Name: Profilage de Proteome profonde en étiquetage isobare, vaste chromatographie en phase liquide, spectrométrie de masse et Quantification assistée par logiciel (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Découvrez la quantification protéique par étiquetage isobare TMT avec fractionnement et spectrométrie de masse haute résolution. Cette méthode permet d'analyser plus de 10 000 protéines pour la recherche en biomarqueurs.

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Les auteurs remercient tous les autres membres de laboratoire et de la facilité de discussion utile. Ce travail a été partiellement soutenu par des subventions NI H R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987 et ALSAC. L’analyse de MS a été réalisée dans recherche protéomique hospitalier le St. Jude Children, partiellement pris en charge par grant NIH Cancer Center Support P30CA021765. Les auteurs remercient Nisha Badders pour aide à l’édition du manuscrit.

<ol><li>Pagala, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+protein+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative protein analysis by mass spectrometry.</a> Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).</li>
<li>Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+proteomics%3A+towards+an+integrative+view+of+proteome+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics.</a> Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).</li>
<li>Rauniyar, N., Yates, J. R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isobaric+labeling-based+relative+quantification+in+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics.</a> J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).</li>
<li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+exploration+of+proteome+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function.</a> Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+Profiling+of+Proteome+and+Phosphoproteome+by+Isobaric+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Extensive+Liquid+Chromatography%2C+and+Mass+Spectrometry.+Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling.</a> Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).</li>
<li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+multiplexing+capacity+of+TMTs+using+reporter+ion+isotopologues+with+isobaric+masses%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses.</a> Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).</li>
<li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+throughput+in+targeted+proteomics+assays%3A+54-plex+quantitation+in+a+single+mass+spectrometry+run%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run.</a> Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+approaches+for+analyzing+U1-70K+cleavage+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer's disease.</a> J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li>
<li>Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+of+proteomics+applied+to+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances of proteomics applied to human diseases.</a> J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).</li>
<li>Churchman, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Retinoids+in+IKZF1-Mutated+BCR-ABL1+Acute+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+mouse-human+phenome-wide+association+to+test+gene+function+and+disease+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk.</a> Nat Commun. 7, 10464(2016).</li>
<li>Mertz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+elution+interactome+analysis+of+the+Mind+bomb+1+ubiquitin+ligase+reveals+a+novel+role+in+dendritic+spine+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).</li>
<li>Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pH+reversed-phase+chromatography+with+fraction+concatenation+for+2D+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis.</a> Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+off-line+high+pH+reversed-phase+fractionation+and+nano-liquid+chromatography-mass+spectrometry+method+for+global+proteomic+profiling+of+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).</li>
<li>Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-line+high-pH+reversed-phase+fractionation+for+in-depth+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics.</a> J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).</li>
<li>Song, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversed-phase-reversed-phase+liquid+chromatography+approach+with+high+orthogonality+for+multidimensional+separation+of+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides.</a> Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+optimization+of+long+gradient+chromatography+mass+spectrometry+for+deep+analysis+of+brain+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome.</a> J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).</li>
<li>Hebert, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+one+hour+yeast+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The one hour yeast proteome.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JUMP%3A+a+tag-based+database+search+tool+for+peptide+identification+with+high+sensitivity+and+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).</li>
<li>Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematical+optimization+of+reverse-phase+chromatography+for+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics.</a> J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).</li>
<li>Niu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Peptide+Fractionation+and+y1+Ion-Based+Interference+Detection+Method+for+Enabling+Accurate+Quantification+by+Isobaric+Labeling+and+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).</li>
<li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).</li>
<li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+fragmentation+and+optimized+isolation+width+settings+for+improvement+of+protein+identification+and+accuracy+of+isobaric+mass+tag+quantification+on+Orbitrap-type+mass+spectrometers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers.</a> Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).</li>
<li>Wenger, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-phase+purification+enables+accurate%2C+multiplexed+proteome+quantification+with+isobaric+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging.</a> Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).</li>
<li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiNotch+MS3+enables+accurate%2C+sensitive%2C+and+multiplexed+detection+of+differential+expression+across+cancer+cell+line+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes.</a> Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+proteome+quantification+by+DEEP+SEQ+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry.</a> Nat Commun. 4, 2171(2013).</li>
<li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+fragmentation+and+optimized+isolation+width+settings+for+improvement+of+protein+identification+and+accuracy+of+isobaric+mass+tag+quantification+on+Orbitrap-type+mass+spectrometers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers.</a> Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).</li>
<li>Ahrne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Improvement+of+Quantification+Accuracy+in+Isobaric+Mass+Tag-Based+Protein+Quantification+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments.</a> J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).</li>
<li>Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematical+Optimization+of+Reverse-Phase+Chromatography+for+Shotgun+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics.</a> J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).</li>
<li>Tan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Proteomics+and+Phosphoproteomics+Profiling+Reveals+Dynamic+Signaling+Networks+and+Bioenergetics+Pathways+Underlying+T+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation.</a> Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).</li>
<li>Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+ubiquitination+analysis+by+SILAC+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).</li>
<li>Tan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refined+phosphopeptide+enrichment+by+phosphate+additive+and+the+analysis+of+human+brain+phosphoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome.</a> Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JUMPg%3A+an+Integrative+Proteogenomics+Pipeline+Identifying+Unannotated+Proteins+in+Human+Brain+and+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells.</a> J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+clinical+utility+of+cancer+genomic+and+proteomic+data+across+tumor+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types.</a> Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).</li>
<li>Nesvizhskii, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteogenomics%3A+concepts%2C+applications+and+computational+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies.</a> Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).</li>
<li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les auteurs décrivent un protocole haut débit pour la quantification des protéines avec une stratégie de marquage isobare 10-plex, qui a été appliqué avec succès dans plusieurs publications12,13,14,32 . Dans ce protocole, nous pouvons analyser jusqu'à 10 échantillons de différentes protéines biologiques dans le 1 expérience. Nous pouvons régulièrement identifier et doser les protéines plus 10 0...

Progrès de la technologie de séquençage de nouvelle génération ont conduit à un nouveau paysage pour l’étude des systèmes biologiques et la maladie humaine. Cela a permis à un grand nombre de mesures du génome, transcriptome, protéome, métabolome et autres systèmes moléculaires pour devenir tangible. Spectrométrie de masse (MS) est une des méthodes plus sensibles en chimie analytique, et son application en protéomique a rapidement élargi après le séquençage du génome humain. Dans le domaine de la protéomique, ces dernières années ont abouti à des avancées techniques majeures dans basées sur des analyses quantitatives, y compris les isobares de marquage et de multiplexage capacité combinée à une vaste chromatographie en phase liquide, en plus de l’instrumentation avances, permettant des mesures plus précises et plus rapides avec moins de matériau échantillon requis. Protéomique quantitative est devenus une approche grand public pour le profilage des dizaines de milliers de protéines et de modifications post-traductionnelles dans des échantillons biologiques extrêmement complexes1,2,3,4 , 5 , 6.
Multiplexé isobares étiquetage méthodes telles que tag isobarique pour quantification relative et absolue (par exemple, iTRAQ) et tag de masse en tandem (TMT) MS ont grandement amélioré le débit de l’échantillon et a augmenté le nombre d’échantillons qui peuvent être analysées dans une seule expérience1,6,7,8. Ainsi que d’autres méthodes de quantification basée sur MS, comme dosage exempte d’étiquette et les isotopes stables d’étiquetage avec des acides aminés en culture cellulaire (c.-à-d., SILAC), le potentiel de ces techniques dans la protéomique champ est considérable9 ,10,11. Par exemple, la méthode TMT autorise 10 échantillons de protéines pour être analysés dans le 1 expérience à l’aide de réactifs 10-plex. Ces balises TMT structurellement identiques ont la même masse globale, mais les isotopes lourds sont répartis différemment sur des atomes de carbone ou d’azote, résultant en un ion unique journaliste pendant la fragmentation MS/MS de chaque étiquette, ce qui permet la quantification relative entre les 10 échantillons. La stratégie TMT est systématiquement appliquée afin d’étudier les processus cellulaires12,13,14voies biologiques et progression de la maladie.
Importantes améliorations techniques ont amélioré les systèmes de chromatographie liquide (LC)-MS/MS, tant au niveau des séparations LC et les paramètres de MS, afin d’optimiser l’identification des protéines sans sacrifier la précision de dosage. Première dimension séparation des peptides par une technique de séparation avec l’orthogonalité élevée à la deuxième dimension est essentielle dans ce type de méthode protéomique fusil pour atteindre un résultat maximum20. Chromatographie liquide en phase inversée pH élevé (RPLC) offre de meilleures performances que ne le fait de chromatographie échangeuse de cations forts classiques20. RPLC pH élevé est associé à une deuxième dimension du RPLC pH faible, tant analytique gamme dynamique et la couverture de protéine sont améliorées, ayant pour résultat la capacité d’identifier la majeure partie des protéines exprimées lors de l’exécution d’ensemble-proteome analyses15 ,16,17,18. D’autres avancées techniques comprennent les petites particules de C18 (1,9 µm) et étendu longue colonne (~ 1 m)19. En outre, autres améliorations notables incluent les nouvelles versions de spectromètres de masse avec taux de balayage rapide, amélioration de la sensibilité et résolution20et les pipelines de bioinformatique sophistiqué pour MS données minières21.
Nous décrivons ici un protocole détaillé qui intègre les plus récentes méthodologies avec modifications afin d’améliorer la sensibilité et le débit, tout en se concentrant sur les mécanismes de contrôle de la qualité tout au long de l’expérience. Le protocole prévoit l’extraction de protéine et digestion, TMT 10-plex étiquetage, pH basique et fractionnement RPLC pH acide, haute résolution détection MS et MS informatique (Figure 1). En outre, nous mettre en œuvre plusieurs mesures de contrôle de la qualité de diagnostic et d’évaluation variation expérimentale. Ce protocole détaillé est destiné à aider les nouveaux chercheurs sur le terrain systématiquement identifier et à quantifier avec précision des milliers de protéines d’un lysat ou tissu.

<table><tbody><tr><td>1220 LC système</td><td>Agilent</td><td>G4288B</td><td></td></tr><tr><td>50 % Hydroxylamine</td><td>Thermo Scientific</td><td>90115</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Burdick & Jackson</td><td>AH015-4</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender</td><td>Next Advance</td><td>BB24-AU</td><td></td></tr><tr><td>Butterfly Portfolio Heater</td><td>Phoenix S& T</td><td>PST-BPH-20</td><td></td></tr><tr><td>C18 pointes</td><td>Harvard Apparatus</td><td>74-4607</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D5545</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41648</td><td></td></tr><tr><td>Acide formique</td><td>Sigma</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>Collecteur de fractions</td><td>Gilson</td><td>FC203B</td><td></td></tr><tr><td>Perles de verre</td><td>Next Advance</td><td>GB05</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacétamide (IAA)</td><td>Sigma</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Lys-C</td><td>Wako</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Burdick & Jackson</td><td>AH230-4</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Kit de dosage des protéines</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Spectromètre</td><td>de masse Thermo Scientific</td><td>Q Exactive HF</td><td></td></tr><tr><td>nanoflow UPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>Ultimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur C18 résine, 1.9um</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r119.aq.0003</td><td></td></tr><tr><td>Self Pck Columns</td><td>Nouvel objectif</td><td>PF360-75-15-N-5</td><td></td></tr><tr><td>Désoxycholate de sodium</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Speedva</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD11V</td><td></td></tr><tr><td>TMT 10plex Réactif de marquage isobare</td><td>Thermo Scientific</td><td>90110</td><td></td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique (TFA)</td><td>Applied Biosystems</td><td>400003</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Promega</td><td>V511C</td><td></td></tr><tr><td>Urée</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Xbridge Colonne C18 Eau</td><td></td><td>186003943</td><td></td></tr><tr><td>Ziptips C18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>SepPak 1cc 50mg</td><td>Eaux</td><td>WAT054960</td><td></td></tr></tbody></table>

profilage de proteome profonde en étiquetage isobare, vaste chromatographie en phase liquide, spectrométrie de masse et quantification assistée par logiciel

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Plusieurs avancées exceptionnelles ont eu lieu en spectrométrie de masse (MS)-base de protéomique, avec le progrès technique particulière en chromatographie liquide (LC) couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) et capacité de multiplexage étiquetage isobare. Ici, nous introduisons un protocole de profilage de profond-protéomique qui combine la balise masse tandem (TMT) de 10-plex étiquetage avec une vaste plate-forme de LC/LC-MS/MS, MS après interférence computational correction pour doser avec précision toute protéomes et. Ce protocole comprend les étapes principales suivantes : extraction de protéine et digestion, TMT étiquetage, 2 Dimensions (2D) LC, spectrométrie de masse à haute résolution et traitement informatique des données. Des mesures de contrôle de la qualité sont inclus pour le dépannage et d’évaluer la variation expérimentale. Plus de 10 000 protéines dans des échantillons de mammifères peuvent être dosés en toute confiance avec ce protocole. Ce protocole peut également être appliqué à la quantification des modifications post traductionnelle avec des modifications mineures. Cette méthode multiplexée, robuste fournit un outil puissant pour l’analyse protéomique dans une variété d’échantillons complexes, y compris la culture de cellules, des tissus animaux et des échantillons cliniques humains.

Nous avons utilisé un mélange décrit précédemment hétérospécifique peptide d’analyser systématiquement l’effet du taux de compression en 3 étapes principales protocole, y compris pre-MS fractionnement, les paramètres de MS et correction de post-MS23. Le fractionnement de pre-MS a été évalué et optimisé en utilisant une combinaison de pH basique RPLC et pH acide RPLC. Post-MS analyse, seulement des peptides spécifiques ont été examinées. Nous avons utilisé ce modèle...

Nous présentons un protocole visant à quantifier avec précision les protéines avec étiquetage isobare, vaste fractionnement, outils bioinformatiques et mesures de contrôle de la qualité en combinaison avec la chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse à haute résolution.

Profilage de Proteome profonde en étiquetage isobare, vaste chromatographie en phase liquide, spectrométrie de masse et Quantification assistée par logiciel

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

L’objectif global de cette expérience est d’identifier et de quantifier avec précision plus de 10 000 protéines de lysat cellulaire ou tissulaire à travers différents traitements médicamenteux, évolutions temporelles ou conditions biologiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la médecine ou de la biologie, telles que les protéines qui changent en réponse à un médicament ou à un autre stimulus biologique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle a la capacité de quantifier avec précision plus de 70 % du protéome exprimé dans 10 conditions expérimentales différentes.L’implication de cette technologie peut être étendue au diagnostic des maladies humaines grâce à la découverte potentielle de biomarqueurs. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car la lyse cellulaire optimale et l’estimation des fluides jouent un rôle clé dans les procédures de digestion, de marquage et de séparation en aval. Pour commencer ce protocole, obtenez des cellules cultivées d’intérêt.Lavez les cellules deux fois avec 10 millilitres de PBS pour chaque lavage. Grattez et collectez les cellules lavées dans un tube de 1,5 millilitre conten

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Ici, nous décrivons une méthode robuste pour le fractionnement des membranes plasmiques de plantes en détergents solubles dans les membranes résistantes et de détergent à base d'un mélange de non marqué et in vivo entièrement 15 N étiquetés cultures de cellules d'Arabidopsis thaliana. La procédure est appliquée pour des études comparatives de la protéomique pour comprendre les processus de signalisation.

Marquage métabolique et la membrane de fractionnement pour comparative Analyse protéomique de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Cultures Suspension cellulaires

Stable marquage isotopique des peptides par diméthylation réductrice (étiquetage PENSER) est une stratégie rapide et peu coûteuse pour la protéomique masse précises la spectrométrie quantitatifs. Ici, nous démontrons une méthode robuste pour la préparation et l'analyse des mélanges de protéines à l'aide de l'approche de Redi qui peut être appliqué à pratiquement n'importe quel type d'échantillon.

Protéomique quantitative à l&#39;aide réductrice diméthylation pour les isotopes stables étiquetage

Des analyses approfondies des protéomes de cellules cancéreuses facilitent l’identification de nouvelles cibles médicamenteuses et de biomarqueurs diagnostiques. Nous décrivons un flux de travail expérimental pour l’analyse quantitative des (phospho-)protéomes dans des sous-populations de cellules cancéreuses dérivées de tumeurs liquides et solides. Ceci est réalisé en combinant des stratégies d’enrichissement cellulaire avec la spectrométrie de masse quantitative basée sur Super-SILAC.

Spectrométrie de masse quantitative de profilage Protéomes Cancer-cellulaires dérivées de liquide et de tumeurs solides

marquage isotopique de précurseur combiné et le marquage isobare (cPILOT) est une stratégie de protéomique quantitative qui améliore les capacités de multiplexage échantillon d'étiquettes isobares. Ce protocole décrit l'application de cPILOT aux tissus à partir d'un modèle de souris de la maladie d'Alzheimer et les contrôles de type sauvage.

Exemple amélioré Multiplexage de tissus à l&#39;aide combinée Precursor et étiquetage Isotopique isobarique Tagging (cPILOT)

Ici, nous présentons des protocoles pour la purification par affinité des complexes de protéines et leur séparation par PAGE native bleu, suivie par le profilage de corrélation de la protéine en utilisant le marqueur libre spectrométrie de masse quantitative. Cette méthode est utile pour résoudre interactomes dans des complexes protéiques distincts.

Résoudre les complexes protéiques purifiés par affinité de Blue native PAGE et le profilage de corrélation des protéines

Décrit est un workflow protéomique pour identifier des partenaires d'interaction de protéine d'une fraction subcellulaire nucléaire utilisant l'enrichissement d'immunoaffinité d'une protéine donnée d'intérêt et de la spectrométrie de masse sans étiquette. Le flux de travail comprend la fractionnement subcellulaire, l'immunoprécipitation, la préparation de l'échantillon assisté par filtre, le nettoyage hors ligne, la spectrométrie de masse et un pipeline de bioinformatique en aval.

Flux de spectrométrie de masse d'immunoprécipitation sans étiquette pour le profilage de l'interaction nucléaire à grande échelle

Nous présentons un protocole d’étiquetage optimisé de l’étiquette de masse en tandem (TMT) qui comprend des informations détaillées pour chacune des étapes suivantes : extraction de protéines, quantification, précipitations, digestion, étiquetage, soumission à une installation de protéomique et analyses de données.

Préparation de l’échantillon TMT pour la soumission des installations de protéomique et l’analyse subséquente des données

L’étiquetage isotopique combiné des précurseurs et le marquage isobarique (cPILOT) est une stratégie améliorée de multiplexage d’échantillons qui est capable d’augmenter le nombre d’échantillons qui peuvent être analysés simultanément avec les étiquettes isobariques disponibles. L’incorporation d’une plate-forme robotique a considérablement augmenté le débit expérimental, la reproductibilité et la précision quantitative.

Multiplexage automatisé de l’échantillon à l’aide de l’étiquetage isotopique combiné des précurseurs et du marquage isobarique (cPILOT)

Le protocole décrit fournit une analyse protéomique quantitative optimisée des échantillons de tissus à l’aide de deux approches : la quantification basée sur l’étiquette et la quantification sans étiquette. Les approches basées sur l’étiquette ont l’avantage d’une quantification plus précise des protéines, tandis qu’une approche sans étiquette est plus rentable et utilisée pour analyser des centaines d’échantillons d’une cohorte.

Flux de travail complet de protéomique des échantillons de tissus basée sur la spectrométrie de masse

L’oxydation des protéines thiols a des implications significatives dans des conditions physiologiques et physiopathologiques normales. Nous décrivons les détails d’une méthode quantitative de protéomique redox, qui utilise la capture assistée par résine, le marquage isobare et la spectrométrie de masse, permettant l’identification et la quantification spécifiques au site des résidus de cystéine oxydés de protéines de manière réversible.

Capture assistée par résine couplée à un étiquetage de masse en tandem isobare pour la quantification multiplexée de l’oxydation des protéines thiols

Découvrez la quantification protéique par étiquetage isobare TMT avec fractionnement et spectrométrie de masse haute résolution. Cette méthode permet d'analyser plus de 10 000 protéines pour la recherche en biomarqueurs.

Profilage de Proteome profonde en étiquetage isobare, vaste chromatographie en phase liquide, spectrométrie de masse et Quantification assistée par logiciel (Vidéo) | JoVE Journal

Profilage de Proteome profonde en étiquetage isobare, vaste chromatographie en phase liquide, spectrométrie de masse et Quantification assistée par logiciel

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