Visualisation des pièges extracellulaires de Macrophage à l’aide de la microscopie confocale

L’objectif global de cette méthode est de démontrer comment les pièges extracellulaires des macrophages peuvent être visualisés et étudiés à l’aide de la microscopie confocale. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’inflammation, telles que les réponses à l’infection et à d’autres stimuli immunitaires. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une modification d’une méthode bien établie qui a été utilisée pour étudier les pièges extracellulaires des neutrophiles.

Roleen Sharma fera la démonstration de cette procédure. Après avoir obtenu des macrophages pulmonaires d’humains et de souris par lavage broncho-alvéolaire, ou BAL, selon le protocole textuel, utilisez du bleu de trypan et un hémocytomètre pour effectuer une numération cellulaire viable sur la solution BAL. Pipeter une à quatre fois 10 à 10 macrophages dans 500 microlitres de milieu de culture sur des lamelles de couverture dans les puits de plaques à 24 puits, puis incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour qu’elles adhèrent.

Retirez le milieu de culture et utilisez du PBS pour laver les cellules une fois. Ajoutez ensuite 2 % de paraformaldéhyde-periodate-lysine, ou fixateur PLP, et incubez les échantillons pendant 10 minutes. Après avoir utilisé le PBS pour laver brièvement les cellules, ajoutez 0,2 % de SEIZE 20 dans du PBS et incubez les cellules pendant 20 minutes.

Ensuite, pour bloquer les cellules, ajoutez 10 % de sérum de poulet dans 5 % BSA, dilué dans du PBS et incubez les échantillons à température ambiante pendant 30 minutes. Remplacez ensuite la solution en bloc par une concentration de 1 à 100 d’anticorps primaires et de contrôle isotopique et incubez les cellules à température ambiante pendant une heure. Après l’incubation, utilisez du PBS pour laver les cellules avant d’ajouter les anticorps secondaires correspondants.

Ensuite, incubez les échantillons pendant 40 minutes à température ambiante. Après avoir lavé les cellules dans du PBS, montez les échantillons avec un support de montage à base de DAPI, puis visualisez les échantillons à l’aide d’un microscope confocal. Pour prétraiter les échantillons FFPE avec une solution de récupération d’antigène, séchez les lames au four à 60 degrés Celsius pendant 60 minutes.

Transférez ensuite les lames dans une solution de xylène pendant 30 minutes avant de transférer les échantillons à 70 % d’éthanol à température ambiante pendant cinq minutes. Après avoir utilisé de l’eau du robinet pour rincer les lames, placez-les dans une pellicule plastique résistante à la chaleur et soumettez-les à une récupération d’antigène plus élevée en les plaçant dans un autocuiseur à Tris-EDTA pH 9,0 pendant 10 minutes. Refroidissez les échantillons pendant 20 minutes et transférez-les dans l’eau du robinet.

Ensuite, placez-les sur une bascule pendant cinq minutes. Répétez le lavage à l’eau du robinet, puis lavez les diapositives une fois dans PBS sur la bascule. Pour bloquer les échantillons, ajoutez 10 % de sérum de poulet dans 5 % de BSA PBS et incubez-les à température ambiante pendant 30 minutes.

Ensuite, pour définir les pièges extracellulaires des macrophages, ou MET dans les macrophages, ajoutez une dilution de un à 100 d’anticorps primaires dans 1 % de BSA PBS et incubez les lames à quatre degrés Celsius pendant 16 heures. Utilisez PBS pour laver les échantillons deux fois sur une bascule pendant cinq minutes chacune. Ajoutez les anticorps secondaires fluorescents correspondants dans 1 % de BSA PBS et incubez les lames à température ambiante pendant 40 minutes.

Après les lavages PBS, utilisez un milieu de montage contenant du DAPI pour colorer la chromatine et monter les échantillons. À l’aide d’une tête de balayage laser confocale fixée à un microscope inversé, capturez des images fluorescentes à l’aide d’objectifs à air 20X 0,1 NA et 40X 1,0 NA à huile. Capturez des images à plan unique de 512 x 512 pixels en cliquant sur le bouton de nivellement séquentiel de ligne.

Obtenez au moins 10 champs de vision par section pour l’analyse et des données pour chaque résultat. Pour colorer les sections dans les tubes de microcentrifugation, ajoutez les anticorps primaires pertinents dans des volumes de 200 microlitres et incubez les échantillons à quatre degrés Celsius pendant 16 heures. Lavez les sections dans du PBS trois fois pendant 10 minutes avant d’ajouter les anticorps secondaires appropriés et d’incuber les échantillons à température ambiante pendant une heure.

Utilisez le DAPI pour colorer les sections pulmonaires en solution et incuber les échantillons pendant 20 minutes avant d’ajouter des lamelles de recouvrement aux coupes sur les lames de microscope dans le PBS. Utilisez un microscope confocal inversé avec un objectif 40X 1,3 NA, équipé de lasers de 405 nanomètres, 440 nanomètres, 473 nanomètres, 543 nanomètres et 635 nanomètres, pour capturer des images et enregistrer des piles Z 3D, d’une épaisseur de 0,54 micron, avec une coupe Z optimale. Enfin, analysez les images selon le protocole texte.

Un exemple de MET dans un échantillon BAL est présenté ici. La première caractéristique détectable est le mouvement du noyau vers le bord de la cellule, comme on le voit dans ce MET à un stade antérieur qui a une forme à peu près sphérique. S’ensuit une chromatine extracellulaire avec d’autres médiateurs co-exprimés, tels que H3Cit et des protéases granulaires, comme on le voit dans ce MET plus mature.

Le stade antérieur MET est en haut à gauche et le stade ultérieur MET est en dessous vers le centre. Les MET du tissu pulmonaire sont illustrés sur cette figure. Au fur et à mesure que les poumons sont gonflés avec du liquide pour définir l’architecture pulmonaire, les MET seront poussés contre les parois alvéolaires.

La morphologie des MET variera également en fonction du plan dans lequel le tissu a été coupé. Les sections standard utilisées pour les échantillons de tissu pulmonaire ont une épaisseur de quatre à cinq microns. Des coupes de tissus plus épaisses permettent de prendre plusieurs images et les MET peuvent ensuite être visualisées en 3D.

Un exemple d’image 3D d’un tissu pulmonaire de souris coupé en sections de 25 à 35 microns est présenté ici. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours de coloration plus imagerie si elle est effectuée correctement. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’être doux avec les lavages.

Après cette procédure, d’autres méthodes comme la zymographie peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires comme l’expression de la protéase. Après son développement, cette technique pourrait ouvrir la voie à l’étude des réponses inflammatoires des macrophages. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de visualiser les MET à l’aide de la microscopie confocale.

N’oubliez pas que travailler avec PLP peut être dangereux et que des précautions telles que le port de gants et de lunettes de protection doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.