Name: Un In Vivo Duo-color méthode d’imagerie vasculaire dynamique après contusion médullaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Découvrez une méthode d'imagerie bicolore in vivo pour surveiller les changements vasculaires dynamiques après contusion médullaire chez le rat Sprague-Dawley. Cette technique permet d'évaluer les stratégies neuroprotectrices pour la réparation vasculaire précoce.

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Ce travail a été soutenu en partie par NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562 mérite examen prix I01 BX002356 du US Department of Veterans Affairs, Craig H Neilsen Foundation 296749, Indiana, la moelle épinière et Brain Injury Research Foundation ( ISCBIRF) Indiana State Department of Health (019919), des fonds de dotation Mari Hulman George.

Toutes les procédures de traitement chirurgical et animaux ont été effectuées tel qu’approuvé en vertu du Guide pour les soins et Use of Laboratory Animals (National Research Council) et les lignes directrices de l’Indiana University School of Medicine institutionnels Animal Care et l’utilisation Comité.
1. préparation chirurgicale
<ol>
	<li>Stériliser tous les instruments chirurgicaux, y compris le stabilisateur de la colonne vertébrale. Nettoyez la table d’opération chirurgicale et tous les alentours d’éthanol à 70 %. Pour la préparation de cette intervention chirurgicale sans survie, placez un coussin propre chirurgical sur le dessus un 37 ° C coussin chauffant.</li>
	<li>Utilisez six semaine vieux rat Sprague Dawley (SD) pour cette étude. Peser et anesthésier le rat avec une injection intrapéritonéale de kétamine (87,7 mg/kg) et mélange de xylazine (12,3 mg/kg). Confirmer la bonne étape de l’anesthésie lorsque l’animal cesse de répondre à un stimulus de pincée d’orteil. Injecter par voie sous-cutanée de 0,01 à 0,05 mg/kg de buprénorphine et de 5mg/kg carprofène avant la chirurgie.</li>
	<li>Raser le rat dans 2 régions : la région de la colonne cervicale sur le dos et la région du cou du côté maternel. Tamponner les zones de peau avec betadine scrub chirurgicale et lingettes d’alcool 70 %. Pommade oculaire pour prévenir la sécheresse oculaire pendant la chirurgie. Placer l’animal dans une position couchée sur le tampon propre chirurgical.</li>
</ol>
2. cathétérisme de la veine jugulaire externe
<ol>
	<li>Repérer la veine jugulaire externe en trouvant le point d’impulsion près de la clavicule et couper avec une paire de ciseaux de petit ressort à pratiquer une incision verticale sur le spot, qui est le point de croix de 3 points anatomiques : rame caudale de la mandibule droite, grand tubercule de l’humérus et le manubrium (Figure 1 a). Isoler le navire à l’aide de ciseaux de printemps et des pinces fines. Nouer l’extrémité distale avec 1 stériles pour sutures chirurgicales ligne (Figure 1)20.</li>
	<li>Préparez une seringue de 1 mL remplie de solution saline et relié à un cathéter spécialisé issu d’une aiguille de calibre 21 (Figure 1 b). Faire une petite incision à l’aide d’une paire de ciseaux micro sur le navire et faire glisser le cathéter dans le vaisseau.<ol>
		<li>Fixer l’aiguille en nouant les deux extrémités proximales et distales (Figure 1). Le cathéter spécialisé est issu d’une aiguille de calibre 21. Broyer la pointe plate et souder avec un morceau de 2 mm de la pointe coupée d’une autre aiguille de calibre 21. Cela peut empêcher le cathéter ne glisse à l’extérieur. 
		Remarque : Une petite quantité de sang qui coule dans l’aiguille indique que l’aiguille est entré avec succès dans un vaisseau sanguin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. colonne vertébrale stabilisation et laminectomie C5-C7
<ol>
	<li>Placer l’animal dans une position couchée. Couper la peau le long de la ligne médiane avec une lame de bistouri n ° 15 au niveau de la colonne vertébrale désiré. Disséquer les couches musculaires de la 5ème au 7ème vertèbre cervicale (C5-C7) sur le plan bilatéral pour exposer les faces latérales (Figure 2 a)21. 
	Remarque : Localiser la deuxième vertèbre thoracique (T2) en trouvant la pointe entre les omoplates. Compter vers le haut de la vertèbre T2 pour trouver le C7 vertèbre21,22,23,24.</li>
	<li>Stabiliser la colonne vertébrale du rat en utilisant un appareil stabilisateur modifié. Faire une fente sur les deux côtés de l’OS vertébral latéral. Faites glisser les bras en acier inoxydable sous les facettes exposés apophyse transverse et serrer les vis pour fixer la stabilité (Figure 2 b).</li>
	<li>Retirer délicatement les lamelles de C5-C7 (laminectomie, Figure 2).</li>
	<li>Placer un petit morceau de gélatine imbibé d’une solution saline sur le dessus de la dure-mère exposée pour le garder bien hydratée (Figure 2D).</li>
</ol>
4. installation de fenêtre d’imagerie biphotonique (2p)
<ol>
	<li>Trucs petits morceaux de gélatine dans l’écart entre les muscles et les os vertébrales, également farcir une fine ligne de gelfoam entre la moelle épinière et les os vertébrales, puis d’utiliser la colle tissu pour sceller les environs de muscle d’os. Attendre 5 min pour la dessiccation complète (Figure 2E). 
	Remarque : Cette étape empêche les saignements futurs dans la fenêtre et la perméabilité des solutions d’immersion.</li>
	<li>Préparer 4 % d’agar avec FD2O dans un four à micro-ondes. Une fois l’agar est complètement dissoute, attendez jusqu'à ce qu’elle renvoie à une température palpable. Remplir une seringue stérile 1 mL de solution d’agar et redirigez-le sur le bord de la fenêtre pour construire un mur (Figure 2E). La solution se solidifie rapidement et reste souple pour permettre l’objectif ou l’objectif de se déplacer librement.</li>
	<li>Lorsque vous êtes prêt pour l’imagerie, supprimer la gélatine et lieu du liquide d’immersion à l’intérieur de la fenêtre pour 2p imaging (Figure 2F). Transférer l’animal stabilisé à l’intérieur de la chambre noire de 2 photons microscope et placer la fenêtre d’imagerie 2p directement sous l’objectif. Abaisser délicatement la lentille dans la fenêtre d’imagerie.</li>
</ol>
5. injection de colorant Fluorescent première et imagerie de base
<ol>
	<li>Préparation de 0,5 mL de Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (poids moléculaire moyen de 4 mg/mL ~ 70kDa) dans une solution saline. Remplir une seringue stérile 1 mL de la solution et raccorder la seringue sur le cathéter installé précédemment. 
	Remarque : Préparation de la solution de colorant fluorescent avant utilisation est recommandée.</li>
	<li>Injecter le premier pigment en appuyant sur la seringue très lentement (Figure 3 b). Commencez par utiliser l’oculaire pour repérer la zone d’intérêt. Utiliser une caméra de dispositif couplé (DAC) de frais d’acquérir une image de lumineux-zone des modèles de surface des vaisseaux sanguins à plus faible grossissement comme une image de point de repère. Passer en mode numérisation laser puis ouvrez le 2p, logiciel pour la collecte de ces deux images d’imagerie et données de balayage de ligne.</li>
	<li>Choisir la bonne longueur d’onde de 2P laser excitation, la puissance et fluorescent canal (canal rouge pour le premier pigment) pour correspondre avec les fluorophores utilisés dans le tissu imagé et puis effectuer l’imagerie in vivo (Figure 3E). Garder l’animal sur un coussin chauffant pendant tout le processus.</li>
</ol>
6. C7 blessure contusion à l’aide du dispositif de LISA
<ol>
	<li>Effectuer une blessure de contusion de la ligne médiane C7 en utilisant un dispositif de Louisville blessure système appareil (LISA) selon un protocole établi précédemment25,26.<ol>
		<li>En bref, placez l’animal sur la scène de LISA après étalonnage.</li></ol></li></ol>Après avoir sélectionné un réglage du point zéro et ajuster le tissu déplacement (0,800 mm dans ce cas), cliquez sur le bouton de « Run Experiment » du logiciel pour déclencher la libération de l’élément de frappe et de créer le dommage.
		<li>Après la blessure, placez un autre petit morceau de gélatine imbibé d’une solution saline sur le dessus de la dure-mère exposée pour le garder hydratée.</li>
	
	
	<li>Répétez l’étape 4.3 et réexécuter l’imagerie in vivo sur la même zone visible avec le colorant rouge précédemment injecté (Figure 3 &#38; F).</li>
	<li>Transférer le dos animaux à la table d’opération chirurgicale et de garder l’animal sous sédation avec une anesthésie appropriée suivant le protocole IACUC-IUSM.</li>

7. injection de colorant Fluorescent deuxième et l’imagerie après l’accident
<ol>
	<li>Préparation de 0,5 mL de fluorescéine isothiocyanate-dextran (4 mg/mL, masse moléculaire moyenne ~ 70 kDa) dans une solution saline même comme en 5.1. Remplissez la solution dans une seringue stérile 1 mL et se connecter avec le cathéter installé précédemment.</li>
	<li>Transférer l’arrière animal stabilisé à l’intérieur de la chambre noire de microscope 2P et recréer l’image sur la même zone avec la couche rouge pour le premier pigment et la couche verte pour le deuxième colorant (Figures 3D &#38; G).</li>
	<li>À la fin de l’imagerie, libérer le rat de l’appareil de stabilisation rachidienne et nettoyer le mur de la gélose.</li>
</ol>
8. animal Sacrifice
<ol>
	<li>Après l’imagerie, sacrifier le rat suit le transcardial perfusion protocole27. Recueillir des échantillons de la moelle épinière et fixez-les dans 4 % PFA.</li>
</ol>
9. hors connexion Data Analysis : Quantification des diamètres de navire
<ol>
	<li>Transférer les fichiers d’image sur un poste de travail pour l’analyse hors ligne.</li>
	<li>Ouvrez ImageJ et sélectionnez « fichier » et ensuite choisir préalablement enregistré les données brutes et ouvrez le fichier image unique associée (Figure 4 b).</li>
	<li>Calibrer l’image en sélectionnant « Analyze » suivie de « Définir Scale » (Figure 4). La valeur placée dans « La Distance en pixels » est calculée à l’aide de l’équation affichée dans la Figure 4 a. L’étalonnage de 2 photons optique détermine la valeur par défaut dans l’équation. La valeur de « opticalZoom » se trouve dans Excel Extensible Markup Languagefile (fichier XML) associé au fichier image unique (Figure 4 b).</li>
	<li>Tracer une ligne perpendiculaire à l’axe longitudinal du bateau (Figure 41 &#38; E1) et sélectionnez « Analyser » suivie de « Mesure ». La mesure du diamètre des vaisseaux est affichée dans la fenêtre de résultats (Figure 42 &#38; E2). Répéter 3 fois sur le navire en vue d’acquérir de la valeur moyenne.</li>
</ol>
10. hors connexion Data Analysis : Quantification des globules rouges (RBC) Vitesse de cellules
<ol>
	<li>Transférer les fichiers de balayage linéaire à la station de travail pour l’analyse.</li>
	<li>Démarrez le logiciel ImageJ et sélectionnez « fichier » et ensuite choisir préalablement enregistré les données brutes et ouvrir tous les fichiers de balayage linéaire associé avec le nom de l’extension « .ome ».</li>
	<li>Ouvrez « Image » et sélectionnez « Piles » suivis par « images à empiler ». Convertir tous les fichiers de l’OME en fichier TIFF image unique pile.</li>
	<li>Démarrez le logiciel Matlab et cliquez sur « Ouvrir », sélectionnez le fichier de code « LSPIV_parallel.m ». Remarque : Le code Matlab pour LS-PIV peut être téléchargé à https://sourceforge.net/projects/lspivsupplement/files/18</li>
	<li>Sélectionnez les ordres suivants : « Exécuter » &#62; « Modifier le dossier » &#62; « artère ». Choisissez le fichier TIFF de pile image généré en 10.3.</li>
	<li>Tapez « Y » et appuyez sur entrée.</li>
	<li>Placer un curseur à gauche et à droite de l’image, respectivement, et le programme commence à traiter les données.</li>
	<li>À la fin du programme, entrez 2 valeurs pour calculer la lecture finale : « valeur de conversion de pixel_meter » et « valeur de conversion de balayage-temps ». Les deux se trouvent dans le fichier XML associé aux données de balayage linéaire. La valeur finale est exprimée comme la moyenne et l’écart de vitesse dans les unités du millimètre par seconde (mm/s).</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Un défi pour les études vasculaires à la suite de SCI est la limitation technique parce que les techniques traditionnelles sont en grande partie limités aux modifications de la structure vasculaire dans des échantillons post mortem. Ce roman en vivo imagerie méthode décrite ci-dessus permet de mesure dynamique de la circulation sanguine et de paramètres (diamètre vitesse et bateau) chez des rats vivants à l’aide de 2p-LSM. Il permet également l’examen répétée dans les mêmes jeux de navires à des moments différents après contusion Sci. Les techniques d’imagerie microscopie 2 photons précédentes ont été incapables de capturer les structures vasculaires post-traumatiques en raison de la fuite d’un traceur unique. Notre duo-couleur design permet une imagerie vasculaire dynamique pour les modèles traumatiques. En outre, la flexibilité de cette méthode permet de générer un profil temporelles et spatiales des changements vasculaires aigus suite Sci.
Il y a plusieurs étapes cruciales dans notre in vivo duo-color méthode d’imagerie. Tout d’abord, il est fondamental de s’assurer de la stabilité physique de la moelle épinière avant l’imagerie Time-lapse, particulièrement réduire les artefacts de mouvement respiratoire. Nous avons conçu la forme de la colonne vertébrale serre-joints pour augmenter la hauteur de la colonne vertébrale vertèbre légèrement au cours de la stabilisation. Ainsi le mouvement de la moelle épinière corréler à l’animal de respirer peut être considérablement réduite (Figure 1-F, 2 b). Il est recommandé de vérifier la stabilité de la moelle épinière avant le début de chaque séance d’imagerie. Si la moelle épinière ne parvient pas à atteindre la stabilité, l’ajustement devrait faire l’alignement et le serrage des colliers de serrage de la moelle épinière. Deuxièmement, périphérique tissus (OS, couche de muscle et la peau) saignements dans la fenêtre d’imagerie risque de contamination de la vue. Pour une session de formation image lisse, gelfoam et tissu colle doit être appliquée pour les tissus environnants pour une prévention efficace. Troisièmement, les colorants fluorescents que nous choisissons ont une taille similaire comme l’albumine (66 kDa), qui est la protéine du plasma sanguin principal haut poids moléculaire. Dans des conditions homéostatiques, les colorants ont été largement conservés à l’intérieur du navire similaire comme l’albumine,28. Après la blessure, les colorants traversaient la structure endothéliale perturbée et se sont échappés dans le parenchyme, causant une intensité de fluorescence une augmentation significative dans la zone périphérique du système vasculaire (Figure 3F-G). En outre, il y a deux raisons pour lesquelles nous choisir cathétérisme de la veine jugulaire externe. Tout d’abord, il peut fournir une route constamment accessible de livraison à tout moment de l’expérience. En second lieu, il peut être utilisé comme une voie pour l’injection de traitement futur.
Bien que notre méthode de duo-color in vivo est en mesure de fournir un nouveau lieu de rendez-vous pour les études d’imagerie vasculaires traumatiques, certaines réserves au sujet de cette technique doivent être abordées. Actuellement, cette technique vise à évaluer les changements vasculaires à 2 points dans le temps (base et 1 point de temps après l’accident), mais il est possible de passer à plusieurs points dans le temps, si les canaux et autres colorants fluorescents est disponibles. Il existe plusieurs études utilisant Vitre implanté pour l’imagerie intravitale chronique, aucun d’eux ne peut fournir de l’information de base sur le même navire après traumatisme19,29,30, 31,32. Contrairement à ces études, notre fenêtre est une fenêtre non-verre. C’est commode pour l’imagerie avant et après l’accident, mais il peut être difficile pour rétablir la fenêtre d’observation à long terme. Nos recherches futures travaille à l’amélioration technique d’imagerie chronique. Le système vasculaire est composé de plusieurs types de vaisseau (artère, veines et capillaires) et chacun est différent dans les aspects de la morphologie et la fonction. Différenciation entre les types de bateaux en imagerie pourrait aider à cerner une tendance claire des changements vasculaires. Le protocole ci-dessus dépend de l’observateur, indication des navires basés sur la morphologie et de la vitesse ; Toutefois, un colorant artère spécifiques peut être facilement ajouté pour donner une classification plus définitive entre types de navire33.
Cette technique est non seulement limitée aux évaluations sur contusion et autres modèles traumatiques, comme blessure par écrasement et rayonnements des blessures, mais également sur des études qui portent sur la perturbation des BSCB, perméabilité ainsi que vasculaire change. En plus de la SCI, il pourrait être utilisé pour étudier les changements vasculaires à la suite d’autres maladies neurodégénératives telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et de la sclérose en plaques (MS). En outre, il pourrait être transférable à un modèle animal transgénique pour étudier l’interaction dynamique neurovasculaire. Comme outil de dépistage puissant, les études futures pouvaient utiliser la technique d’imagerie décrite ici pour évaluer l’efficacité du traitement de la moelle épinière.
En conclusion, méthode de duo-color in vivo est un outil fiable et en temps réel, le in vivo approche pour évaluer les changements vasculaires dynamiques, ce qui est idéal pour la caractérisation du profil vasculaire temporelles et spatiales et de dépistage pour les traitements à réduire les dommages secondaires suite Sci.

Traumatismes de la moelle épinière (SCI) est une blessure courante menant à l’affaiblissement de la fonction de moteur, sensorielle et autonome. Selon le National moelle épinière lésions statistique Center (NSCISC) en 2016, environ 282 000 personnes ont été touchées alors que 69 % d'entre eux étaient principalement dus à des accidents de la circulation ou tombe1. Ces patients nécessitent souvent des soins intensifs ; Cependant, aucun traitement efficace n’est actuellement disponible. Par conséquent, les nouvelles stratégies efficaces vers SCI sont urgent.
SCI est principalement divisé en deux phases : lésions primaires et lésion secondaire. La lésion primaire comprend l’insulte physique provoquant une nécrose hémorragique au point d’impact2, suivie d’une série d’événements de lésion secondaire, telles que l’inflammation et l’apoptose des cellules démyélinisation des axones restants, qui conduisent progressivement l’expansion des déficits fonctionnels et morphologiques3,4,5,6. L’hémorragie est le premier signe visible de blessure, ce qui indique un perturbation vasculaire immédiat dans la phase aiguë de la SCI7,8. Une stratégie de neuroprotecteur vise à réduire les blessures vasculaires précoces pourrait améliorer la récupération des patients, mais cela requiert une meilleure compréhension du mécanisme physiopathologique des événements vasculaires précoces après l’accident.
Malgré des études antérieures à l’aide de diverses méthodes pour étudier la vascularisation de la moelle épinière, des limitations importantes demeurent. L’inconvénient plus partagé étudie que des échantillons post mortem, par exemple, de dégagement d’hydrogène9, autoradiographie,10, microangiogram8, corrosion vasculaire moulages11et immunohistochimie12 ,,13. Bien que la débitmétrie Doppler Laser assure un suivi en temps réel non invasive de la moelle épinière sang écoulement14, il est impossible de différencier les systèmes vasculaires et de détecter des changements morphologiques vasculaires. Dynamique contraste accentué IRM (IRM-DCE) est également non invasive, mais elle génère des images basse résolution et nécessite une infrastructure coûteuse15.
Bien qu' in vivo d’imagerie utilisant 2 photons laser microscopie (2p-LSM) a été développé pour l’étude de vasodynamics dans le cortex16,17,18, un nombre limité d’études ont démontré des changements vasculaires suite à une SCI. Tang et al. ont montré des changements dans la circulation sanguine au bord de l’emplacement de la lésion dans une hémisection modèle19, mais l’imagerie après qu’une blessure à la contusion est plus difficile pour deux raisons. Tout d’abord, une fenêtre optique en verre traditionnel sur le site de la lésion ne serait pas soutenir l’impact mécanique et restent fonctionnelle pour l’imagerie. Deuxièmement, les fuites de traceur dans le parenchyme dû à hémorragie crée des difficultés avec l’imagerie après l’accident.
Nous présentons ici une méthode d’imagerie roman duo-color, qui permet l’imagerie les navires individuels mêmes aux périodes avant et après l’accident. En outre, il fournit un profil temporelles et spatiales des changements dynamiques vasculaires, suite à une contusion Technol Il a également le potentiel pour l’imagerie à plusieurs moments après l’accident. Ce protocole peut être directement appliqué aux animaux transgéniques pour étudier les interactions neurovasculaires.

<table><tbody><tr><td>Purdue Products Betadine Surgical Scrub</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027132</td><td>Stérilisation cutanée</td></tr><tr><td>Kétamine (87,7 mg/kg)/Xylazine (12,3 mg/kg)</td><td>Patterson Veterinary&nbsp ;</td><td>07-881-9413, 07-890-5745</td><td>Agent anesthésique</td></tr><tr><td>Buprénorphine (0,03 mg/mL)&nbsp ;</td><td>Patterson Veterinary&nbsp ;</td><td>07-891-9756</td><td>Agent analgésique</td></tr><tr><td>Carprofène</td><td>Patterson Vétérinaire</td><td>07-844-7425</td><td>Anti-inflammatoire non stéroïdien</td></tr><tr><td>Éponges de gaze Dukal&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-490</td><td>Stérilisation cutanée</td></tr><tr><td>Decon Ethanol 200 Proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-450</td><td>Stérilisation</td></tr> cutanée <tr><td>Larmes artificielles Pommade oculaire</td><td>Webster Veterinary</td><td>07-870-5261&nbsp ;</td><td>Prévenir le dessèchement des yeux&nbsp ;</td></tr><tr><td>Applicateurs à pointe de coton</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>1006015</tr><tr><td>isothiocyanate de rhodamine B&ndash ; Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9379</td><td>Moyenne molaire en poids 70kDa</td></tr><tr><td>Isothiocyanate de fluorescéine&ndash ; dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46945</td><td>Stérilisateur d’instrument molaire moyen 70kDa</td></tr><tr><td></td><td>Outils scientifiques fins</td><td>18000-50</td><td>pour la stérilisation de l’outil de chirurgie</td></tr><tr><td>Ensemble de stabilisateur de colonne vertébrale</td><td>Fabriqué sur mesure par l’Institut</td><td></td> de neurosciences <td>Norton Contactez Y. Ping Zhang pour plus de détails. (yipingzhang50@gmail.com)</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M Produits de soins pour animaux</td><td>1469SB</td><td>Tissu adhésif Colle</td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Henry Schein</td><td>9083300</td><td>Arrêter le saignement</td></tr><tr><td>Noyes Ciseaux à ressort</td><td>F.S.T</td><td>15013-12</td><td></td></tr><tr><td>Pince fine - Dumont #5</td><td>F.S.T</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td>laminectomie</td></tr><tr><td>Écarteur chirurgical</td><td>Outils de science fine</td><td>17005-04</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>10003-12&nbsp ;</td><td>peau coupée</td></tr><tr><td>Lame de scalpel #15</td><td>Royal-Tek</td><td>BS2982</td><td>peau coupe</td></tr><tr><td>micro ciseaux inclinés</td><td>World Precision Instruments</td><td>500260</td><td>Peut provenir de n’importe quel fournisseur</td></tr><tr><td>3-0 sutures vicryl</td><td>Ethicon</td><td>J393H</td><td>Peut provenir de n’importe quel fournisseur</td></tr><tr><td>Suture non résorbable tressée noir de soie, 3-0, C-7, coupe inversée, 18 "</td><td>LOOK</td><td>786</td><td>Peut provenir de n’importe quel fournisseur</td></tr><tr><td>Seringue de 1 ml</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010.200.V0</td><td>Peut provenir de n’importe quel fournisseur</td></tr><tr><td>Aiguille de calibre 21</td><td>BD</td><td>305165</td><td>Peut provenir de n’importe quel fournisseur</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>Peut provenir de n’importe quel fournisseur</td></tr><tr><td>Microscope à balayage laser à deux photons</td><td>Microscopie</td><td></td><td></td>à fluorescence Bruker</tr><tr><td>Appareil LISA</td><td>Fabriqué sur mesure à partir de Norton Neuroscience Institute</td><td></td><td>Contactez Y. Ping Zhang pour plus de détails. (yipingzhang50@gmail.com)</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>HCImage Live</td><td>Hamamatsu Corporation</td><td></td><td>Logiciel d’imagerie</td></tr><tr><td>PrairieView</td><td>Prairie Technologies/Bruker</td><td></td><td>Logiciel d’imagerie à deux photons</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Logiciel d’analyse d’images</td></tr><tr><td>Matlab statistiques boîte à outils</td><td>The MathWorks, Inc.</td><td>https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitle</td><td>Logiciel d’analyse d’images</td></tr></tbody></table>

un in vivo duo-color méthode d’imagerie vasculaire dynamique après contusion médullaire

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

De la moelle épinière (SCI) provoque une perturbation vasculaire importante sur le site de lésion. Pathologie vasculaire se produit immédiatement après la SCI et se poursuit tout au long de la phase de lésions aiguës. En effet, les cellules endothéliales semblent être le premier à mourir après une SCI contondants. Les événements vasculaires précoces, notamment l’augmentation de la perméabilité de la barrière de sang-la moelle épinière (BSCB), induisent un oedème vasogénique et contribuent aux manifestations néfastes lésion secondaire causées par des mécanismes complexes de blessures. Ciblant les perturbations vasculaires, par conséquent, pourrait être une stratégie clé pour réduire les cascades de lésion secondaire qui contribuent à des déficiences histologiques et fonctionnelles après LMÉ. Des études antérieures ont été principalement effectuées sur des échantillons post mortem et étaient incapables de capturer les changements dynamiques du réseau vasculaire. Dans cette étude, nous avons développé une en vivo duo-color biphotonique méthode d’imagerie pour surveiller des changements dynamiques vasculaires aiguës après contusion Sci. Cette approche permet de détecter la circulation sanguine, le diamètre du vaisseau et autres pathologies vasculaires à divers endroits du rat même avant et après l’accident. Dans l’ensemble, cette méthode fournit une excellente occasion pour étudier la dynamique vasculaire.

La méthode est capable de surveiller en vivo spinal vasculaire changements dynamiques dans des récipients individuels SCI pré et post traumatique. Tout d’abord, un cathéter est installé via la veine jugulaire externe pour fournir l’accès pour les injections ultérieures de colorant fluorescent (Figure 1 a-C, Figure 3). Dans la deuxième étape, un appareil spécialisé est utilisé pour stabiliser les exposés C5-C7 (Figure 1-F, Figure 2 a-B). Cette étape de stabilisation peut éliminer les artefacts respiratoires et fournir régulière d’imagerie. Après laminectomie (Figure 2), la prochaine étape est l’installation de 2p imagerie fenêtre sur C5-C7 (Figure 2D-F). Minimisant les tissus périphériques autour de la fenêtre d’imagerie de la colonne vertébrale est critique pour l’imagerie vasculaire réussie. L’étape suivante est d’injecter le colorant fluorescent rhodamine-dextran (rouge) via le cathéter susmentionné au point de repère et de la carte du réseau vasculaire sous la ligne de base (Figure 3 a-B, E). Après C7 midline contusion blessure avec sévérité modérée, FITC-dextran (vert) est ajoutée aux points de l’heure après l’accident (Figure 3 a &amp; D). La beauté de la méthode de duo-color, c’est que l'on peut encore détecter la structure vasculaire en utilisant le deuxième colorant lorsque le premier pigment a déjà coulé dans le parenchyme en raison de la blessure (Figure 3).
Au cours de la séance d’imagerie, il est conseillé de garder l’animal sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle après l’induction de l’anesthésie.
En utilisant notre méthode de duo-color, la vitesse de diamètre et de globules rouges (RBC vitesse) des navires individuels peut être mesurée et calculée. Pour le diamètre, on peut utiliser ImageJ pour mesurer le navire à son plus grand diamètre pour 3 répétitions après calibration (Figure 4). Pour la vitesse, images de balayage linéaire sont évalués en utilisant Matlab programme (MATLAB R2013a) pour calculer la RBC vitesse (Figure 5)18. Basé sur la morphologie, la vitesse d’écoulement de sang et le diamètre des vaisseaux, les navires peuvent être classés en 2 catégories : artère et la veine (voir tableau 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig1.jpg"> 
Figure 1 . Veine jugulaire stabilisation de cathétérisme et la colonne vertébrale. (A) un schéma pour localiser la veine jugulaire externe. (B) le cathéter spécialisé issu d’une aiguille de calibre 21. La pointe était sol plat et soudé avec un morceau de 2 millimètre pointe coupée d’une autre aiguille de calibre 21. (C) un diagramme schématique du cathétérisme. L’extrémité distale est ligaturée tout d’abord, suivie de stabilisation cathéter proximal, qui se termine par la fixation de l’aiguille ainsi que le navire (ligature de navire, pointes de flèches bleues). (D) une image du stabilisateur mis à jour le rachis. Une fenêtre de C5-C7 avant une laminectomie (E) et après laminectomie et contusion SCI (F) s’affiche. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig2.jpg"> 
Figure 2 . Diagramme schématique d’installation fenêtre optique étape par étape. (A) étape 1 : exposer la vertèbre par coupe peau et des muscles le long de la ligne médiane. (B) étape 2 : stabilisation de la colonne vertébrale. (C) étape 3 : laminectomie. (D) étape 4 : maintenir l’humidité de la moelle épinière en plaçant un morceau de gelfoam imbibé d’une solution saline. (E) étape 5 : sceller les lacunes avec gélatine stérile et vetbond. Après séchage, une couche de gélose paroi repose sur le bord de la fenêtre. (F) étape 6 : lorsque vous êtes prêt pour l’imagerie, retirer le liquide d’immersion gelfoam et place à l’intérieur de 2p fenêtre d’imagerie. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig3.jpg"> 
Figure 3 . Le en vivo duo-color méthode procédure étape par étape. L’ensemble de la procédure se compose de 5 étapes (A). Après l’étape 1 et étape 2, une paire de traceurs dextran avec une taille d’environ 70 KDa sont injecté dans la séquence d’étiqueter la vascularisation de la moelle épinière avant (),B et C) et après contusion SCI (D). (E)-(G) images représentatives de 2p afficheront la vascularisation de la moelle épinière à l’étape 3 à l’étape 5. Flèches blanches pointent vers la première vague teinture rouge qui fuient les zones (F et G), des pointes de flèche turquoises affichent fuite deuxième vague colorant vert (G). Echelle = 50 µm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig4.jpg"> 
Figure 4 . Acquisition et quantification des diamètres de navire de la colonne vertébrale. Après préparation, fichiers image unique sont acquis en microscopie de P 2, ainsi que les fichiers XML des valeurs calibrés (B). (A) l’équation affiche le calcul de « pixel par micron », basé sur les valeurs de zoom optique. Après calibration dans ImageJ (C), diamètres de navire sont mesurées en 3 points dans l’ensemble de l’axe longitudinal avant (D1) et après (E1) des blessures. (D2) et (E2) afficher les valeurs mesurées. (F) Quantification des diamètres de navire au départ et 30 min après l’accident. Barre d’échelle = 50 µm. les données sont présentées comme moyenne ± écart-type, *** p &lt; 0,0001, test t apparié à deux queues.<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56565/56565fig5.jpg"> 
Figure 5 . Acquisition et quantification de la vitesse du navire la colonne vertébrale. Ligne-analyser les fichiers image sont acquis en vertu de la microscopie P 2 pour calculer les vitesses de bateau isolé. (A) un exemple d’un vaisseau sélectionné et la méthode pour évaluer la vitesse des vaisseaux sanguins RBC. (B) un exemple artériel d’image de balayage linéaire et fichier de tracé correspondante pour le calcul de la vitesse, ainsi un exemple d’une veine (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56565/56565fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Artère</td>
			<td>Veine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morphologie</td>
			<td>Paroi droite, lisse, épaisse</td>
			<td>Branches, bords rugueux</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitesse d’écoulement de sang</td>
			<td>Rapide</td>
			<td>Lent mais varie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamètre</td>
			<td>30-80 µm</td>
			<td>100-250 µm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Critères d’identification des Types de bateaux

Nous introduisons une in vivo utilisant deux fluorochromes différents pour suivre la dynamiques changements vasculaires de la colonne vertébrale suite à une contusion médullaire chez les rats Sprague-Dawley adultes de méthode d’imagerie.

Un In Vivo Duo-color méthode d’imagerie vasculaire dynamique après contusion médullaire

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

L’objectif global de cette méthode d’imagerie bicolore à deux photons in vivo est de surveiller les changements aigus de la dynamique vasculaire spinale qui se produisent à la suite d’une lésion contusive de la moelle épinière. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur l’impact de ces changements vasculaires dynamiques sur la progression pathologique et les déficits fonctionnels qui se produisent après une lésion de la moelle épinière. Le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques traditionnelles utilisant des échantillons promodernes est qu’elle fournit des preuves de la dynamique vasculaire aiguë des lésions de la moelle épinière chez un animal vivant.Les implications de cette technique s’étendent au traitement des lésions de la moelle épinière, car cette méthode nous permet d’examiner des stratégies neuroprotectrices potentielles visant à une réparation vasculaire précoce. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode d’imagerie bicolore lorsque nous avons découvert que l’injection séquentielle de couleurs de fluorescence contrastées nous permet de visualiser les vaisseaux perturbés après une lésion de la moelle épinière. Avant de commencer l’intervention, confirmez le niveau de sédation approprié par l’absence de réponse au pincement des orteils d’un rat Sprague Dawley femelle de six semaines, suivi d’une injection sous-cutanée d’analgésique et d’un agent anti-inflammatoire.Rasez le rat dans la région de la colonne cervicale et dans la région du cou du côté de la poitrine de l’animal, et frottez la peau exposée avec un gommage chirurgical à la bétadine et des lingettes alcoolisées à 70 %. Appliquez de la pommade sur les yeux de l’animal et placez le rat en position couchée sur un tampon chirurgical stérile au-dessus d’un coussin chauffant à 37 degrés Celsius sous un microscope stérile. Trouvez le point de pouls près de la clavicule pour localiser la veine jugulaire externe et utilisez une paire de petits ciseaux à ressort stériles pour faire une incision verticale à l’intersection de la branche caudale de la mandibule droite, du grand tubercule de l’humérus et du manubrium.Utilisez les ciseaux à ressort et la pince fine pour isoler le vaisseau jugulaire, et utilisez une ligne de suture chirurgicale stérile pour ligaturer l’extrémité distale du vaisseau. Ensuite, utilisez une paire de micro-ciseaux pour faire une petite incision dans la paroi du vaisseau et glissez un cathéter spécialisé fabriqué à partir d’une aiguille de calibre 21 attachée à une seringue d’un millilitre remplie de solution saline dans le récipient. Si une petite quantité de sang pénètre dans l’aiguille, l’insertion a réussi.Fixez l’aiguille à ses extrémités proximales et distales. Pour stabiliser la colonne vertébrale, mettez l’animal en position couchée et utilisez une lame de scalpel numéro 15 pour couper la peau le long de la ligne médiane aux niveaux de colonne vertébrale souhaités. Localisez la deuxième vertèbre thoracique par la pointe entre les omoplates et comptez vers le haut à partir de T2 pour trouver la vertèbre C7.Disséquez les couches musculaires de la cinquième à la septième vertèbre cervicale de manière bilatérale pour exposer les facettes latérales et faites une fente des deux côtés de l’os vertébral latéral. Faites glisser les bras en acier inoxydable d’un appareil de stabilisation modifié sous les facettes transversales exposées du processus et serrez les vis pour stabiliser la colonne vertébrale. Ensuite, retirez soigneusement les lames C5 à C7 et placez un petit morceau de mousse de gel imbibée de sérum physiologique sur la dure-mère exposée pour la maintenir hydratée.Pour créer la fenêtre d’imagerie à deux photons, placez de petits morceaux de mousse de gel dans l’espace entre les muscles et les os vertébraux et une fine ligne de mousse de gel entre la moelle épinière et les os vertébraux. Scellez ensuite la zone musculaire environnante avec de la colle adhésive pour tissus. L’étape la plus critique dans la préparation d’une fenêtre d’imagerie réussie est de s’assurer qu’il n’y a pas de saignement mineur à l’intérieur de la fenêtre.Après avoir laissé sécher la colle pendant environ cinq minutes, remplissez une seringue stérile d’un millilitre avec de l’agar chaud à 4 % et distribuez un mur d’agar le long du bord de la fenêtre. La gélose se solidifiera rapidement tout en restant souple. Pour obtenir une image de base, retirez d’abord la mousse de gel et ajoutez du liquide d’immersion à l’intérieur de la fenêtre.Placez l’animal stabilisé dans la chambre noire du microscope à deux photons avec la fenêtre d’imagerie à deux photons directement sous un objectif à faible grossissement, et abaissez soigneusement l’objectif dans la fenêtre. Remplissez une seringue stérile d’un millilitre avec 0,5 millilitre de solution d’isothiocyanate de dextran de rhodamine B fraîchement préparée et connectez la seringue au cathéter. Appuyez très lentement sur le piston pour délivrer le colorant à l’aide de l’oculaire afin d’identifier la zone d’intérêt, et utilisez une caméra à dispositif à couplage de charge pour acquérir une image en champ clair repère des motifs des vaisseaux sanguins de surface.Ensuite, ouvrez le logiciel d’imagerie à deux photons pour mettre l’alimentation et sélectionner la longueur d’onde d’excitation laser appropriée. Sélectionnez ensuite la puissance laser à deux photons, le niveau HV et le canal fluorescent appropriés qui correspondent à l’expérience de fluorophore injecté et imagez le tissu à travers la fenêtre d’imagerie pour collecter à la fois les images et les données de balayage linéaire. Pour introduire la lésion de contusion médiane C7, placez le rat sur un appareil Louisville Injury System Apparatus et sélectionnez un réglage de 0 point.Ajustez ensuite le déplacement des tissus et cliquez sur exécuter l’expérience pour déclencher l’impact ou le relâchement créant la blessure. Ensuite, placez un petit morceau de mousse de gel imbibée de solution saline sur la dure-mère exposée pour la maintenir hydratée et ouvrez de nouvelles images à travers la fenêtre d’imagerie en utilisant les mêmes paramètres d’imagerie. Transférez l’animal dans la chambre noire et injectez 0,5 millilitre de fluorescéine isothiocyanate dextran fraîchement préparé dans le cathéter.Ensuite, retournez l’animal dans la chambre noire du microscope et obtenez des images dans les deux canaux fluorophores. L’injection de colorant fluorescent à la rhodamine dextran permet la capture d’une image de repère pour la cartographie du réseau vasculaire au départ. Après la génération d’une lésion contusive médiane C7 modérément sévère, l’introduction de FITC-dextran facilite la détection de la structure vasculaire après une fuite induite par la lésion du premier colorant dans le parenchyme environnant.L’imagerie du vaisseau avant et après la blessure permet également de quantifier les changements dans le diamètre du vaisseau et la réponse à la blessure, ainsi que les changements dans la vitesse des globules rouges avant et après la blessure à travers les vaisseaux à calculer. Ensemble, ces données peuvent être utilisées pour classer les vaisseaux imagés comme des veines ou des artères. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’éviter les artefacts respiratoires visibles et d’essayer de limiter tout saignement mineur dans la fenêtre d’image.Cette procédure peut également être effectuée sur des animaux transgéniques pour répondre à des questions supplémentaires sur les interactions neurovasculaires qui se produisent après une lésion de la moelle épinière. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser la microscopie à deux photons pour surveiller les changements dynamiques vasculaires aigus après une lésion contusive de la moelle épinière chez un animal vivant.

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Une nouvelle préparation ex vivo pour l'imagerie de la moelle épinière de souris. Ce protocole permet l'imagerie à deux photons d'interactions cellulaires vivants tout au long de la moelle épinière.

Deux photons Imaging of Cellular Dynamics dans la moelle épinière de souris

La photothrombose est une procédure peu invasive et hautement reproductible pour induire une ischémie focale dans la moelle épinière et sert de modèle de lésion de la moelle épinière chez la souris.

Photothrombosis induite par ischémie focale comme un modèle de lésion médullaire chez la souris

Ici nous présentons une combinaison de laser Doppler l’imagerie de perfusion (LDPI) et laser Doppler perfusion surveillance (LDPM) pour mesurer la colonne vertébrale du cordon débits sanguins locaux et la saturation en oxygène (SO2), ainsi qu’une procédure normalisée pour l’introduction de la moelle épinière traumatisme chez le rat.

À l’aide de Laser Doppler d’imagerie et de surveillance pour analyser la Microcirculation de la moelle épinière chez le Rat

La microcirculation de la moelle épinière joue un rôle central dans les lésions de la moelle épinière. La plupart des méthodes ne permettent pas d’évaluer en temps réel la microcirculation de la moelle épinière, ce qui est essentiel pour le développement de thérapies ciblées par microcirculation. Ici, nous proposons un protocole utilisant des sondes Laser-Doppler-Flow Needle dans un grand modèle animal d’ischémie/reperfusion.

Évaluation en temps réel de la microperfusion de la moelle épinière dans un modèle porcin d’ischémie/reperfusion

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) permet une imagerie sans étiquette des biomolécules en fonction de leur vibration intrinsèque de liaisons chimiques spécifiques. Dans ce protocole, la configuration instrumentale d’un SRS intégré et d’un microscope à fluorescence à deux photons est décrite pour visualiser les structures cellulaires dans la moelle épinière de souris vivantes.

In vivo Imagerie de tissus biologiques avec fluorescence combinée à deux photons et microscopie à diffusion Raman stimulée

Découvrez une méthode d'imagerie bicolore in vivo pour surveiller les changements vasculaires dynamiques après contusion médullaire chez le rat Sprague-Dawley. Cette technique permet d'évaluer les stratégies neuroprotectrices pour la réparation vasculaire précoce.

Un In Vivo Duo-color méthode d’imagerie vasculaire dynamique après contusion médullaire

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