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La cristallisation des protéines est le processus d’obtention d’une forme solide en treillis d’une protéine. Ces cristaux sont particulièrement précieux pour les biologistes structurels, car ils aident à l’étude de la fonction des protéines. D’autres techniques, telles que la spécification de masse ou SDS-PAGE, ne peuvent fournir que des informations sur la structure unidimensionnelle des protéines. La cristallisation des protéines est complétée par les techniques d’expression des protéines recombinantes et de diffraction des rayons X. Cette vidéo montrera les principes de la cristallisation des protéines, une procédure générale de laboratoire et plusieurs de ses applications dans le domaine biochimique.
La première étape requise dans le processus consiste à obtenir des quantités millimétriques de protéines très pures, généralement en utilisant l’expression de protéines recombinantes. Le gène correspondant à la protéine d’intérêt est cloné dans un vecteur d’expression, et la protéine exprimée est fusionnée à un marqueur d’affinité, tel que la polyhistidine, pour aider à la purification par chromatographie d’affinité. Pour en savoir plus, regardez la vidéo de cette collection sur la chromatographie d’affinité.
La formation de la protéine purifiée en cristaux dépend de la bonne combinaison de nombreux facteurs, notamment le pH, la force ionique, les concentrations de précipitant et de protéine, la température et le taux d’équilibre. La méthode la plus couramment utilisée est la diffusion de vapeur, dont il existe deux catégories : la goutte suspendue et la goutte assise. Une gouttelette contenant une protéine pure, un tampon et un précipitant, qui est un solide ionique qui lie les molécules d’eau, réduisant la disponibilité de l’eau pour la protéine et imitant une concentration de protéines plus élevée, se trouve dans un micropuits fermé avec un réservoir avec un mélange plus concentré du même tampon et du même précipitant. Au début, les concentrations de protéines et de précipitants sont trop faibles pour provoquer une cristallisation. Au cours de l’expérience, l’eau s’évapore de la gouttelette et s’accumule dans le réservoir ; Une diminution de la quantité d’eau dans la gouttelette provoque une sursaturation du système et une nucléation, suivie d’une cristallisation, peut se produire. Le transfert net d’eau de la gouttelette est en équilibre et le système est maintenu jusqu’à ce que le processus soit terminé.
Pour visualiser la structure 3D, la diffraction des rayons X est utilisée. Pour obtenir des données de rayons X à partir d’un cristal, il est placé dans un faisceau de rayons X monochromatique, où il est exposé au faisceau sous tous les angles. Chaque exposition fournit une image, où chaque point est un rayon X diffracté, qui émerge du cristal et est enregistré par un détecteur. Les données sont combinées pour produire un modèle de l’arrangement des atomes à l’intérieur du cristal. La structure cristalline résultante démontre le placement tridimensionnel des atomes, avec une résolution typique de 2 angströms.
Maintenant que nous avons couvert les principes de la cristallisation des protéines, examinons un protocole généralisé.
Pour commencer la procédure, un vecteur d’expression contenant le gène d’intérêt est transformé en cellules. Les cellules sont incubées et à mi-logarithm, l’expression est initiée par l’ajout d’un inducteur, tel que l’IPTG, qui déclenche la transcription de l’ARNm du gène. Après l’expression de la protéine, la matière brute est suspendue dans un tampon de lyse, puis clarifiée par centrifugation.
Le lysat clarifié est ensuite chargé sur une colonne de nickel, et la protéine marquée à la polyhistidine se lie à la colonne tandis que toutes les autres biomolécules sont emportées.
Une fois que plusieurs milligrammes de protéines pures ont été obtenus, elles sont prêtes pour la cristallisation par diffusion de vapeur. Un plateau de descente suspendu / assis à 24 puits est rempli de concentrations variables de solutions tampons de chlorure de sodium et d’acétate de sodium. Pour la méthode de la goutte assise, des volumes égaux de protéines et de solution de réservoir sont pipetés sur l’étagère au-dessus de chaque puits, puis le plateau est recouvert de ruban adhésif transparent. Le plateau est ensuite placé dans une chambre d’incubation, et la croissance des puits est surveillée le lendemain, puis tous les quelques jours.
Une fois qu’un cristal approprié a été obtenu, il est prêt pour l’analyse par diffraction des rayons X. Le cristal est monté sur un goniomètre pour positionner le cristal dans les orientations sélectionnées. Le cristal est éclairé par un faisceau monochromatique de rayons X sous tous les angles, produisant un motif de diffraction. Le logiciel convertit les images bidimensionnelles, prises dans différentes orientations, en un modèle tridimensionnel de la densité des électrons dans le cristal en déterminant les positions des atomes dans le cristal.
Maintenant que nous avons passé en revue une procédure, passons en revue quelques applications utiles de la cristallisation des protéines et une autre technique de cristallisation.
La cristallisation des protéines peut être utilisée pour la conception de médicaments in silico. La structure tridimensionnelle de la protéine polymérase basique 2 du virus de la grippe, qui a été liée à l’infection virale chez les mammifères, a été déterminée par cristallisation et diffraction des rayons X. Les sites de liaison potentiels dans la protéine sont visualisés et, à l’aide d’un programme d’amarrage, une molécule tridimensionnelle a été conçue qui s’insérerait dans une fente de la protéine.
La co-cristallisation des complexes protéine-ADN est également une technique utile. Les protéines de liaison à l’ADN modulent une grande variété de fonctions biologiques telles que la transcription, la polymérisation de l’ADN et la réparation de l’ADN ; Et les structures cristallines de ces complexes peuvent donner un aperçu de la fonction des protéines, du mécanisme et de la nature de l’interaction spécifique. La protéine SeqA d’E. coli, un régulateur négatif de la réplication de l’ADN, a été co-cristallisée avec de l’ADN hémiméthylé.
Les protéines membranaires intégrales telles que les récepteurs couplés aux protéines G, ou GCPR, sont difficiles à cristalliser en raison de leur quantité limitée de surface polaire disponible pour former des contacts de réseau cristallin, ce qui a conduit au développement de la cristallisation des protéines assistée par fusion. Des gènes codant pour un récepteur adrénergique ?2, un GCPR et un lysozyme ont été insérés dans un vecteur d’expression. La cristallisation de la protéine de fusion du lysozyme ?2AR- a été réalisée en raison de l’augmentation de la surface hydrophile extracellulaire par rapport au ?2AR naturellement hydrophobe, fournie par le lysozyme, nécessaire à la formation d’interactions d’empilement dans le réseau cristallin.
Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur la cristallisation des protéines. Cette vidéo décrivait ses principes, un protocole généralisé et certaines de ses utilisations dans le domaine biomédical. Merci d’avoir regardé !
