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Les interactions protéine-protéine jouent un rôle important dans une grande variété de fonctions biologiques. La majorité des interactions protéine-protéine et leurs effets biologiques n’ont pas encore été identifiés. La co-immunoprécipitation, ou CoIP, et les tests pull-down sont deux méthodes étroitement liées pour l’identification d’interactions protéine-protéine stables. Cette vidéo couvrira les principes des deux tests, leurs procédures générales de laboratoire et les applications de ces techniques.
Les tests CoIP et pull-down sont des variantes de l’immunoprécipitation, une méthode permettant d’isoler sélectivement une espèce protéique à partir d’une solution complexe. Dans une expérience d’immunoprécipitation, on permet à un anticorps spécifique d’une protéine cible de former un complexe immunitaire avec cette cible dans l’échantillon. Le complexe est ensuite capturé sur un support solide, généralement la protéine A liée à une bille de sépharose. Toutes les protéines non capturées sont éliminées par les étapes de centrifugation. La protéine est ensuite libérée de l’anticorps et du support solide en faisant bouillir dans un tampon de chargement d’échantillon réducteur SDS-PAGE.
La co-immunoprécipitation est effectuée de la même manière, sauf que les complexes protéiques intacts sont capturés sur le support solide. L’anticorps se lie à la protéine cible, qui, à son tour, est liée à une autre protéine qui n’est pas ciblée par l’anticorps. Comme dans l’immunoprécipitation, le complexe protéique est libéré de l’anticorps et du support solide par ébullition dans un tampon de chargement d’échantillon SDS-PAGE réducteur.
Les tests pull-down sont similaires à la co-immunoprécipitation, ne différant que par l’utilisation d’une protéine « appât », par opposition à un anticorps. Grâce à des techniques de biologie moléculaire, cette protéine d’appât est modifiée avec une étiquette d’affinité, telle qu’une série de résidus d’histidine. Ces marqueurs d’affinité sont décrits dans « Chromatography-based Biomolecule Separations ». La protéine est ensuite capturée sur un ligand d’affinité immobilisé spécifique de l’étiquette. La protéine capturée est ensuite incubée avec un échantillon qui contient des protéines qui forment des complexes avec l'« appât ». Le complexe protéique est libéré du support d’affinité par lavage avec une solution contenant un analyte compétitif spécifique de l’étiquette sur la protéine « appât ». Les tests pull-down sont utiles pour confirmer les interactions protéiques prédites par la co-immunoprécipitation et pour découvrir des interactions protéiques inconnues.
Maintenant que les principes de la co-immunoprécipitation et des tests de traction ont été discutés, examinons leurs procédures de laboratoire.
Parlons d’abord de la co-immunoprécipitation. À une série de tubes microfuges, on ajoute : un tampon PBS et une solution à 50 % de protéine A-sépharose, un complexe résine-protéine qui se lie à l’anticorps. Les tubes microfuges sont tournés pour assurer une bonne distribution, puis la résine est lavée avec un tampon PBS supplémentaire. Du lysat cellulaire, contenant la protéine souhaitée, et 2 μg d’anticorps sont ajoutés aux tubes de microfuge, et le mélange est tourné pendant 1 h à 4 °C. Les billes sont granulées par centrifugation, le surnageant est jeté et les billes sont lavées trois fois avec un tampon pour éliminer les protéines non liées. Les billes contenant le complexe anticorps-protéine servent à réduire le tampon de chargement d’échantillon SDS-PAGE, à éliminer le complexe de l’anticorps et à être analysées par SDS-PAGE et immunoblottage.
Nous allons maintenant discuter de la procédure des tests pull-down : la protéine « appât » est exprimée dans un plasmide avec l’étiquette d’affinité appropriée. Après avoir atteint la croissance en phase logarithmique, les cellules sont lysées, puis centrifugées. Des billes de streptavidine-sépharose en suspension, qui capturent la protéine « appât » marquée à la biotine, sont pipetées dans un tube de microfuge. Les billes sont ensuite centrifugées et le surnageant est soigneusement éliminé par aspiration. Les billes sont ensuite lavées avec un tampon, centrifugées et le surnageant éliminé.
Les cellules contenant la protéine présumée « proie », qui a une affinité pour la protéine « appât », sont récoltées par centrifugation. Le surnageant est ensuite ajouté au tube de microfuge contenant la résine, et incubé à 4 ? C pendant 3 h sur un agitateur. La résine est ensuite centrifugée, le surnageant éliminé et la résine lavée pour éliminer les protéines non liées. Un tampon d’élution est ajouté à la résine et le mélange est incubé à température ambiante pendant 30 min sur un agitateur. La résine est ensuite centrifugée et le surnageant contenant le complexe souhaité est analysé par immunoblottage.
Maintenant que nous avons passé en revue les procédures, examinons quelques-unes des applications utiles de la co-immunoprécipitation et des tests de traction.
La co-immunoprécipitation peut être utile pour mieux comprendre le mécanisme d’action des enzymes. Les protéines de résistance aux myxovirus, ou Mx-, inhibent un large éventail de virus, y compris la grippe A, dont le mécanisme est mal compris. La co-immunoprécipitation a été utilisée pour étudier l’interaction entre la protéine Mx1 de souris et la nucléoprotéine de la grippe.
Les tests pull-down se sont avérés utiles pour étudier les effets des seconds messagers, qui sont des protéines qui communiquent un signal de l’environnement cellulaire. Ils sont un composant d’une voie de signalisation où plusieurs protéines interagissent en réponse à des signaux environnementaux. Les ions calcium agissent comme des messagers secondaires en se liant à la calmoduline, qui, à son tour, se lie à une grande variété de protéines, médiant de nombreux types de réponses biologiques. Sans calcium, la protéine ne peut pas se lier à la calmoduline. Un test pull-down a été effectué pour tester la capacité des protéines à se lier à la calmoduline en présence ou en l’absence d’ions calcium.
Les tests de co-immunoprécipitation et de pull-down sont généralement utilisés pour analyser les interactions protéiques stables ou fortes, mais pas les interactions transitoires. Un développement récent dans le domaine des tests pull-down, le HaloTag, a simplifié l’étude des interactions protéiques transitoires ; HaloTag est un marqueur de fusion de protéines génétiquement codé, fusionné à la protéine d’intérêt, capable de réagir chimiquement avec un support solide d’haloalcane. Si une analyse fonctionnelle est souhaitée, le complexe protéique, moins l’étiquette, dans son intégralité, pourrait alors être isolé par incubation avec de la protéase virale de gravure du tabac.
Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur la co-immunoprécipitation et les tests de traction. Cette vidéo décrivait les principes des deux méthodes, les procédures générales de laboratoire et certaines de leurs applications.
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