3Cit et des protéases granulaires, comme on le voit dans ce MET plus mature.Le stade antérieur MET est en haut à gauche et le stade ultérieur MET est en dessous vers le centre. Les MET du tissu pulmonaire sont illustrés sur cette figure. Au fur et à mesure que les poumons sont gonflés avec du liquide pour définir l’architecture pulmonaire, les MET seront poussés contre les parois alvéolaires.La morphologie des MET variera également en fonction du plan dans lequel le tissu a été coupé. Les sections standard utilisées pour les échantillons de tissu pulmonaire ont une épaisseur de quatre à cinq microns. Des coupes de tissus plus épaisses permettent de prendre plusieurs images et les MET peuvent ensuite être visualisées en 3D.Un exemple d’image 3D d’un tissu pulmonaire de souris coupé en sections de 25 à 35 microns est présenté ici. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours de coloration plus imagerie si elle est effectuée correctement. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’être doux avec les lavages.Après cette procédure, d’autres méthodes comme la zymographie peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires comme l’expression de la protéase. Après son développement, cette technique pourrait ouvrir la voie à l’étude des réponses inflammatoires des macrophages. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de visualiser les MET à l’aide de la microscopie confocale.N’oubliez pas que travailler avec PLP peut être dangereux et que des précautions telles que le port de gants et de lunettes de protection doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

visualizing-macrophage-extracellular-traps-using-confocal-microscopy

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Neutrophiles pièges extracellulaires (NET) sont un important mécanisme immunitaire inné pour combattre les bactéries pathogènes, champignons et parasites. Nous décrivons ici les méthodes d'isoler granulocytes neutrophiles dans le sang humain et de les activer pour former NET. Nous présentons les techniques de préparation de visualiser NET en microscopie optique et électronique.

Neutrophiles pièges extracellulaires: Comment générer et de les visualiser

Une méthode est décrite de sélectionner individuellement, manipuler, et les agents pathogènes d'image en direct en utilisant un piège optique couplé à un microscope à disque rotatif. Le piège optique offre un contrôle spatial et temporel des organismes et les places adjacentes aux cellules hôtes. La microscopie à fluorescence capture dynamique des interactions intercellulaires avec perturbation minimale pour les cellules.

L&#39;utilisation d&#39;un piège optique pour l&#39;étude des interactions hôtes pathogènes pour l&#39;imagerie cellulaire dynamique en direct

Dans cette vidéo, nous décrivons un protocole pour l’immunomarquage et la visualisation par microscopie confocale des pièges extracellulaires (MET) des macrophages dans le tissu pulmonaire murin. Les macrophages résidant dans les tissus sont caractérisés par l’expression du marqueur de glycoprotéine de surface F4/80 spécifique des macrophages, tandis que les MET sont visualisés par le marquage des marqueurs MET métalloprotéinase matricielle 9, de l’histone citrullinée H3 et de la chromatine...

Caractérisation des pièges extracellulaires de macrophages dans des échantillons de tissu pulmonaire de souris

Cette vidéo démontre l’immunomarquage des pièges extracellulaires de macrophages, METs, dans les macrophages broncho-alvéolaires à partir de liquide de lavage broncho-alvéolaire, et leur visualisation à l’aide d’un microscope confocal.

Visualisation de pièges extracellulaires dans les macrophages à partir de fluides de lavage broncho-alvéolaire humain

Cette vidéo démontre la stimulation in vitro des pièges extracellulaires (MET) de macrophages dans des macrophages humains dérivés de monocytes à l’aide de différents stimuli inflammatoires tels que le TNF-alpha, le PMA et le HOCL. La vidéo montre également la méthode de coloration par colorant SYTOX des MET pour la visualisation.

Stimulation in vitro et visualisation de pièges extracellulaires de macrophages

Nous décrivons un dispositif expérimental permettant de visualiser avec une haute résolution sans précédent la formation et la fermeture de phagosomes en trois dimensions dans des macrophages vivants, en utilisant la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale. Il permet de surveiller la base de la cupule phagocytaire, les pseudopodes en extension, ainsi que le site précis de scission du phagosome.

&quot;Phagosome Clôture Assay&quot; pour visualiser Formation Phagosome en trois dimensions en utilisant la réflexion interne totale Fluorescent Microscopy (TIRFM)

Nous décrivons ici des méthodes à l’aide de microscopie confocale de rotation disque aux événements phagocytaires unique image de macrophages péritonéaux résident de souris. Les protocoles peuvent être étendues à d’autres cellules phagocytaires.

Time-lapse imagerie 3D de phagocytose par les Macrophages de souris

Les pièges extracellulaires de Neutrophile (NET) sont des structures tridimensionnelles produites par les granulocytes neutrophiles stimulés. Il est devenu clair ces dernières années que les ENe sont impliqués dans une grande variété de maladies. La détection des EAE dans les tissus peut avoir une pertinence diagnostique, de sorte que des protocoles normalisés pour l'étiquetage des composants NET sont nécessaires.

Immunofluorescence Étiquetage des pièges extracellulaires de l'homme et de la murine Neutrophil dans les tissus paraffins

Présenté ici est un protocole pour détecter la production de pièges extracellulaires macrophages (MET) dans la culture cellulaire vivante en utilisant la microscopie et la coloration de fluorescence. Ce protocole peut être étendu pour examiner des marqueurs spécifiques de protéine de MET par coloration d'immunofluorescence.

Stimulation in vitro et visualisation de la libération de piège extracellulaire dans les macrophages humains différenciés dérivés de monocytes

Un protocole pour l’induction et l’analyse de pièges extracellulaires (TNE) in vitro est présenté. La quantification de l’ADN, de la cathélicidine (LL37) et de l’activité enzymatique a fourni des données qui montrent la variabilité de la composition et de la morphologie des TNE induites par des stimuli microbiens et chimiques dans des conditions contrôlées similaires.

Analyse morphologique et compositionnelle des pièges extracellulaires neutrophiles induits par des stimuli microbiens et chimiques

Les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont associés à diverses maladies, et l’immunofluorescence est souvent utilisée pour leur visualisation. Cependant, il existe différents protocoles de coloration et, dans de nombreux cas, un seul type de tissu est examiné. Ici, nous établissons un protocole d’application générale pour la coloration des TNE dans les tissus de souris et d’humains.

Imagerie par immunofluorescence des pièges extracellulaires des neutrophiles dans les tissus humains et murins

Apprenez à visualiser les pièges extracellulaires de macrophage par microscopie confocale. Cette méthode permet d'étudier les réponses inflammatoires et immunitaires in vitro et in vivo.

Visualisation des pièges extracellulaires de Macrophage à l’aide de la microscopie confocale

Explorer plus de vidéos