Évaluation des effets de médicaments à base d’anticorps murins de la moelle osseuse et d’Activation des macrophages péritonéaux

L’objectif global de ces expériences est de déterminer les effets des médicaments à base d’anticorps sur les états d’activation des macrophages anti-inflammatoires en utilisant la moelle osseuse de souris et les macrophages péritonéaux. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie, telles que : des médicaments à base d’anticorps spécifiques agissent-ils en changeant les macrophages en un état d’activation anti-inflammatoire produisant de l’IL-10. Le principal avantage de cette technique, c’est qu’elle mesure la réponse des macrophages primaires de souris à partir de la moelle osseuse in vitro et de la cavité péritonéale in vivo.

Effectuez cette procédure dans une hotte stérile. Fixez une souris euthanasiée en décubitus dorsal sur une planche de mousse, les membres tendus. Ensuite, nettoyez les jambes avec de l’éthanol à 70 %.

Ensuite, faites une coupe peu profonde d’environ deux millimètres pour enlever la peau et la fourrure de la surface de chaque patte arrière. Ensuite, disséquez les tissus pour accéder aux tibias et aux fémurs. Pour enlever les tibias et les fémurs, coupez l’os et les muscles juste en dessous de l’articulation de la hanche et au-dessus des chevilles.

Ensuite, retirez autant de tissu musculaire que possible des os. Ensuite, nettoyez les os avec de l’éthanol à 70 % et laissez-le s’évaporer pendant une minute. Ensuite, placez les os dans une assiette à six puits remplie de chair d’os.

Dans la plaque, coupez un millimètre de chaque extrémité des fémurs afin que leurs cavités internes soient exposées. Assurez-vous qu’une aiguille de calibre 26 peut accéder aux cavités. Ensuite, séparez le tibia et le fémur de l’articulation du genou.

Ensuite, insérez l’aiguille attachée à une seringue de 10 millilitres dans une cavité osseuse et prélevez la moelle osseuse. Tirez la moelle osseuse des quatre os dans un tube conique de 50 millilitres avec cinq millilitres de chair d’os. Versez le milieu et la moelle de haut en bas plusieurs fois.

Ou vortex à vitesse lente pour disperser doucement les amas dans la suspension. Les chaînes de moelle doivent être brisées en petites taches de moelle de moins d’un demi-millimètre de long. Ensuite, remplissez le tube à 50 millilitres avec du milieu de chair d’os et transférez-le dans une fiole de culture tissulaire de 75 centimètres carrés.

Incuber la moelle osseuse pendant une heure. Pendant l’incubation, les cellules matures adhéreront au ballon et les progéniteurs hématopoïétiques souhaités resteront en suspension. Transférez la suspension dans un tube conique de 50 millilitres et faites tourner les cellules en une pastille.

Ensuite, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans cinq millilitres de milieu de culture MCSF. Ajustez ensuite la densité des cellules à 500 000 par millilitre et chargez 30 millilitres dans une nouvelle fiole de 75 centimètres carrés. Poursuivez la culture des cellules et, les jours quatre, sept et 10, vérifiez qu’elles sont adhérentes et légèrement ramifiées à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversé.

Lors de la vérification des cellules, jetez le milieu contenant les cellules non adhérentes. Ensuite, lavez une fois les cellules adhérentes avec de l’IMDM et ajoutez 30 millilitres de milieu de culture MCSF frais dans le ballon. Le 10e jour, remplacez le milieu par huit millilitres de tampon de dissociation cellulaire à base d’EDTA sans enzyme pour collecter les cellules.

Incuber brièvement les cellules, puis gratter doucement les cellules et vérifier qu’elles ont été libérées à l’aide d’un microscope. Une fois les cellules libérées, transférez le tampon avec les cellules dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, rincez le ballon trois fois avec cinq millilitres d’IMDM pour recueillir plus de cellules.

Tirez toutes les collections, centrifugez-les et remettez en suspension la pastille dans trois millilitres de MCSF. Maintenant, comptez les cellules et ajustez leur concentration à un million par millilitre. Ensuite, plaquez 100 microlitres de suspension cellulaire par puits dans une plaque à fond plat de 96 puits.

L’assiette entière doit pouvoir être remplie. Cultivez les cellules pendant environ une heure jusqu’à ce qu’elles soient adhérentes. Ensuite, stimulez-les avec différentes concentrations de LPS ou d’immunoglobuline intraveineuse ou les deux préparées dans IMDM.

Effectuez toutes les manipulations en double ou en triple exemplaire et assurez-vous de garder les contrôles non traités. Ensuite, incubez les cellules pendant 24 heures et analysez les surnageants. Préparez une seringue d’un millilitre avec la quantité requise d’immunoglobuline intraveineuse et de LPS, et fixez-y une aiguille de calibre 26.

Pour les commandes, utilisez plutôt PBS plus LPS. Saisissez la souris par sa peau tout en sécurisant son arrière-train et sa queue d’une seule main. Ciblez le quadrant inférieur droit de l’abdomen et insérez l’aiguille à un angle de 30 à 40 degrés avec le biseau vers le haut, et insérez-la à environ 1,5 centimètre.

Injectez ensuite le bolus. Au bout d’une heure, récoltez les macrophages péritonéaux après avoir euthanasié la souris. Dans une cagoule stérile, épinglez la souris euthanasiée à une planche de mousse avec les membres écartés et stérilisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %.

Ensuite, faites une incision peu profonde de deux millimètres le long de la ligne médiane et retirez la peau abdominale. Évitez de perforer la paroi péritonéale. Ensuite, chargez complètement une seringue de cinq millilitres avec du PBS stérile à pH 7,4 et injectez la souris à l’aide d’une aiguille de calibre 25 ou 27, au sommet de la cavité péritonéale, de chaque côté, vers la ligne médiane, avec le biseau de l’aiguille vers le haut.

Après avoir retiré l’aiguille, massez le péritoine pendant 10 secondes pour déloger les cellules. Maintenant, insérez à nouveau l’aiguille, dans la cavité, et recueillez environ 3,75 millilitres de liquide de lavage. Transférez le liquide de lavage dans un tube conique de 15 millilitres sur de la glace.

Répétez l’injection, le massage et la collecte du liquide de lavage trois fois de plus, et tirez toutes les collections dans le même tube. Lors de la collecte finale, il peut être plus facile de retirer le liquide de lavage de l’autre côté de la souris. Ensuite, faites tourner les cellules et remettez-les en suspension dans 500 microlitres de milieu de placage.

Comptez ensuite les macrophages viables et mettez-les en suspension à un million par millilitre. Maintenant, plaquez 100 microlitres de suspension dans les puits d’une plaque à fond plat de 96 puits. Ensuite, incubez les cellules pendant une heure.

Les macrophages péritonéaux vont adhérer à la plaque. Ensuite, retirez les cellules non adhérentes et rincez bien chacune deux fois avec 200 microlitres d’IMDM chaud. Après chaque lavage, attendez 10 secondes et inclinez lentement la plaque pour tirer la solution de rinçage.

Après les lavages, rajoutez 100 microlitres de milieu de placage et placez la plaque dans l’incubateur. Pour l’ELISA, continuez à incuber les cellules sans stimulation pendant 24 heures. Ensuite, collectez et clarifiez le milieu conditionné pour l’analyse des cytokines.

Les BMDM peuvent être utilisés pour tester les réponses médicamenteuses à base d’anticorps lorsqu’ils sont confrontés à un stimulus inflammatoire in vitro. L’immunoglobuline intraveineuse avec LPS augmente la production de la cytokine anti-inflammatoire IL-10, sept fois, par rapport à la stimulation LPS seule. Et cela diminue la production d’IL-12/23p40.

De plus, la stimulation par immunoglobulines intraveineuses seules ou avec le LPS a augmenté l’activation de la kinase MAP ERK1/2, avec une phosphorylation précoce et prolongée. L’activation du P-38 a également eu lieu plus tôt. De plus, les macrophages péritonéaux ont significativement augmenté la production d’IL-10 avec une stimulation in vitro, par rapport aux souris injectées de PBS.

La production de cytokines a ensuite été évaluée dans le liquide de lavage et dans les surnageants de macrophages péritonéaux stimulés ex vivo. L’IL-10 a été augmentée dans le liquide de lavage, les cellules péritonéales et les macrophages péritonéaux lorsque les souris ont été confrontées à des immunoglobulines intraveineuses et au LPS. En comparaison, la production de la sous-unité de cytokine pro-inflammatoire IL-12/23p40 a été significativement réduite dans les macrophages péritonéaux en culture, mais pas dans le liquide de lavage.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de tester les effets des médicaments à base d’anticorps sur les états d’activation des macrophages in vitro et in vivo en utilisant la moelle osseuse de souris et les macrophages péritonéaux.