Mesure de la déformabilité et hétérogénéité des globules rouges dans le sang par ektacytomètre

L’objectif global de cette technique est de mesurer la déformabilité et l’hétérogénéité cellulaire des globules rouges par ektacytométrie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en ektacytométrie, telles que la déformabilité des érythrocytes, l’hétérogénéité d’un échantillon de sang et la façon dont l’expérience change en fonction de la maladie. Les principaux avantages de ces techniques sont l’accessibilité, la commodité et la fiabilité de la mesure de la déformabilité et de l’hétérogénéité des populations de globules rouges.

Ces techniques peuvent être utiles pour surveiller la réponse au traitement chez les patients atteints d’anémie falciforme. Parce que la déformabilité et l’hétérogénéité des globules rouges sont corrélées à la composition et à la concentration de l’hémoglobine. Ces méthodes peuvent être appliquées à d’autres maladies caractérisées par une diminution de la déformabilité des globules rouges, comme le diabète, où une diminution de la déformabilité des globules rouges pourrait contribuer aux maladies microvasculaires.

Commencez par connecter le tube osmolaire zéro à la solution PVP faiblement osmolaire, et le tube osmolaire 500 à la solution PVP osmolaire élevée. Assurez-vous que le bob est complètement abaissé dans la tasse. Lancez le logiciel et amorcez la machine en sélectionnant Vérification du matériel, puis E/S de l’instrument. Laissez l’instrument terminer le cycle d’amorçage.

Une fois le cycle terminé, retirez le bob de la tasse et séchez complètement le bob et la tasse avec un chiffon de nettoyage à faible peluche. Mélangez délicatement un échantillon de sang total fraîchement prélevé en inversant le flacon plusieurs fois. Ensuite, pipetez 25 microlitres de sang total dans cinq millilitres de solution PVP iso-osmolaire.

Après avoir bouché le flacon, mélangez doucement en retournant à nouveau plusieurs fois. Choisissez la déformabilité dans le menu principal du logiciel, puis créez une nouvelle analyse et ajoutez les détails de l’expérience. Ensuite, soulevez le couvercle de l’ektacytomètre et vérifiez que le bob est complètement abaissé dans la tasse et que la tasse tourne.

Pipetez un millilitre de solution de sang PVP dans l’espace entre la tasse et le bob. Soulevez ensuite légèrement le bob pour faire descendre l’échantillon. Attendez que toutes les bulles soient sorties de la solution, puis fermez le couvercle de l’ektacytomètre.

Réglez le gain à 200 en déplaçant la flèche le long de la barre de défilement dans le logiciel. Lorsque la température est stable à 37 degrés Celsius et que l’image de diffraction est stable, appuyez sur Démarrer. Observez les motifs de diffraction au fur et à mesure de l’acquisition des données pour vous assurer qu’ils restent circulaires, elliptiques ou en forme de losange.

Une fois l’acquisition des données terminée, imprimez le rapport et nettoyez-le. Un motif de diffraction obtenu à partir de sang sain en réponse à une contrainte de cisaillement montre le motif elliptique attendu. L’indice d’allongement est calculé à l’aide de l’équation présentée ici.

Lorsque l’échantillon est aspiré, rincez l’espace entre la tasse et le bob en injectant de l’eau déminéralisée dans l’espace pendant que l’instrument reste dans le cycle de nettoyage. Une fois le cycle de nettoyage terminé, retirez le bob de la tasse et séchez complètement le bob et la tasse avec un chiffon de nettoyage à faible peluche. Un bon séchage est essentiel, car l’eau résiduelle lysera les globules rouges, produisant des interférences.

Sélectionnez Exporter pour enregistrer le rapport. Enfin, cliquez sur le bouton du menu principal du logiciel pour revenir à la page principale. Après avoir chargé un autre échantillon dans l’ektacytomètre comme précédemment, assurez-vous qu’une image de diffraction stable est présente à l’écran.

Ajustez le gain de la caméra en déplaçant une règle le long de l’écran jusqu’à ce qu’il produise une hauteur de diffraction de 3,8 cm. Utilisez une règle pour vérifier la hauteur de l’image sur l’écran de l’ordinateur. Ensuite, appuyez sur démarrer et observez l’acquisition des données comme précédemment.

Cette image montre un motif de diffraction de 3,8 cm obtenu à partir du sang d’un patient atteint d’anémie falciforme. Après avoir nettoyé l’ektacytomètre comme indiqué précédemment, répétez la procédure pour obtenir des motifs de diffraction à des hauteurs de 4,5 cm et 5,4 cm. La distorsion du motif de diffraction se produit dans des échantillons de sang hétérogènes car les globules rouges rigides ne s’alignent pas correctement avec les cellules déformables, ce qui entraîne un motif de diffraction en forme de losange.

Ce motif de distorsion est de plus en plus détectable à mesure que le gain de la caméra est ajusté pour générer des motifs de diffraction plus grands. Pour l’ektacytométrie à gradient osmotique, commencez par ajouter 250 microlitres de sang total dans un flacon contenant cinq millilitres de PVP iso-osmolaire et mélangez délicatement. Choisissez Osmoscan dans le menu principal du logiciel.

Placez ensuite le flacon contenant la solution de sang PVP sous l’aiguille sur le côté gauche de la machine. Abaissez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle touche le fond du flacon. Assurez-vous que le tube est correctement connecté aux solutions osmolaires basses et élevées pour la production de gradient.

Fermez le couvercle de l’ektacytomètre et ouvrez la porte sur la moitié inférieure pour permettre de voir le sang entrer dans la tubulure. Appuyez sur Nouvelle analyse et saisissez les détails de l’expérience. Après avoir réglé le gain de la caméra à 200, laissez la machine fonctionner jusqu’à ce que le sang pénètre dans la coupelle à partir du tube situé sous l’instrument.

Lorsque l’écran de l’ordinateur affiche un motif de diffraction stable, commencez l’acquisition des données en appuyant sur le bouton Démarrer maintenant de la boîte de dialogue. Laissez l’ektacytomètre acquérir des données jusqu’à environ 500 milliosmoles par kilogramme, puis arrêtez l’instrument. Imprimez le rapport.

Ensuite, retirez l’ancienne fiole de sang PVP et remplacez-la par une fiole propre contenant de l’eau déminéralisée. Abaissez l’aiguille de manière à ce qu’elle touche le fond du flacon, puis appuyez sur le bouton de rinçage dans la boîte de dialogue pour rincer le système de dégradé. Une fois le rinçage terminé, appuyez sur l’option de nettoyage dans la boîte de dialogue de l’écran de l’ordinateur, puis sélectionnez Exporter pour enregistrer le rapport.

Séchez le bob et la tasse comme précédemment. Les populations sanguines homogènes, telles que observées chez les volontaires sains, ne produisent pas de courbes de déformabilité différentes lorsque les tailles de diffraction sont mesurées. En revanche, les populations sanguines hétérogènes, telles que le sang de patients atteints d’anémie falciforme, montrent des diminutions significatives des mesures de déformabilité en fonction de la taille du motif de diffraction.

Dans le sang dréplicatif, lorsque le degré de distorsion du motif de diffraction est mesuré en fonction de l’EI max, il est corrélé avec l’hémoglobine S et la variante de l’hémoglobine adulte, l’hémoglobine A2. La transfusion corrige la distorsion, comme l’indique sa relation inverse avec le pourcentage d’hémoglobine adulte normale dans le sang. Que le degré de distorsion du motif de diffraction soit mesuré en fonction de la contrainte de cisaillement nécessaire pour atteindre la déformabilité demi-maximale, ou en fonction de l’EI max, il est corrélé avec l’hémoglobine fœtale. Les principaux paramètres d’ektacytométrie du gradient osmotique, tels que EI max, EI min et O min, fournissent des informations supplémentaires sur l’hydratation cellulaire, les rapports surface/volume et la fragilité osmotique, respectivement.

Une fois maîtrisées, ces techniques peuvent être réalisées en environ une heure, si elles sont exécutées correctement. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme la microscopie peuvent être effectuées, pour répondre à des questions supplémentaires relatives à la déformabilité des érythrocytes individuels. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mesurer la déformabilité et l’hétérogénéité sérique dans les échantillons de sang.