Visualisation des pièges extracellulaires de Macrophage à l’aide de la microscopie confocale
October 19th, 2017
Macrophage pièges extracellulaires sont une entité nouvellement décrite. Cet article se concentre sur les méthodes de microscopie confocale et comment elles sont visualisées in vitro et in vivo des échantillons pulmonaires.
L’objectif global de cette méthode est de démontrer comment les pièges extracellulaires des macrophages peuvent être visualisés et étudiés à l’aide de la microscopie confocale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’inflammation, telles que les réponses à l’infection et à d’autres stimuli immunitaires. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une modification d’une méthode bien établie qui a été utilisée pour étudier les pièges extracellulaires des neutrophiles.
Roleen Sharma fera la démonstration de cette procédure. Après avoir obtenu des macrophages pulmonaires d’humains et de souris par lavage broncho-alvéolaire, ou BAL, selon le protocole textuel, utilisez du bleu de trypan et un hémocytomètre pour effectuer une numération cellulaire viable sur la solution BAL. Pipeter une à quatre fois 10 à 10 macrophages dans 500 microlitres de milieu de culture sur des lamelles de couverture dans les puits de plaques à 24 puits, puis incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour qu’elles adhèrent.
Retirez le milieu de culture et utilisez du PBS pour laver les cellules une fois. Ajoutez ensuite 2 % de paraformaldéhyde-periodate-lysine, ou fixateur PLP, et incubez les échantillons pendant 10 minutes. Après avoir utilisé le PBS pour laver brièvement les cellules, ajoutez 0,2 % de SEIZE 20 dans du PBS et incubez les cellules pendant 20 minutes.
Ensuite, pour bloquer les cellules, ajoutez 10 % de sérum de poulet dans 5 % BSA, dilué dans du PBS et incubez les échantillons à température ambiante pendant 30 minutes. Remplacez ensuite la solution en bloc par une concentration de 1 à 100 d’anticorps primaires et de contrôle isotopique et incubez les cellules à température ambiante pendant une heure. Après l’incubation, utilisez du PBS pour laver les cellules avant d’ajouter les anticorps secondaires correspondants.
Ensuite, incubez les échantillons pendant 40 minutes à température ambiante. Après avoir lavé les cellules dans du PBS, montez les échantillons avec un support de montage à base de DAPI, puis visualisez les échantillons à l’aide d’un microscope confocal. Pour prétraiter les échantillons FFPE avec une solution de récupération d’antigène, séchez les lames au four à 60 degrés Celsius pendant 60 minutes.
Transférez ensuite les lames dans une solution de xylène pendant 30 minutes avant de transférer les échantillons à 70 % d’éthanol à température ambiante pendant cinq minutes. Après avoir utilisé de l’eau du robinet pour rincer les lames, placez-les dans une pellicule plastique résistante à la chaleur et soumettez-les à une récupération d’antigène plus élevée en les plaçant dans un autocuiseur à Tris-EDTA pH 9,0 pendant 10 minutes. Refroidissez les échantillons pendant 20 minutes et transférez-les dans l’eau du robinet.
Ensuite, placez-les sur une bascule pendant cinq minutes. Répétez le lavage à l’eau du robinet, puis lavez les diapositives une fois dans PBS sur la bascule. Pour bloquer les échantillons, ajoutez 10 % de sérum de poulet dans 5 % de BSA PBS et incubez-les à température ambiante pendant 30 minutes.
Ensuite, pour définir les pièges extracellulaires des macrophages, ou MET dans les macrophages, ajoutez une dilution de un à 100 d’anticorps primaires dans 1 % de BSA PBS et incubez les lames à quatre degrés Celsius pendant 16 heures. Utilisez PBS pour laver les échantillons deux fois sur une bascule pendant cinq minutes chacune. Ajoutez les anticorps secondaires fluorescents correspondants dans 1 % de BSA PBS et incubez les lames à température ambiante pendant 40 minutes.
Après les lavages PBS, utilisez un milieu de montage contenant du DAPI pour colorer la chromatine et monter les échantillons. À l’aide d’une tête de balayage laser confocale fixée à un microscope inversé, capturez des images fluorescentes à l’aide d’objectifs à air 20X 0,1 NA et 40X 1,0 NA à huile. Capturez des images à plan unique de 512 x 512 pixels en cliquant sur le bouton de nivellement séquentiel de ligne.
Obtenez au moins 10 champs de vision par section pour l’analyse et des données pour chaque résultat. Pour colorer les sections dans les tubes de microcentrifugation, ajoutez les anticorps primaires pertinents dans des volumes de 200 microlitres et incubez les échantillons à quatre degrés Celsius pendant 16 heures. Lavez les sections dans du PBS trois fois pendant 10 minutes avant d’ajouter les anticorps secondaires appropriés et d’incuber les échantillons à température ambiante pendant une heure.
Utilisez le DAPI pour colorer les sections pulmonaires en solution et incuber les échantillons pendant 20 minutes avant d’ajouter des lamelles de recouvrement aux coupes sur les lames de microscope dans le PBS. Utilisez un microscope confocal inversé avec un objectif 40X 1,3 NA, équipé de lasers de 405 nanomètres, 440 nanomètres, 473 nanomètres, 543 nanomètres et 635 nanomètres, pour capturer des images et enregistrer des piles Z 3D, d’une épaisseur de 0,54 micron, avec une coupe Z optimale. Enfin, analysez les images selon le protocole texte.
Un exemple de MET dans un échantillon BAL est présenté ici. La première caractéristique détectable est le mouvement du noyau vers le bord de la cellule, comme on le voit dans ce MET à un stade antérieur qui a une forme à peu près sphérique. S’ensuit une chromatine extracellulaire avec d’autres médiateurs co-exprimés, tels que H3Cit et des protéases granulaires, comme on le voit dans ce MET plus mature.
Le stade antérieur MET est en haut à gauche et le stade ultérieur MET est en dessous vers le centre. Les MET du tissu pulmonaire sont illustrés sur cette figure. Au fur et à mesure que les poumons sont gonflés avec du liquide pour définir l’architecture pulmonaire, les MET seront poussés contre les parois alvéolaires.
La morphologie des MET variera également en fonction du plan dans lequel le tissu a été coupé. Les sections standard utilisées pour les échantillons de tissu pulmonaire ont une épaisseur de quatre à cinq microns. Des coupes de tissus plus épaisses permettent de prendre plusieurs images et les MET peuvent ensuite être visualisées en 3D.
Un exemple d’image 3D d’un tissu pulmonaire de souris coupé en sections de 25 à 35 microns est présenté ici. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours de coloration plus imagerie si elle est effectuée correctement. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’être doux avec les lavages.
Après cette procédure, d’autres méthodes comme la zymographie peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires comme l’expression de la protéase. Après son développement, cette technique pourrait ouvrir la voie à l’étude des réponses inflammatoires des macrophages. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de visualiser les MET à l’aide de la microscopie confocale.
N’oubliez pas que travailler avec PLP peut être dangereux et que des précautions telles que le port de gants et de lunettes de protection doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
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Aperçu
Cet article se concentre sur la visualisation des pièges extracellulaires des macrophages en utilisant des techniques de microscopie confocale. Il traite à la fois des méthodes in vitro et in vivo appliquées aux échantillons pulmonaires.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Immunologie
- Biologie cellulaire
- Techniques de microscopie
Contexte
- Les pièges extracellulaires des macrophages sont une entité nouvellement décrite.
- Comprendre leur rôle dans l'inflammation est crucial pour la recherche sur la réponse immunitaire.
- La microscopie confocale est un outil puissant pour visualiser ces structures.
- Cette méthode s'appuie sur des techniques établies utilisées pour les pièges extracellulaires des neutrophiles.
Objectif de l'étude
- Démontrer la visualisation des pièges extracellulaires des macrophages.
- Explorer les réponses à l'infection et aux stimuli immunitaires.
- Fournir un protocole détaillé pour les chercheurs dans le domaine.
Méthodes utilisées
- Isolation des macrophages pulmonaires humains et de souris par lavage bronchoalvéolaire (LBA).
- Dénombrement des cellules viables à l'aide du bleu de trypan et d'un hémocytomètre.
- Culture cellulaire sur des lamelles dans des plaques à 24 puits.
- Incubation des cellules à 37 degrés Celsius pour l'adhésion.
Résultats principaux
- Visualisation réussie des pièges extracellulaires des macrophages.
- Démonstration de l'efficacité de la méthode dans l'étude des réponses immunitaires.
- Amélioration du protocole pour une meilleure clarté et reproductibilité.
- Contribution à la compréhension des fonctions des macrophages dans l'inflammation.
Conclusions
- La méthode de microscopie confocale est efficace pour étudier les pièges extracellulaires des macrophages.
- Cette technique peut faire progresser la recherche sur l'inflammation et les réponses immunitaires.
- Des études futures peuvent s'appuyer sur cette méthodologie pour explorer d'autres implications.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Visualizing macrophage extracellular traps (METs) provides a mechanistic readout of innate immune activation relevant to inflammatory disease modeling. This confocal microscopy approach enables target de-risking by linking stimulus exposure to quantifiable chromatin release and protease co-expression. The method supports early discovery workflows where understanding macrophage-driven pathology informs target validation and phenotypic screening strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of macrophage activation states through direct visualization of extracellular chromatin and co-expressed mediators like citrullinated histones and granule proteases.
- Operational Value: Provides a reproducible imaging-based assay to compare stimulated versus unstimulated conditions for target pathway modulation.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing in inflammation models by correlating MET formation with functional immune responses to infection or stimuli.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantifiable imaging outputs (e.g., chromatin release, H3Cit, protease co-localization) suitable for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Includes built-in controls (background, isotype, unstimulated) to ensure assay specificity and reduce false-positive signals in compound evaluation.
- Scalability: Compatible with both in vitro cell culture and ex vivo lung tissue sections, enabling cross-model consistency in target engagement studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models macrophage-driven processes in lung inflammation, aligning with preclinical studies of fibrotic, infectious, or autoimmune lung conditions.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo lung tissue analysis, supporting biomarker-aligned progression from discovery to preclinical validation.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables objective assessment of macrophage extracellular trap formation as a functional readout for go/no-go criteria in immunomodulator screening.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead optimization, where MET visualization serves as a functional immune response assay in inflammation-focused programs.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by visualizing chromatin extrusion and protease release as downstream consequences of target modulation in macrophages.
- Screening: Enables quantitative imaging readouts that can be automated via image analysis software to assess compound effects on MET formation across dose ranges.
- Analytics: Delivers multiparametric data (chromatin, citrullinated histones, protease co-expression) enabling statistical comparison of experimental groups for target prioritization.
- Translational Research: Facilitates cross-species comparison (human and mouse lung macrophages) and ex vivo tissue validation, strengthening preclinical-to-clinical translatability.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple inflammatory targets and disease models beyond initial validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in macrophage activation studies by providing direct, visual evidence of extracellular trap formation and molecular co-expression.
- Operational Value: Standardizes sample preparation, staining, and imaging workflows, improving inter-lab reproducibility and data consistency in immune profiling.
- Strategic Value: Informs early portfolio decisions by linking target inhibition to measurable reductions in pathogenic MET formation, decreasing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of immunomodulatory candidates based on functional macrophage phenotype modulation rather than binding affinity alone.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence staining, confocal microscopy operation, and image analysis for accurate MET detection and quantification.
- Dependent on access to confocal laser scanning microscopes with appropriate objectives (e.g., 20X air, 40X oil) and laser lines for multichannel fluorescence detection.
- Necessitates standardized antibody panels and titration protocols to ensure specific detection of chromatin, citrullinated histones, and granule proteases across sample types.
- Involves optimization steps for antigen retrieval in FFPE lung tissue, including pressure-based retrieval in Tris-EDTA pH 9.0, to maintain epitope accessibility.
- Limited by the need for careful wash steps to preserve delicate extracellular trap structures during staining, as aggressive handling may disrupt NET/MET morphology.
