Profilage de Proteome profonde en étiquetage isobare, vaste chromatographie en phase liquide, spectrométrie de masse et Quantification assistée par logiciel

L’objectif global de cette expérience est d’identifier et de quantifier avec précision plus de 10 000 protéines de lysat cellulaire ou tissulaire à travers différents traitements médicamenteux, évolutions temporelles ou conditions biologiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la médecine ou de la biologie, telles que les protéines qui changent en réponse à un médicament ou à un autre stimulus biologique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle a la capacité de quantifier avec précision plus de 70 % du protéome exprimé dans 10 conditions expérimentales différentes.

L’implication de cette technologie peut être étendue au diagnostic des maladies humaines grâce à la découverte potentielle de biomarqueurs. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la lyse cellulaire optimale et l’estimation des fluides jouent un rôle clé dans les procédures de digestion, de marquage et de séparation en aval. Pour commencer ce protocole, obtenez des cellules cultivées d’intérêt.

Lavez les cellules deux fois avec 10 millilitres de PBS pour chaque lavage. Grattez et collectez les cellules lavées dans un tube de 1,5 millilitre contenant un millilitre de PBS. Centrifuger à 600 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.

Retirez le surnageant et conservez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à lyser les cellules. Prélever et peser les tissus souhaités rapidement après la dissection. Après cela, stockez-les immédiatement dans de l’azote liquide et stockez-les à moins 80 degrés Celsius.

Préparez le tampon de lyse le jour de l’expérience, comme indiqué dans le protocole textuel. Ajouter un tampon de lyse à l’échantillon congelé de sorte que le rapport tampon/échantillon soit de 10 pour un et que la concentration finale en protéines soit comprise entre cinq et 10 milligrammes par millilitre. Ensuite, ajoutez des billes de verre et utilisez un mélangeur pour lyser les échantillons à quatre degrés Celsius et accélérer huit en mélangeant pendant 30 secondes, puis en reposant pendant cinq secondes, en répétant cette opération cinq fois ou jusqu’à ce que les échantillons soient homogénéisés.

Mesurez la concentration en protéines à l’aide d’un test standard de quantification des protéines ou d’un gel de polyacrylamide SDS coloré à Coomassie avec BSA comme standard. Après cela, ajoutez 100 % d’acétonitrile de sorte que la concentration finale soit de 10 % et que la protéase Lys-C soit à un rapport enzyme/substrat de un à 100. Incuber à température ambiante pendant deux heures pour permettre la digestion des protéines.

Ajoutez ensuite du DTT de manière à ce que la concentration finale soit d’un millimolaire. Incuber à température ambiante pendant une heure. Ensuite, ajoutez 50 millimolaires d’HEPES jusqu’à ce que la concentration d’urée dans les échantillons soit diluée en deux molaires.

Ajoutez de la trypsine à chaque échantillon à un rapport trypsine/protéine de un à 50. Incuber à température ambiante pendant au moins trois heures. Ensuite, ajoutez du DTT jusqu’à ce que sa concentration soit à nouveau d’un millimolaire et incubez à température ambiante pendant deux heures.

Ajouter de l’iodoacétamide de manière à ce que sa concentration finale soit de 10 millimolaires. Incuber dans l’obscurité pendant 30 minutes à température ambiante. Après cela, trempez tout iodoacétamide n’ayant pas réagi en ajoutant du DTT de sorte que sa concentration finale soit de 30 millimolaires.

Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Vérifiez l’efficacité de la digestion de la trypsine comme indiqué dans le protocole de texte. Ensuite, ajoutez du TFA à chaque échantillon de sorte que la concentration finale soit de 1 %À l’aide d’une bandelette de pH, mesurez le pH de chaque échantillon pour vérifier qu’il est compris entre deux et trois.

Ajoutez de l’AGT supplémentaire si nécessaire pour atteindre un pH inacceptable. Centrifugez les échantillons à 20 000 fois g et à température ambiante pendant 10 minutes. Prélever le surnageant et charger les échantillons sur des colonnes de centrifugation préparées.

Centrifuger à 100 fois g pendant trois minutes ou jusqu’à ce que l’échantillon ait complètement traversé la colonne pour lier les échantillons. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de 0,1 % TFA à chaque colonne. Centrifuger à 500 fois g pendant 30 secondes.

Après cela, ajoutez 125 microlitres d’une solution contenant 60 % d’acétonitrile et 0,1 TFA dans chaque colonne. Centrifuger à 100 fois g pendant trois minutes pour éluer les peptides de la colonne. Reconstituez chaque échantillon de peptide dessalé en 50 microlitres de 50 millimolaires HEPES.

À l’aide d’une bandelette de pH, vérifiez que le pH de chaque échantillon est compris entre sept et huit. Ensuite, dissolvez les réactifs TMT dans de l’acétonitrile anhydre, ajoutez-les aux échantillons, puis incubez à température ambiante pendant une heure. Ensuite, utilisez des pointes de pipette de 10 microlitres intégrées à un support de chromatographie pour dessaler un microgramme de chaque échantillon et analyser l’efficacité de l’étiquetage comme indiqué dans le protocole de texte.

Examinez six à 10 peptides distincts pour vous assurer que des peptides non marqués ne sont pas détectés dans les échantillons marqués. Ensuite, mélangez environ deux microlitres de chaque échantillon. Utilisez des pointes de pipette de 10 microlitres intégrées dans un média de chromatographie pour dessaler ce mélange.

Analysez les échantillons par LC-MS/MS comme indiqué dans le protocole texte. Pour commencer, solubilisez l’échantillon de peptide dessalé marqué au TMT dans 65 microlitres de tampon A.Utilisez une bandelette de pH pour vérifier que le pH est d’environ 8,0. Si l’échantillon est encore acide, utilisez de l’hydroxyde d’ammonium pour ajuster le pH au besoin.

Ensuite, fractionnez l’échantillon comme indiqué dans le protocole texte. Réglez le collecteur de fractions pour collecter les fractions toutes les deux minutes, y compris le temps de chargement. Réglez le débit à 0,4 millilitre par minute.

Collectez un total de 80 fractions. Ensuite, utilisez un concentrateur sous vide pour sécher complètement tous les autres échantillons. À l’aide de la LC-MS/MS, analysez les 80 fractions pour obtenir une couverture protéomique ultra profonde.

Tout d’abord, emballez la résine C18 de 1,9 micromètre dans des colonnes vides de 75 micromètres de diamètre intérieur atteignant un volume de lit d’environ 1,3 microlitre. Enroulez la colonne deux à trois fois à l’intérieur d’un chauffe-portefeuille papillon pour vous assurer que toute la longueur est chauffée. Collez la colonne à l’intérieur de l’appareil de chauffage en vous assurant de ne pas coller sur le capteur de température de l’appareil de chauffage.

Ensuite, chauffez la colonne à 65 degrés Celsius. Faites passer 100 nanogrammes de peptides de cerveau de rat dans le système LC-MS/MS pour évaluer la qualité du système. Répétez cette évaluation une fois de plus.

Après cela, chargez environ 0,2 microgramme de peptides reconstitués sur la colonne tout en écoulant 5 % tampon A. Éluez les peptides de la colonne et analysez-les avec le spectromètre de masse comme indiqué dans le protocole de texte. Dans cette étude, une méthode à haut débit pour la quantification des protéines avec une stratégie de marquage isobare 10-plex est décrite. L’efficacité du marquage TMT est examinée à l’aide de la LC-MS/MS pour analyser les échantillons marqués au TMT et les échantillons non marqués correspondants.

Comme on peut le voir, le pic peptidique non marqué ne se trouve que dans l’échantillon non marqué, tandis que le pic peptidique marqué TMT ne se trouve que dans l’échantillon marqué. Ensuite, l’effet de la fenêtre d’isolement MS2 sur le brouillage est évalué. Tous les balayages MS2 sont désignés comme des balayages propres ou bruyants.

Alors que les balayages propres présentent des ions y1 de lysine uniquement, les balayages bruyants les présentent à la fois dans la lysine et l’arginine. L’élimination représentative des interférences à l’aide de peptides E. coli marqués individuellement avec trois réactifs TMT différents est illustrée ici. La somme des intensités relatives révèle que la correction basée sur les ions y1 est plus précise pour la quantification basée sur le TMT.

Une fois maîtrisé, ce protocole peut être complété en quatre à cinq semaines s’il est fait correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est très important de s’assurer que toutes les étapes de contrôle de la qualité sont effectuées complètement pour s’assurer que l’ensemble de données final est aussi précis que possible. L’adaptation de cette procédure pour se concentrer sur les modifications post-traductionnelles peut répondre à d’autres questions telles que l’évolution de l’ubiquitination, de la phosphorylation ou de l’acétylation en réponse à la progression de la maladie ou au traitement médicamenteux.

Après son développement, la technologie a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des produits pour explorer les changements protéiques dans les cellules et les tissus. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne compréhension de la façon d’identifier et de quantifier avec précision plus de 10 000 protéines à partir d’une cellule ou d’un tissu de mammifère. N’oubliez pas que travailler avec de l’UPLC à haute pression et quelques colonnes de silice peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port de lunettes de sécurité doivent toujours être prises lors de cette procédure.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons commencé à aborder le problème connu de la compression du rapport qui se produit dans le marquage isobare. Nous avons réalisé que le fractionnement extensif est un excellent moyen non seulement d’atténuer ce problème, mais également d’augmenter l’identification des protéines et des peptides qui peuvent encore augmenter et s’adapter à une analyse du protéome.