Name: Évaluation des effets de médicaments à base d’anticorps murins de la moelle osseuse et d’Activation des macrophages péritonéaux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Découvrez comment évaluer l'activation anti-inflammatoire des macrophages par des médicaments à base d'anticorps chez la souris. Cette méthode permet d'étudier les réponses des macrophages de la moelle osseuse in vitro et des macrophages péritonéaux in vivo.

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L.K. est le lauréat de l’Université de la Colombie-Britannique 4 ans (4YF) bourse d’études supérieures bourse. L.M.S. bénéficie d’une Association canadienne de gastro-entérologie / maladie de Crohn et la colite Canada / nouveau salaire de chercheur des IRSC Award et est un chercheur biomédical de la Michael Smith Foundation for Health Research. Ce travail a été soutenu par une subvention de projet de la société canadienne du sang, en collaboration avec les instituts de recherche en santé (# CIHR2016-LS de subventions).

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de la Colombie-Britannique.
1. moelle osseuse Macrophage dérivation et Activation avec des anticorps
<ol>
	<li>Effectuer à l’aide de CO2 asphyxie l’euthanasie.<ol>
		<li>Souris de place dans la chambre de l’induction. Euthanasier la souris avec l’anesthésie isoflurane 5 %, pour les 60-90 s, jusqu'à ce qu’immobile et respiration sont lente et profonde.</li>
		<li>Désactiver l’anesthésie isoflurane et administrer les 6-8 L/min de CO2 jusqu'à ce que la souris a cessé de respirer. Laisser souris avec CO2 pendant au moins encore pendant 5 min. vérifier qu’il n’est plus un rythme cardiaque ou la respiration. Effectuer une dislocation cervicale pour s’assurer de la mort. NOTE : 8-12 semaines souris âgées offrent le rendement le plus élevé des macrophages.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pulvériser des pattes de souris avec l’éthanol à 70 % et les épingler avec bras et jambes allongés en décubitus dorsal sur un panneau de mousse. Avec les ciseaux et pinces pour tenir la peau, faites une coupe peu profonde (0,2 cm) pour enlever la peau et la fourrure de la surface de chacune des pattes. Remarque : Effectuez cette procédure et toutes les manipulations de culture de tissus dans une hotte stérile.</li>
	<li>Coupez le muscle pour rendre les tibias et fémurs visible. Supprimer les tibias et fémurs, en coupant les os et les muscles juste en dessous de l’articulation de la hanche et au-dessus des chevilles. Coupez autant musculaire que possible.</li>
	<li>OS de pulvérisation avec l’éthanol à 70 % et attendre 1 min pour qu’il puisse s’évaporer, puis placez-les dans une assiette bien 6 du milieu RAS OS (Iscove modifié de Dulbecco (IMDM), 10 % sérum fœtal (SVF)).</li>
	<li>Coupez les extrémités des os en coupant 0,1 cm d’os de la cheville et le haut du fémur afin que la cavité de l’OS est exposée. Veiller à ce que la moelle est visible et une aiguille de 26 calibre peut être placée dans la cavité osseuse.</li>
	<li>Couper les os et les muscles pour séparer les tibias et fémurs de l’articulation du genou. Insérer une aiguille de 26 calibre attachée à une seringue de 10 mL dans la cavité. Rincer la moelle osseuse dans un tube conique de 50 mL par 5 mL d’OS niveau moyen. Rincer les deux tibias et deux fémurs, d’une souris, dans chaque tube de 50 mL.</li>
	<li>Pipetter monter et descendre plusieurs fois ou vortex la moelle à une vitesse lente pour disperser doucement les touffes. Chaînes de moelle devraient être divisées en taches légères (moins de 0,5 mm) de la moelle osseuse. Remplir le tube conique à 50 mL avec une ossature moyenne fleur. Contenu de la pipette du tube conique dans une culture de tissu de2 cm 75 traités fiole et incuber à 37 ° C, 5 % de CO2 pendant 1 h. NOTE : Mature macrophages et cellules mésenchymateuses deviendront adhérentes au ballon et être mis au rebut, tandis que les progéniteurs hématopoïétiques souhaités restent en suspension.</li>
	<li>Pipetter, au milieu des progéniteurs hématopoïétiques dans un tube conique de 50 mL. Centrifuger le tube à 300 x g à température ambiante pendant 5 min. jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 5 mL de stimulant de milieu de culture de facteur (MCSF) des colonies de macrophages (IMDM, 10 % FBS, 5 ng/mL MCSF, 100 U/mL de pénicilline/streptomycine et 150 μM Monothioglycerol (MTG)).</li>
	<li>Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre18. Ajouter le support pour remettre en suspension les cellules à une concentration de 0,5 x 106 cellules/mL, 1. 5 x 107 cellules/flacon de 30 mL de milieu et Pipeter monte et descend doucement. Pipetter 30 mL de la suspension dans un flacon de culture de tissus traité nouveaux 75 cm2 .</li>
	<li>Les jours 4 et 7 après culture initiale à l’étape 1.9, vérifiez que les cellules sont adhérentes et légèrement ramifiées à l’aide d’un microscope à champ lumineux contraste de phase inverse. Jeter le support contenant les cellules non adhérentes. Laver les cellules avec IMDM une fois et ajouter 30 mL de milieu de culture MCSF.</li>
	<li>Quand les cellules sont matures, 10e jour (&#62; 95 % positive pour F4/80 et Mac-1), vérifiez à nouveau que les cellules sont adhérentes et légèrement.</li>
	<li>Plaque de cellules pour les stimulations, enlever le milieu de culture du flacon et ajoutez 8 mL de tampon de dissociation enzymatique cellulaire gratuit, basé sur EDTA (Table des matières). Incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C, 5 % de CO2.</li>
	<li>Grattez doucement, cellules avec une petite quantité de pression, à l’aide d’un grattoir de cellules stériles. Vérifier au microscope des cellules ont détaché de la surface du ballon. Pipetter cellules dissociées dans un tube conique de 50 mL. Rincer le ballon 3 fois avec 5 mL d’IMDM et piscine la solution de rinçage avec les cellules qui ont été récoltés. Centrifuger de cellules à 300 g à température ambiante pendant 5 min.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 3 mL de milieu de culture MCSF par tube conique de 50 mL. Compter les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre18. Remettre en suspension les cellules à une concentration de 1 x 106 cellules/mL et la plaque de 100 μl de suspension cellulaire (1 x 105 cellules/puits) / puits d’une culture de tissu de 96 puits traitée, plaque de fond plat. NOTE : OS d’une souris vont générer suffisamment de cellules pour 100 puits. Si vous le souhaitez, 1 mL de cellules peuvent être plaqué dans une plaque de 6 puits (culture de tissus traités, plat en bas). Un plus grand nombre de cellules (1 x 106 cellules) peut être utile pour l’analyse par transfert western.</li>
	<li>Une fois adhérent, stimuler les puits en doubles ou en triple chaque 10 ng/ml de LPS chez IMDM, 30 mg/mL d’IgIV, ou IgIV + LPS. Doses de LPS ou IVIg peuvent être titrés afin d’optimiser l’intervention. Laissez les puits en doubles ou en triple comme témoins non stimulés. Les incuber pendant 24 h (37 ° C, 5 % de CO2). NOTE : Re-plaqués cellules devraient adhérer aux puits de culture de tissus moins de 1 h.</li>
	<li>Recueillir les surnageants de cellule de chaque puits dans des tubes de microcentrifuge individuels 1,7 mL et enlever les particules en tournant à 10 000 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Supprimer la cellule surnageante et éviter de déranger le culot. Placez la cellule clarifiée surnageant dans un tube de microcentrifuge stérile. Remarque : Surnageants de cellule peuvent être essayés pour les cytokines IL-10 et sous-unité cytokine IL-12 / 23p 40, par dosage immunoenzymatique (ELISA) immédiatement, ou conservés à-80 ° C à long terme. Suivre le protocole de ELISA Kit disponible dans le commerce (Table des matières). Autres cytokines pro-inflammatoires peuvent être dosés, tels que l’IL-6 et TNF, car ils sont également réduits par cotraitement avec IVIg + stimulation du LPS par rapport à la stimulation avec le LPS seuls. Après la stimulation, les cellules adhérentes peuvent être préparés pour des techniques telles que le western blot ou polymérase quantitative PCR (Q-PCR) 19,20.</li>
</ol>
2. contester souris In Vivo avec IVIg et récolte des Macrophages péritonéaux
<ol>
	<li>Peser chaque souris.</li></ol>Calculer le volume d’IgIV (concentration de stock de 100 mg/mL) nécessaire pour fournir une dernière dose de 2,5 g/kg de poids corporel pour chaque souris. Remarque : par exemple, pour une souris de 20 g, 500 µL d’IgIV est requise.
	<li>Tirage au sort le montant requis d’IgIV dans une seringue stérile 1 mL muni d’un 26 stérile aiguille de calibre. Pour les souris témoins qui ne recevront pas d’IgIV, administrer un volume équivalent de dose de salin stérile tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4 au lieu de l’IGIV.</li>
	<li>Scruff la souris d’une main en saisissant sa peau à l’arrière du cou avec votre pouce et votre index et en tenant sa queue et les pattes avec les doigts restants. Incliner son corps vers le sol.</li>
	<li>Placer l’aiguille à un angle de 30-40° par rapport au ventre de la souris, dans le quadrant inférieur droit, biseau vers le haut, puis insérez de 1,5 cm de l’aiguille. Injecter par voie intrapéritonéale l’IGIV ou PBS. Attendre 1 h.</li>
	<li>Euthanasier souris avec 5 % isoflurane anesthésie suivie d’asphyxie de 6-8 L/min CO2 (voir étapes 1.1.1 - 1.1.2), ou selon les lignes directrices éthiques de l’institution.</li>
	<li>Épinglez la souris à un panneau de mousse, avec des branches étalées. Vaporiser les pièces avec l’éthanol à 70 %. Remarque : Effectuez la procédure sous une hotte stérile.</li>
	<li>Faites une coupe peu profonde dans la peau (0,2 cm) avec des ciseaux le long de la ligne médiane de la souris, pour éviter de couper la cavité péritonéale. Tirez la peau abdominale de ventre de la souris à l’aide de pinces, afin que la muqueuse de la paroi péritonéale intacte n’est visible.</li>
	<li>Remplissez une seringue de 5 mL par 5 mL de PBS stérile (pH 7,4). Insérer un 25 ou 27 jauge aiguille dans la partie supérieure de la cavité de gauche ou à droite vers le centre de la souris avec le biseau de l’aiguille vers le haut. Remarque : Placez délicatement l’aiguille chez la souris afin que vous n’injectez pas de PBS dans les organes, mais plutôt dans l’espace péritonéal.</li>
	<li>Pousser le liquide dans la cavité péritonéale. Retirez l’aiguille de la cavité et massage du péritoine pour 10 s pour déloger les cellules. Introduire l’aiguille dans la partie supérieure de la cavité et éviter les organes. Collecter et placer le liquide de lavage récupéré dans un tube conique 15 mL sur la glace. Remarque : Pour chaque 5 mL de liquide injecté, environ 3,75 mL seront récupéré.</li>
	<li>Répéter l’injection et la récupération (étapes 2,8 et 2,9) 3 plusieurs fois (injection total volume de 20 mL), de récupérer 15 mL de liquide de lavage au total. Recueillir le lavage de chaque souris dans un tube conique distinct de 15 mL. Remarque : Après la dernière injection, il peut être plus facile à extraire le liquide sur les côtés loin gauche et droite de la souris, où le liquide s’est accumulée. Les organes entraîne moins d’interférences avec l’aiguille à cette position.</li>
	<li>Faire tourner les cellules vers le bas à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C. Remettre en suspension les cellules de 500 μl de milieu de placage (IMDM, 10 % FBS et 100 U/mL de pénicilline/streptomycine) par souris vidée. Compter les macrophages viables à l’aide d’un hémocytomètre18. Remarque : Les macrophages sera légèrement plus grands que les autres cellules péritonéales. Rendement typique est de 5 x 105 - 1 x 106 macrophages/souris à l’aide d’une souris C57BL/6 de type sauvage. Facultatif : Si un grand nombre de globules rouges est présent dans le culot cellulaire, exécuter une étape de lyse pour les supprimer, en utilisant le tampon de lyse des globules rouges 1 x conformément aux instructions du fabricant.</li>
	<li>Remettre en suspension des cellules dans un milieu à 1 x 106 macrophages/mL de placage et blanc sur plaque de 100 μL / puits dans une plaque de culture de tissus traitée de fond plat de 96 puits. Remarque : Il peut être nécessaire au pool de cellules de la souris pour une expérience si vous utilisez plus d’un triple puits ou titration stimulants. Par exemple, si une souris avait 5 x 105 macrophages, 500 μL d’électrodéposition moyen serait nécessaire. Il y aurait suffisamment de cellules pour 5 puits ou 1 expérience en double exemplaire, avec une seule dose de LPS.</li>
	<li>Incuber les cellules pendant 1 h à 37 ° C, 5 % de CO2 pour permettre des macrophages devenir adhérent. Les cellules adhérentes sont les macrophages péritonéaux. Supprimer les surnageants de cellules et les cellules non adhérentes. Rincer les puits deux fois avec 200 μL IMDM (préalablement chauffé à 37 ° C), attendre 10 s et inclinez lentement la plaque. Remplacer le milieu de l’électrodéposition. Incuber les cellules à 37 ° C, 5 % CO2 pendant 30 min avant la stimulation.</li>
	<li>Stimuler les macrophages 10 ng/ml de LPS chez IMDM ou laissez non stimulées, comme un contrôle. Incuber pendant 24 h, collecter et clarifier les surnageants de la cellule (voir étapes 1.16-1.17) pour l’analyse de cytokines IL-10 par ELISA. Suivre le protocole de ELISA Kit disponible dans le commerce (Table des matières). NOTE : Après stimulation, les cellules adhérentes peuvent être préparés pour des techniques telles que la tache occidentale ou PCR.</li>

3. attaque la souris in Vivo les IgIV + LPS et récolte des Macrophages péritonéaux
<ol>
	<li>Peser chaque souris. Calculer le volume d’IgIV (concentration de stock de 100 mg/mL) nécessaire pour fournir une dernière dose de 2,5 g/kg de poids corporel. Calculer le montant de LPS (concentration stock 100 μg/mL en IMDM) nécessaire pour fournir une dernière dose de 0,2 μg/g de poids de corps. Remarque : par exemple, pour une souris de 20 g, 500 µL de solution mère de l’IGIV et 40 μL d’une solution de 100 μg/mL de LPS sont requises.</li>
	<li>Dessiner la quantité requise d’IgIV et LPS dans une seringue stérile 1 mL muni d’un 26 stérile aiguille de calibre. Pour les souris témoins qui ne recevront pas d’IgIV, remplacez un volume équivalent d’IgIV par PBS stérile pH 7,4.</li>
	<li>Scruff la souris d’une main en saisissant sa peau à l’arrière du cou avec votre pouce et votre index et en tenant sa queue et les pattes avec les doigts restants. Incliner son corps vers le sol.</li>
	<li>Place de l’aiguille à un angle de 30-40° par rapport au ventre de la souris, dans le quadrant inférieur droit, biseau vers le haut et insérez de 1,5 cm. injecter l’IVIg LPS, ou PBS + LPS, par voie intrapéritonéale comme à l’étape 2.4.</li>
	<li>Après 1h, récolter des macrophages péritonéaux en procédant comme 2.5-2.10.</li>
	<li>Faire tourner les cellules vers le bas à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C. Prélever 1 mL de liquide de lavage récupéré et utiliser pour l’IL-10 et d’IL-12 / 23p 40 analyses par ELISA conformément aux instructions du fabricant ou congeler à-80 ° C pour les analyses futures. Remarque : Pour assurer une comparaison exacte entre les traitements pour l’analyse de cytokine liquide de lavage, effectuez 5 mL flushs de la cavité péritonéale 4 fois pour un volume final de 15 mL. Pas tous les fluides seront récupérés auprès de chaque chasse d’eau.</li>
	<li>Comme à l’étape 2.11, resuspendre et compter les macrophages viables. Remarque : Les macrophages sera légèrement plus grands que les autres cellules péritonéales.</li></ol>Rendement typique est de 5 x 105 - 1 x 106 macrophages/souris à l’aide d’une souris C57BL/6 de type sauvage. Facultatif : Si un grand nombre de globules rouges est présent dans le culot cellulaire, exécuter une étape de lyse conformément aux instructions du fabricant pour les supprimer, comme au point 2.11.
	<li>Comme à l’étape 2.12, remettre en suspension des cellules au moyen de placage. Remarque : Il peut être nécessaire aux cellules de la piscine depuis plus d’une souris pour une expérience. Par exemple, si une souris avait 5 x 105 macrophages, 500 μL d’électrodéposition moyen serait nécessaire.</li>
	<li>Comme dans 2.13, incuber les cellules pendant 1 h à 37 ° C 5 % CO2 pour permettre des macrophages devenir adhérent.</li>
	<li>Recueillir et clarifier un milieu conditionné, comme par les Etapes 1.14-1,15, de toutes les cellules péritonéales. NOTE : Les échantillons peuvent être utilisés immédiatement ou congelés et conservés à-80 ° C pour l’analyse de cytokine par ELISA.</li>
	<li>Effectuez l’étape 2.11, mais Incuber les cellules pendant 24 h non stimulé. Recueillir et clarifier les surnageants de cellule, comme par les Etapes 1.16-1.17, pour l’analyse de cytokine par ELISA. Remarque : Les cellules peuvent être préparés pour techniques telles que la tache occidentale ou PCR, comme dans les étapes 1.16-1.17 et 2.14.</li>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

États d’activation de macrophages jouent un rôle important dans les deux tissus l’homéostasie et maladie22. Les macrophages peuvent avoir distinctes ainsi que la superposition des États d’activation, selon repères dans leur microenvironnement3. Ils ont des rôles distincts dans toutes les étapes de la réponse inflammatoire : la défense contre les agents pathogènes, restitution de tissus et de guérison de blessure et ont aussi un état d’activation anti-inflammatoires distinct...

Les macrophages sont des cellules immunitaires innées, qui jouent des rôles multiples dans la réponse immunitaire à l’infection ou de lésion. Les macrophages sont responsables d’initier une réponse immunitaire à l’infection ou un tissu de dommages, arrêt la réponse inflammatoire et favoriser la guérison de la réponse1. On peut citer les trois États d’activation mieux étudiés macrophage : 1) macrophages traités par l’interféron gamma (IFNγ) et bactérien lipopolysaccharide (LPS), désigné M (IFNγ + LPS), qui contribuent à la réponse inflammatoire ; 2) macrophages stimulés par l’interleukine 4 (IL-4), M(IL-4), qui sont associés à la réponse de guérison ; 3) macrophages stimulés par des complexes immuns (IC) et LPS, M (IC + LPS), qui ont la possibilité de désactiver la réponse inflammatoire2,3. M (IC + LPS) sont distinct des macrophages de cicatrisation M(IL-4) et n’expriment pas l’arginase enzyme (Arg-1) ou le FIZZ14. Le meilleur marqueur pour ces macrophages anti-inflammatoire est leur production de cytokine5. Macrophages ont plusieurs rôles dans le maintien de la santé, mais aussi contribuent à des maladies inflammatoires et cancer3. Pour cette raison, les macrophages sont une clé cible thérapeutique pour le traitement d’une grande variété de maladies. Il est important d’étudier les effets des anticorps sur leur état d’activation au point de traitements axés sur les macrophages pour maladie.
Le présent document porte sur l’utilisation des macrophages murins médullaire dérivé (BMDMs) et les macrophages péritonéaux pour tester l’effet des anticorps médicaments sur les réponses inflammatoires in vitro et in vivo. Récemment, il y a eu de nombreuses études montrant les effets d’anticorps le macrophage activation6,7,8. Macrophages activés conjointement avec des complexes immuns, qui sont des anticorps complexés avec un antigène et disques vinyles, un stimulus inflammatoire normalement, produisent des niveaux très élevés des cytokines anti-inflammatoires, IL-10 et des niveaux très faibles de la cytokine pro-inflammatoire, interleukine 12 (IL-12)9. En outre, infliximab, un anticorps monoclonal contre le TNFα, a été trouvé au travail, en partie, en induisant des macrophages anti-inflammatoires par le biais de son fragment cristallisable (Fc) région7. Nous avons rapporté qu’IgIV + LPS induisent l’activation de macrophage anti-inflammatoire qui est similaire à M (IC + LPS), dans laquelle macrophages stimulés co produisent de grandes quantités d’IL-10 et de faibles quantités de la sous-unité de la cytokine pro-inflammatoire interleukine 12 ou 23 p40 ( IL-12/23p40), l’interleukine-6 (IL-6) et TNF8. IVIg est un médicament composé d’anticorps polyclonaux, principalement l’IgG, qui a été mis en commun du sang de plus de 1 000 donateurs10. Il est utilisé pour traiter une grande variété de maladies immunologiques, telles que le purpura thrombopénique idiopathique et polyradiculonévrite démyélinisante, mais son mécanisme d’action n’est pas totalement comprise11. Les effets des médicaments de l’anticorps basé sur l’activation des macrophages peuvent être évaluées à l’aide des méthodes décrites dans les présentes.
Les effets des produits biologiques spécifiques sur l’activation des macrophages peuvent être testés dans les BMDMs et les macrophages péritonéaux. À l’aide de ces sources de macrophage permet d’évaluer des cellules primaires. Les essais préliminaires d’anticorps sur des cellules en culture primaire nécessite moins de temps et un investissement monétaire que les autres modèles de maladie longue et coûteuse. En injectant un médicament dans une saine de souris in vivoet les cellules d’isolement et en les analysant ex vivo, on peut déterminer si les études sont garantis afin de déterminer si le traitement avec des produits biologiques influe sur l’activation des macrophages dans les modèles de maladies.
Avec peu d’études tester l’effet des thérapies biologiques sur le macrophage activation in vitro et in vivo directement, nos techniques apportent un avantage sur les autres techniques. Les techniques actuelles comportent des effets de médicament biologique test sur cellules mixtes populations in vitro, tels que l’effet de l’infliximab dans une réaction lymphocytaire mixte (MLR) ou IVIg sur des macrophages humains en cellules mononucléaires de sang périphérique, où l’effet ne peuvent être attribués à une cellule spécifique type7,12. L’utilisation de BMDMs et macrophages péritonéaux est avantageux à l’aide de lignées cellulaires, telles que les cellules RAW264.7, qui ne produisent pas de la cytokine pro-inflammatoire, IL-12, en réponse à LPS8,13. Tester l’effet d’un médicament à base d’anticorps sur le macrophage réponses ex vivo a avantages parce que les cytokines peuvent être attribués directement à des macrophages, plutôt que de déduire les réponses de macrophages en mesurant les concentrations sériques de cytokines14 . BMDMs et macrophages péritonéaux peuvent être dérivés et isolés des souris génétiquement modifiées afin de déterminer le rôle spécifique d’une protéine dans l’activation des macrophages anti-inflammatoires. Par exemple, nous avons utilisé Il10 déficients(- / -) BMDMs de démontrer qu’IgIV induite par la réduction de la production de cytokines pro-inflammatoires dépend partiellement de IL-10,8. Mécanisme d’un médicament d’action peut être étudiée à l’aide de western blot, où le rôle des protéines spécifiques et d’événements de signalisation peut être déterminé. PCR quantitative (qPCR) peut être effectuée sur les BMDMs ou les macrophages péritonéaux à montrent des profils d’expression génique qui résultent de l’activation de l’anticorps. Les modèles de maladies chez la souris peuvent fournir des informations sur l’efficacité potentielle des thérapies biologiques à base d’anticorps dans les modèles pour les maladies comme l’affection abdominale inflammatoire polyarthrite rhumatoïde, la maladie et le cancer15,16, 17. Toutefois, les techniques décrites ici vont renseignera sur le mécanisme d’action de ces produits biologiques en déterminant si elles induisent l’activité anti-inflammatoire macrophage.

<table><tbody><tr><td>Iscove' s modifié Dulbecco' s medium (IMDM)</td><td>Life technologies</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum (FBS)</td><td>Life technologies</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de stimulation des colonies de macrophages murins recombinants (MCSF)</td><td>Stemcell technologies</td><td>78059</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Life technologies</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>Monothioglycérol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>88640</td><td></td></tr><tr><td>1X tampon de lyse des globules rouges</td><td>eBioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon de dissociation cellulaire</td><td>Technologies de la vie</td><td>13150016</td><td>Sans enzymes, à base de Hanks,</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide EDTA (LPS)</td><td>Sigma aldrich</td><td>L 4516</td><td>D’E. coli 0127 :B8</td></tr><tr><td>IVIg (Gammunex)</td><td>Grifols</td><td>Reçu de l’Hôpital pour enfants de la Colombie-Britannique, Médecine transfusionnelle</td><td></td></tr><tr><td>IgIV (Gammagard liquide)</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>Reçu de l’Hôpital pour enfants de la Colombie-Britannique, Médecine transfusionnelle IgIV</td><td></td></tr><tr><td>(Octagam)</td><td>Octapharma</td><td>Reçu de l’Hôpital pour enfants de la Colombie-Britannique, Médecine</td><td></td>transfusionnelle</tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (stérile), pH 7,4</td> Technologies <td>de vie</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>souris IL-10 ELISA</td><td>BD biosciences</td><td>555252</td><td></td></tr><tr><td>souris IL-12/23p40 ELISA</td><td>BD biosciences</td><td>555165</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-Erk1/2</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-pp38</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>9211</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-GAPDH</td><td>Fitzgerald industries</td><td>10R-G109A</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 26 g</td><td>BD biosciences</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 mL</td><td>BD biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 10 mL</td><td>BD biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>tube conique de 15 mL</td><td>BD biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>tube conique de 50 mL</td><td>de BD biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>tube de microcentrifugation (1,7 mL)</td><td>Diamed</td><td>SPE155-N</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 flacon traité pour culture tissulaire</td><td>BD biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Racleur cellulaire</td><td>BD biosciences</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Forcepts</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td>pointe fine, dissection.</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>VWR</td><td>82027-582</td><td>Délicat, 4 1/2"</td></tr><tr><td>Microscope à fond clair</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td>Échelle de contraste de phase inversé</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Mettler&nbsp ;</td><td>PE 3000</td><td></td></tr></tbody></table>

Évaluation des effets de médicaments à base d’anticorps murins de la moelle osseuse et d’activation des macrophages péritonéaux

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Les macrophages sont phagocytaires cellules immunitaires innées, initier des réponses immunitaires aux agents pathogènes et de contribuer à la restitution de guérison et de tissus. Les macrophages sont tout aussi importants en éteignant les réponses inflammatoires. Nous avons montré que les macrophages stimulés par des immunoglobulines intraveineuses (IgIV) peuvent produire des quantités élevées de la cytokine anti-inflammatoire, interleukine 10 (IL-10) et de faibles niveaux de cytokines pro-inflammatoires en réponse aux lipopolysaccharides bactériens) LPS). IVIg est qu'un anticorps polyvalent, principalement des immunoglobulines Gs (IgG), mis en commun par le plasma de plus de 1 000 donneurs de sang. Il est utilisé en complément des anticorps chez les patients atteints d’une déficience immunitaire ou pour supprimer les réponses immunitaires chez les patients atteints de maladies auto-immunes ou inflammatoires. Infliximab, un anticorps thérapeutique anti-tumorale nécrose facteur alpha (TNFα) a aussi démontré qu’activent les macrophages pour produire l’IL-10 en réponse à des stimuli inflammatoires. IgIV et autres des produits biologiques à base d’anticorps peuvent être testés afin de déterminer leurs effets sur l’activation des macrophages. Cet article décrit des méthodes pour la dérivation, la stimulation et évaluation de la moelle épinière murine macrophages activés par l’anticorps in vitro et des macrophages péritonéaux murines activés avec anticorps in vivo. Enfin, nous montrent l’utilisation de western blot pour déterminer la contribution de cellule spécifique à l’activité des macrophages anti-inflammatoire des voies de signalisation. Ces protocoles peuvent être associés à des souris génétiquement modifiées, afin de déterminer l’effet d’une ou des protéines spécifiques sur l’activation des macrophages anti-inflammatoires. Ces techniques peuvent également servir à déterminer si les produits biologiques spécifiques peuvent agir en changeant les macrophages à un état d’activation anti-inflammatoires productrices de IL-10 qui réduit les réactions inflammatoires in vivo. Cela peut fournir des informations sur le rôle de l’activation de macrophages dans l’efficacité des produits biologiques au cours de modèles de maladies chez les souris et donnent un aperçu d’un nouveau mécanisme de potentiel d’action chez les personnes. À l’inverse, cela peut mettre en garde contre l’utilisationdes spécifiques produits biologiques à base d’anticorps pour traiter les maladies infectieuses, surtout si les macrophages jouent un rôle important dans la défense de l’hôte contre l’infection.

Macrophages dérivé de moelle osseuse murine peuvent être cultivées à partir de précurseurs de cellules hématopoïétiques dans la ponction de moelle osseuse. Ponction de moelle osseuse regroupées à partir de fémurs et tibias de souris C57BL/6 en général donne 10 macrophages de la moelle osseuse provenant de7 , rendant une source commode de macrophages pour les expériences. BMDMs peuvent être utilisés pour tester la base drogue d’anticorps lorsque confrontés à un stimulus inflamma...

Médicaments à base d’anticorps ont révolutionné le traitement de maladies inflammatoires. En plus d’avoir des effets directs sur des cibles spécifiques, les anticorps peuvent activent les macrophages pour devenir anti-inflammatoires. Ce protocole décrit comment anti-inflammatoires macrophage activation peut être évaluée in vitro, à l’aide des macrophages de la moelle osseuse de souris et in vivo, à l’aide des macrophages péritonéaux.

Évaluation des effets de médicaments à base d’anticorps murins de la moelle osseuse et d’Activation des macrophages péritonéaux

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

L’objectif global de ces expériences est de déterminer les effets des médicaments à base d’anticorps sur les états d’activation des macrophages anti-inflammatoires en utilisant la moelle osseuse de souris et les macrophages péritonéaux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie, telles que : des médicaments à base d’anticorps spécifiques agissent-ils en changeant les macrophages en un état d’activation anti-inflammatoire produisant de l’IL-10. Le principal avantage de cette technique, c’est qu’elle mesure la réponse des macrophages primaires de souris à partir de la moelle osseuse in vitro et de la cavité péritonéale in vivo.Effectuez cette procédure dans une hotte stérile. Fixez une souris euthanasiée en décubitus dorsal sur une planche de mousse, les membres tendus. Ensuite, nettoyez les jambes avec de l’éthanol à 70 %.Ensuite, faites une coupe peu profonde d’environ deux millimètres pour enlever la peau et la fourrure de la surface de chaque patte arrière. Ensuite, disséquez les tissus pour accéder aux tibias et aux fémurs. Pour enlever les tibias et les fémurs, coupez l’os et les muscles juste en dessous de l’articulation de la hanche et au-dessus des chevilles.Ensuite, retirez autant de tissu musculaire que possible des os. Ensuite, nettoyez les os avec de l’éthanol à 70 % et laissez-le s’évaporer pendant une minute. Ensuite, placez les os dans une assiette à six puits remplie de chair d’os.Dans la plaque, coupez un millimètre de chaque extrémité des fémurs afin que leurs cavités internes soient exposées. Assurez-vous qu’une aiguille de calibre 26 peut accéder aux cavités. Ensuite, séparez le tibia et le fémur de l’articulation du genou.Ensuite, insérez l’aiguille attachée à une seringue de 10 millilitres dans une cavité osseuse et prélevez la moelle osseuse. Tirez la moelle osseuse des quatre os dans un tube conique de 50 millilitres avec cinq millilitres de chair d’os. Versez le milieu et la moelle de haut en bas plusieurs fois.Ou vortex à vitesse lente pour disperser doucement les amas dans la suspension. Les chaînes de moelle doivent être brisées en petites taches de moelle de moins d’un demi-millimètre de long. Ensuite, remplissez le tube à 50 millilitres avec du milieu de chair d’os et transférez-le dans une fiole de culture tissulaire de 75 centimètres carrés.Incuber la moelle osseuse pendant une heure. Pendant l’incubation, les cellules matures adhéreront au ballon et les progéniteurs hématopoïétiques souhaités resteront en suspension. Transférez la suspension dans un tube conique de 50 millilitres et faites tourner les cellules en une pastille.Ensuite, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans cinq millilitres de milieu de culture MCSF. Ajustez ensuite la densité des cellules à 500 000 par millilitre et chargez 30 millilitres dans une nouvelle fiole de 75 centimètres carrés. Poursuivez la culture des cellules et, les jours quatre, sept et 10, vérifiez qu’elles sont adhérentes et légèrement ramifiées à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversé.Lors de la vérification des cellules, jetez le milieu contenant les cellules non adhérentes. Ensuite, lavez une fois les cellules adhérentes avec de l’IMDM et ajoutez 30 millilitres de milieu de culture MCSF frais dans le ballon. Le 10e jour, remplacez le milieu par huit millilitres de tampon de dissociation cellulaire à base d’EDTA sans enzyme pour collecter les cellules.Incuber brièvement les cellules, puis gratter doucement les cellules et vérifier qu’elles ont été libérées à l’aide d’un microscope. Une fois les cellules libérées, transférez le tampon avec les cellules dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, rincez le ballon trois fois avec cinq millilitres d’IMDM pour recueillir plus de cellules.Tirez toutes les collections, centrifugez-les et remettez en suspension la pastille dans trois millilitres de MCSF. Maintenant, comptez les cellules et ajustez leur concentration à un million par millilitre. Ensuite, plaquez 100 microlitres de suspension cellulaire par puits dans une plaque à fond plat de 96 puits.L’assiette entière doit pouvoir être remplie. Cultivez les cellules pendant environ une heure jusqu’à ce qu’elles soient adhérentes. Ensuite, stimulez-les avec différentes concentrations de LPS ou d’immunoglobuline intraveineuse ou les deux préparées dans IMDM.Effectuez toutes les manipulations en double ou en triple exemplaire et assurez-vous de garder les contrôles non traités. Ensuite, incubez les cellules pendant 24 heures et analysez les surnageants. Préparez une seringue d’un millilitre avec la quantité requise d’immunoglobuline intraveineuse et de LPS, et fixez-y une aiguille de calibre 26.Pour les commandes, utilisez plutôt PBS plus LPS. Saisissez la souris par sa peau tout en sécurisant son arrière-train et sa queue d’une seule main. Ciblez le quadrant inférieur droit de l’abdomen et insérez l’aiguille à un angle de 30 à 40 degrés avec le biseau vers le haut, et insérez-la à environ 1,5 centimètre.Injectez ensuite le bolus. Au bout d’une heure, récoltez les macrophages péritonéaux après avoir euthanasié la souris. Dans une cagoule stérile, épinglez la souris euthanasiée à une planche de mousse avec les membres écartés et stérilisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %.Ensuite, faites une incision peu profonde de deux millimètres le long de la ligne médiane et retirez la peau abdominale. Évitez de perforer la paroi péritonéale. Ensuite, chargez complètement une seringue de cinq millilitres avec du PBS stérile à pH 7,4 et injectez la souris à l’aide d’une aiguille de calibre 25 ou 27, au sommet de la cavité péritonéale, de chaque côté, vers la ligne médiane, avec le biseau de l’aiguille vers le haut.Après avoir retiré l’aiguille, massez le péritoine pendant 10 secondes pour déloger les cellules. Maintenant, insérez à nouveau l’aiguille, dans la cavité, et recueillez environ 3,75 millilitres de liquide de lavage. Transférez le liquide de lavage dans un tube conique de 15 millilitres sur de la glace.Répétez l’injection, le massage et la collecte du liquide de lavage trois fois de plus, et tirez toutes les collections dans le même tube. Lors de la collecte finale, il peut être plus facile de retirer le liquide de lavage de l’autre côté de la souris. Ensuite, faites tourner les cellules et remettez-les en suspension dans 500 microlitres de milieu de placage.Comptez ensuite les macrophages viables et mettez-les en suspension à un million par millilitre. Maintenant, plaquez 100 microlitres de suspension dans les puits d’une plaque à fond plat de 96 puits. Ensuite, incubez les cellules pendant une heure.Les macrophages péritonéaux vont adhérer à la plaque. Ensuite, retirez les cellules non adhérentes et rincez bien chacune deux fois avec 200 microlitres d’IMDM chaud. Après chaque lavage, attendez 10 secondes et inclinez lentement la plaque pour tirer la solution de rinçage.Après les lavages, rajoutez 100 microlitres de milieu de placage et placez la plaque dans l’incubateur. Pour l’ELISA, continuez à incuber les cellules sans stimulation pendant 24 heures. Ensuite, collectez et clarifiez le milieu conditionné pour l’analyse des cytokines.Les BMDM peuvent être utilisés pour tester les réponses médicamenteuses à base d’anticorps lorsqu’ils sont confrontés à un stimulus inflammatoire in vitro. L’immunoglobuline intraveineuse avec LPS augmente la production de la cytokine anti-inflammatoire IL-10, sept fois, par rapport à la stimulation LPS seule. Et cela diminue la production d’IL-12/23p40.De plus, la stimulation par immunoglobulines intraveineuses seules ou avec le LPS a augmenté l’activation de la kinase MAP ERK1/2, avec une phosphorylation précoce et prolongée. L’activation du P-38 a également eu lieu plus tôt. De plus, les macrophages péritonéaux ont significativement augmenté la production d’IL-10 avec une stimulation in vitro, par rapport aux souris injectées de PBS.La production de cytokines a ensuite été évaluée dans le liquide de lavage et dans les surnageants de macrophages péritonéaux stimulés ex vivo. L’IL-10 a été augmentée dans le liquide de lavage, les cellules péritonéales et les macrophages péritonéaux lorsque les souris ont été confrontées à des immunoglobulines intraveineuses et au LPS. En comparaison, la production de la sous-unité de cytokine pro-inflammatoire IL-12/23p40 a été significativement réduite dans les macrophages péritonéaux en culture, mais pas dans le liquide de lavage.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de tester les effets des médicaments à base d’anticorps sur les états d’activation des macrophages in vitro et in vivo en utilisant la moelle osseuse de souris et les macrophages péritonéaux.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Les macrophages jouent un rôle central dans l'homéostasie et de la pathologie dans de nombreux tissus. Le protocole présenté ici décrit des méthodes pour épuiser les...

L&#39;épuisement et la reconstitution des macrophages chez la souris

Dans cette vidéo, nous démontrons l’activation des macrophages dérivés de la moelle osseuse en réponse au lipopolysaccharide bactérien et à l’immunoglobuline intraveineuse.

Activation de macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris en réponse à des anticorps

Cette vidéo démontre l'activation des macrophages péritonéaux d'une souris à l'aide d'immunoglobulines intraveineuses et de lipopolysaccharides bactériens. La co-stimulation active les macrophages péritonéaux en macrophages anti-inflammatoires possédant une activité régulatrice immunitaire.

Activation in vivo de macrophages péritonéaux en réponse à des anticorps dans un modèle murin

Dans cette vidéo, nous démontrons l’effet de différentes concentrations d’anticorps anti-c-fms sur l’ostéoclastogenèse, qui est le processus de formation des ostéoclastes à partir des progéniteurs des ostéoclastes.

Effet de l’anticorps anti C-fms sur l’ostéoclastogenèse dans les cellules de moelle osseuse de souris in vitro

Les macrophages ont longtemps été reconnu comme un élément essentiel des réponses immunitaires innées et adaptatives. L'explosion récente des connaissances relatives aux aspects évolutifs, génétiques, biochimiques et de l'interaction entre les macrophages et les microbes a renouvelé l'attention des scientifiques à macrophages. Cet article décrit une méthode pour différencier les macrophages de moelle osseuse de souris.

Dérivées de moelle osseuse Macrophages production

Nous décrivons la détection d’activation inflammasome NLRP3 sur base cellulaire à l’aide de la microscopie en fluorescence et coloration pour active caspase-1 et l’adaptateur, ASC. Un test de libération de lactate déshydrogénase est présenté afin de détecter la lyse pyroptotic sur une base de population. Ces techniques peuvent être adaptés afin d’étudier plusieurs aspects de la biologie inflammasome.

Détection d’Activation Inflammasome et mort cellulaire de Pyroptotic dans les Macrophages dérivés de la moelle osseuse Murine

Nous présentons ici un protocole pour le dosage in vivo de l’activation des lymphocytes (cellules T) T CD4 naïves, la prolifération et la différenciation Th1 induite par la moelle osseuse de GM-CSF (BM)-dérivé des cellules dendritiques (CD). En outre, ce protocole décrit BM et T-cellule d’isolement, la génération de DC et DC et les cellules T transfert adoptif.

Un modèle de souris In Vivo à l’Activation des cellules T CD4 naïves mesure, la prolifération et la différenciation Th1 induite par les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse

Ce protocole comprend la dissection de murin des os longs et l’isolement de la moelle osseuse, pour générer des macrophages de la moelle osseuse et de produire des ostéoclastes à l’aide de la colonie de macrophages stimulant facteur (M-CSF) et activateur du récepteur du ligand facteur nucléaire Kappa-B (RANKL) ou facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et leur arrestation par des anticorps anti-c-fms, récepteurs de M-CSF.

Effet des anticorps Anti-c-fms sur la Formation des ostéoclastes et la prolifération des précurseurs des ostéoclastes In Vitro

Ce protocole décrit une méthode non enzymatique et simple pour isoler des cellules de moelle osseuse de souris néonatales âgées de 7 à 9 jours et générer des macrophages différenciés en utilisant un surnageant de cellules L929 comme source de facteur de stimulation des colonies de granulocytes (M-CSF). Les macrophages dérivés de la moelle osseuse ont été analysés plus en détail pour les antigènes de surface F4/80, CD206, CD11b et la compétence fonctionnelle.

Isolement de moelle osseuse de souris néonatale et préparation de macrophages dérivés de la moelle osseuse

Dendritiques antigènes des cellules d'absorption et de migrer vers les organes à l'abri de présenter les antigènes aux cellules T traitées. Qdot nanocristal étiquetage fournit un signal de longue durée et stable fluorescentes. Cela permet le suivi des cellules dendritiques à différents organes par microscopie fluorescente.

Génération et d&#39;étiquetage des murins de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées des nanocristaux Qdot pour les études de suivi

Découvrez comment évaluer l'activation anti-inflammatoire des macrophages par des médicaments à base d'anticorps chez la souris. Cette méthode permet d'étudier les réponses des macrophages de la moelle osseuse in vitro et des macrophages péritonéaux in vivo.

Évaluation des effets de médicaments à base d’anticorps murins de la moelle osseuse et d’Activation des macrophages péritonéaux

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