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Co-immunoprécipitation (Pico) et menu déroulant dosages sont étroitement apparentées de méthodes pour identifier les interactions protéine-protéine stable. Ces méthodes sont liées à l’immunoprécipitation, une méthode pour séparer une protéine cible liée à un anticorps des protéines non liés. Pico, une protéine de liaison anticorps est liée à une autre protéine qui ne se lie pas avec l’anticorps, il est suivi par un processus de séparation qui préserve les protéines complexes. La différence dans les essais de la liste déroulante est que protéines d’affinité-tag appât remplacement anticorps et chromatographie d’affinité est utilisée pour isoler des complexes protéine-protéine.
Cette vidéo explique Pico, menu déroulant dosages et leur mise en œuvre dans le laboratoire. Un protocole étape par étape pour chaque technique est couvert, y compris les réactifs, les appareils et les instruments permettant de purifier et d’analyser les protéines liées. En outre, la section des applications de cette vidéo décrit une procédure pour étudier comment les protéines myxovirus inhibent la nucléoprotéine de grippe, une enquête sur le rôle des ions de calcium à la calmoduline via un menu déroulant dosage et d’un test mis à jour le menu déroulant pour caractériser les interactions entre protéines transitoires.
Interactions protéines-protéines jouent un rôle important dans une grande variété de fonctions biologiques. La plupart des interactions protéine-protéine et leurs effets biologiques doivent encore être identifiés. Co-Immunoprécipitation, ou Pico et menu déroulant dosages sont deux méthodes apparentées pour l’identification des interactions protéine-protéine stable. Cette vidéo couvre les principes des deux essais, leurs procédures générales de laboratoire et les applications de ces techniques.
Pico et menu déroulant dosages sont des variantes d’immunoprécipitation, une méthode pour isoler sélectivement une espèce de protéine d’une solution complexe. Dans une expérience d’immunoprécipitation, un anticorps spécifique d’une protéine cible est autorisé pour former un complexe immun avec cet objectif dans l’échantillon. Le complexe est ensuite capturé sur un support solide, généralement la protéine une limite d’une bille de Sépharose. Aucune protéine ne pas capturées est éliminées par étapes de centrifugation. La protéine est ensuite libérée de l’anticorps et le support solide en faisant bouillir dans la réduction de tampon de chargement d’échantillons SDS-PAGE.
Co-immunoprécipitation est réalisée de la même façon, sauf que les complexes de protéine intacte sont capturés sur le support solide. L’anticorps se lie à la protéine cible qui, à son tour, est liée à une autre protéine qui n’est pas ciblée par l’anticorps. Comme dans l’immunoprécipitation, le complexe protéique est libéré de l’anticorps et le support solide en portant à ébullition pour réduire la mémoire tampon échantillon de chargement SDS-PAGE.
Menu déroulant essais sont similaires aux co-immunoprécipitation, ne différant que par l’utilisation d’une protéine « appât », par opposition à un anticorps. Par le biais de techniques de biologie moléculaire, cette protéine appât est conçue avec une balise d’affinité, comme une série de résidus histidine. Ces balises d’affinité sont décrites dans « axée sur la chromatographie des séparations de biomolécule ». La protéine est ensuite capturée sur un ligand immobilisé affinité spécifique pour la balise. La protéine capturée est ensuite incubée auprès d’un échantillon qui contient des protéines qui forment des complexes avec le « appât ». Le complexe protéique est libéré de la prise en charge de l’affinité de lavage avec une solution contenant un spécifique de l’analyte compétitif pour la balise sur la protéine « appât ». Menu déroulant dosages sont utiles afin de confirmer les interactions protéine prédites par co-immunoprécipitation et pour découvrir les interactions de protéine inconnue.
Maintenant que les principes de co-immunoprécipitation et menu déroulant dosages ont été discutées, regardons leurs procédures de laboratoire.
Première nous allons discuter de co-immunoprécipitation. À une série de microtubes, le texte suivant est ajouté : tampon PBS et une solution de 50 % de protéine A-Sépharose, un complexe de résine-protéine qui se lie à l’anticorps. Les microtubes sont tournées pour assurer la distribution correcte, et puis la résine est lavée avec tampon PBS supplémentaire. Cellule lysat, contenant la protéine désirée et 2 μg d’anticorps sont ajoutés aux microtubes et le mélange est tourné pendant 1 h à 4 ° C. Les perles sont granulées par centrifugation, le surnageant est jeté et les perles re-laver trois fois avec le tampon à supprimer non lié aux protéines. Les perles contenant le complexe protéine-anticorps sont dans la réduction de tampon de chargement d’échantillons SDS-PAGE, pour enlèvement du complexe de l’anticorps et analyse par SDS-PAGE et immunoblotting.
Maintenant, nous allons discuter de la procédure pour des dosages de menu déroulant : la protéine « appât » s’exprime dans un plasmide avec la balise appropriée d’affinité. Après avoir atteint la croissance phase logarithmique, les cellules sont lysées et puis centrifugés. Streptavidine-Sépharose suspension perles, qui capturent de protéine de biotine-étiquetée « appât », sont distribués dans un tube à centrifuger. Les perles sont ensuite centrifugés et le surnageant sera enlevé par aspiration. Les perles sont ensuite lavées avec tampon, centrifugé et le surnageant supprimé.
Les cellules contenant la protéine putative de « proie », qui a une affinité pour la protéine « appât », sont récoltées par centrifugation. Le surnageant est ensuite ajouté à du tube à centrifuger contenant de la résine et incubé à 4 ° C pendant 3 h sur un agitateur. La résine est ensuite centrifugé, le surnageant supprimé, et la résine lavé pour enlever non lié aux protéines. Tampon d’élution est ajouté à la résine, et le mélange est incubé à température ambiante pendant 30 min sur un agitateur. La résine est ensuite centrifugée et le surnageant contenant le complexe désiré est analysé par immunoblotting.
Maintenant que nous avons passé en revue les procédures, nous allons étudier certaines applications utiles de co-immunoprécipitation et dosages de menu déroulant.
Co-Immunoprécipitation peut être utile dans la compréhension des mécanismes des enzymes d’action. Protéines de résistance Myxovirus ou Mx-, inhibent un large éventail de virus, y compris la grippe A, dont le mécanisme est mal compris. Co-Immunoprécipitation a été utilisé pour étudier l’interaction entre la souris protéine Mx1 et la nucléoprotéine grippe.
Menu déroulant dosages sont avérés utiles pour étudier les effets de seconds messagers, qui sont des protéines qui communiquent un signal provenant de l’environnement cellulaire. Elles constituent un élément d’une voie de signalisation où plusieurs protéines interagissent en réponse à des stimuli environnementaux. Les ions calcium agissent comme des messagers secondaires en se liant à la calmoduline, qui, à son tour, se lie à une grande variété de protéines, médiation de nombreux types de réponses biologiques. Sans le calcium, la protéine ne peut pas lier à la calmoduline.
Co-Immunoprécipitation et menu déroulant dosages sont généralement utilisés pour l’analyse des interactions de protéine stable ou forte, mais pas transitoire. Un développement récent dans le menu déroulant dosages, la HaloTag, a simplifié l’étude des interactions entre protéines transitoires ; HaloTag est une balise de fusion de protéine codée génétiquement, fondue à la protéine d’intérêt, capable de réagir chimiquement avec un support solide haloalcanes. Si vous souhaitez l’analyse fonctionnelle, la protéine complexe, moins l’étiquette, dans son intégralité pourrait alors être isolée en incubant avec tabac etch protéase du virus.
Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE co-immunoprécipitation et dosages de menu déroulant. Cette vidéo décrit les principes de deux méthodes, les procédures générales de laboratoire et certaines de leurs applications.
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La co-immunoprécipitation (CoIP) et les tests pull-down sont des méthodes étroitement liées pour identifier les interactions protéine-protéine stables. Ces méthodes sont liées à l’immunoprécipitation, une méthode permettant de séparer une protéine cible liée à un anticorps des protéines non liées. Dans la CoIP, une protéine liée à l’anticorps est elle-même liée à une autre protéine qui ne se lie pas à l’anticorps, ceci est suivi d’un processus de séparation qui préserve le complexe protéine-protéine. La différence avec les tests pull-down est que les protéines d’appât marquées par affinité remplacent les anticorps, et la chromatographie d’affinité est utilisée pour isoler les complexes protéine-protéine.
Cette vidéo explique la CoIP, les tests pull-down et leur mise en œuvre en laboratoire. Un protocole étape par étape pour chaque technique est couvert, y compris les réactifs, les appareils et les instruments utilisés pour purifier et analyser les protéines liées. De plus, la section applications de cette vidéo décrit une procédure pour étudier comment les protéines myxovirales inhibent la nucléoprotéine de la grippe, une étude du rôle des ions calcium dans la calmoduline via un test pull-down et un test pull-down modifié pour caractériser les interactions protéiques transitoires.
Les interactions protéine-protéine jouent un rôle important dans une grande variété de fonctions biologiques. La majorité des interactions protéine-protéine et leurs effets biologiques n’ont pas encore été identifiés. La co-immunoprécipitation, ou CoIP, et les tests pull-down sont deux méthodes étroitement liées pour l’identification d’interactions protéine-protéine stables. Cette vidéo couvrira les principes des deux tests, leurs procédures générales de laboratoire et les applications de ces techniques.
Les tests CoIP et pull-down sont des variantes de l’immunoprécipitation, une méthode permettant d’isoler sélectivement une espèce protéique à partir d’une solution complexe. Dans une expérience d’immunoprécipitation, on permet à un anticorps spécifique d’une protéine cible de former un complexe immunitaire avec cette cible dans l’échantillon. Le complexe est ensuite capturé sur un support solide, généralement la protéine A liée à une bille de sépharose. Toutes les protéines non capturées sont éliminées par les étapes de centrifugation. La protéine est ensuite libérée de l’anticorps et du support solide en faisant bouillir dans un tampon de chargement d’échantillon réducteur SDS-PAGE.
La co-immunoprécipitation est effectuée de la même manière, sauf que les complexes protéiques intacts sont capturés sur le support solide. L’anticorps se lie à la protéine cible, qui, à son tour, est liée à une autre protéine qui n’est pas ciblée par l’anticorps. Comme dans l’immunoprécipitation, le complexe protéique est libéré de l’anticorps et du support solide par ébullition dans un tampon de chargement d’échantillon SDS-PAGE réducteur.
Les tests pull-down sont similaires à la co-immunoprécipitation, ne différant que par l’utilisation d’une protéine « appât », par opposition à un anticorps. Grâce à des techniques de biologie moléculaire, cette protéine d’appât est modifiée avec une étiquette d’affinité, telle qu’une série de résidus d’histidine. Ces marqueurs d’affinité sont décrits dans la section « Chromatography-based Biomolecule Separations ». La protéine est ensuite capturée sur un ligand d’affinité immobilisé spécifique à l’étiquette. La protéine capturée est ensuite incubée avec un échantillon qui contient des protéines qui forment des complexes avec l'« appât ». Le complexe protéique est libéré du support d’affinité par lavage avec une solution contenant un analyte compétitif spécifique de l’étiquette sur la protéine « appât ». Les tests pull-down sont utiles pour confirmer les interactions protéiques prédites par la co-immunoprécipitation et pour découvrir des interactions protéiques inconnues.
Maintenant que les principes de la co-immunoprécipitation et des tests de traction ont été discutés, examinons leurs procédures de laboratoire.
Parlons d'abord de la co-immunoprécipitation. À une série de tubes microfuges, on ajoute : un tampon PBS et une solution à 50 % de protéine A-sépharose, un complexe résine-protéine qui se lie à l’anticorps. Les tubes microfuges sont tournés pour assurer une bonne distribution, puis la résine est lavée avec un tampon PBS supplémentaire. Du lysat cellulaire, contenant la protéine souhaitée, et 2 μg d’anticorps sont ajoutés aux tubes de microfuge, et le mélange est tourné pendant 1 h à 4 °C. Les billes sont granulées par centrifugation, le surnageant est jeté et les billes sont lavées trois fois avec un tampon pour éliminer les protéines non liées. Les billes contenant le complexe anticorps-protéine servent à réduire le tampon de chargement d’échantillon SDS-PAGE, à éliminer le complexe de l’anticorps et à être analysées par SDS-PAGE et immunoblottage.
Nous allons maintenant discuter de la procédure des tests pull-down : la protéine « appât » est exprimée dans un plasmide avec l’étiquette d’affinité appropriée. Après avoir atteint la croissance en phase logarithmique, les cellules sont lysées, puis centrifugées. Des billes de streptavidine-sépharose en suspension, qui capturent la protéine « appât » marquée à la biotine, sont pipetées dans un tube de microfuge. Les billes sont ensuite centrifugées et le surnageant est soigneusement éliminé par aspiration. Les billes sont ensuite lavées avec un tampon, centrifugées et le surnageant éliminé.
Les cellules contenant la protéine présumée « proie », qui a une affinité pour la protéine « appât », sont récoltées par centrifugation. Le surnageant est ensuite ajouté dans le tube de microfuge contenant la résine et incubé à 4 °C pendant 3 h sur un agitateur. La résine est ensuite centrifugée, le surnageant éliminé et la résine lavée pour éliminer les protéines non liées. Un tampon d’élution est ajouté à la résine et le mélange est incubé à température ambiante pendant 30 min sur un agitateur. La résine est ensuite centrifugée et le surnageant contenant le complexe souhaité est analysé par immunoblottage.
Maintenant que nous avons passé en revue les procédures, examinons quelques-unes des applications utiles de la co-immunoprécipitation et des tests de traction.
La co-immunoprécipitation peut être utile pour mieux comprendre le mécanisme d'action des enzymes. Les protéines de résistance aux myxovirus, ou Mx-, inhibent un large éventail de virus, y compris la grippe A, dont le mécanisme est mal compris. La co-immunoprécipitation a été utilisée pour étudier l’interaction entre la protéine Mx1 de souris et la nucléoprotéine de la grippe.
Les tests pull-down se sont avérés utiles pour étudier les effets des seconds messagers, qui sont des protéines qui communiquent un signal de l’environnement cellulaire. Ils sont un composant d’une voie de signalisation où plusieurs protéines interagissent en réponse à des signaux environnementaux. Les ions calcium agissent comme des messagers secondaires en se liant à la calmoduline, qui, à son tour, se lie à une grande variété de protéines, médiant de nombreux types de réponses biologiques. Sans calcium, la protéine ne peut pas se lier à la calmoduline. Un test pull-down a été effectué pour tester la capacité des protéines à se lier à la calmoduline en présence ou en l’absence d’ions calcium.
Les tests de co-immunoprécipitation et de pull-down sont généralement utilisés pour analyser les interactions protéiques stables ou fortes, mais pas les interactions transitoires. Un développement récent dans le domaine des tests pull-down, le HaloTag, a simplifié l’étude des interactions protéiques transitoires ; HaloTag est un marqueur de fusion de protéines génétiquement codé, fusionné à la protéine d’intérêt, capable de réagir chimiquement avec un support solide d’haloalcane. Si une analyse fonctionnelle est souhaitée, le complexe protéique, moins l’étiquette, dans son intégralité, pourrait alors être isolé par incubation avec de la protéase virale de gravure du tabac.
Vous venez de regarder la vidéo de JoVE sur la co-immunoprécipitation et les tests de traction. Cette vidéo décrivait les principes des deux méthodes, les procédures générales de laboratoire et certaines de leurs applications.
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Les interactions protéine-protéine jouent un rôle important dans une grande variété de fonctions biologiques. La majorité des interactions protéine-protéine et leurs effets biologiques n’ont pas encore été identifiés. La co-immunoprécipitation, ou CoIP, et les tests pull-down sont deux méthodes étroitement liées pour l’identification d’interactions protéine-protéine stables. Cette vidéo couvrira les principes des deux tests, leurs procédures générales de laboratoire et les applications de ces techniques.
Les tests CoIP et pull-down sont des variantes de l’immunoprécipitation, une méthode permettant d’isoler sélectivement une espèce protéique à partir d’une solution complexe. Dans une expérience d’immunoprécipitation, on permet à un anticorps spécifique d’une protéine cible de former un complexe immunitaire avec cette cible dans l’échantillon. Le complexe est ensuite capturé sur un support solide, généralement la protéine A liée à une bille de sépharose. Toutes les protéines non capturées sont éliminées par les étapes de centrifugation. La protéine est ensuite libérée de l’anticorps et du support solide en faisant bouillir dans un tampon de chargement d’échantillon réducteur SDS-PAGE.
La co-immunoprécipitation est effectuée de la même manière, sauf que les complexes protéiques intacts sont capturés sur le support solide. L’anticorps se lie à la protéine cible, qui, à son tour, est liée à une autre protéine qui n’est pas ciblée par l’anticorps. Comme dans l’immunoprécipitation, le complexe protéique est libéré de l’anticorps et du support solide par ébullition dans un tampon de chargement d’échantillon SDS-PAGE réducteur.
Les tests pull-down sont similaires à la co-immunoprécipitation, ne différant que par l’utilisation d’une protéine « appât », par opposition à un anticorps. Grâce à des techniques de biologie moléculaire, cette protéine d’appât est modifiée avec une étiquette d’affinité, telle qu’une série de résidus d’histidine. Ces marqueurs d’affinité sont décrits dans « Chromatography-based Biomolecule Separations ». La protéine est ensuite capturée sur un ligand d’affinité immobilisé spécifique de l’étiquette. La protéine capturée est ensuite incubée avec un échantillon qui contient des protéines qui forment des complexes avec l'« appât ». Le complexe protéique est libéré du support d’affinité par lavage avec une solution contenant un analyte compétitif spécifique de l’étiquette sur la protéine « appât ». Les tests pull-down sont utiles pour confirmer les interactions protéiques prédites par la co-immunoprécipitation et pour découvrir des interactions protéiques inconnues.
Maintenant que les principes de la co-immunoprécipitation et des tests de traction ont été discutés, examinons leurs procédures de laboratoire.
Parlons d’abord de la co-immunoprécipitation. À une série de tubes microfuges, on ajoute : un tampon PBS et une solution à 50 % de protéine A-sépharose, un complexe résine-protéine qui se lie à l’anticorps. Les tubes microfuges sont tournés pour assurer une bonne distribution, puis la résine est lavée avec un tampon PBS supplémentaire. Du lysat cellulaire, contenant la protéine souhaitée, et 2 μg d’anticorps sont ajoutés aux tubes de microfuge, et le mélange est tourné pendant 1 h à 4 °C. Les billes sont granulées par centrifugation, le surnageant est jeté et les billes sont lavées trois fois avec un tampon pour éliminer les protéines non liées. Les billes contenant le complexe anticorps-protéine servent à réduire le tampon de chargement d’échantillon SDS-PAGE, à éliminer le complexe de l’anticorps et à être analysées par SDS-PAGE et immunoblottage.
Nous allons maintenant discuter de la procédure des tests pull-down : la protéine « appât » est exprimée dans un plasmide avec l’étiquette d’affinité appropriée. Après avoir atteint la croissance en phase logarithmique, les cellules sont lysées, puis centrifugées. Des billes de streptavidine-sépharose en suspension, qui capturent la protéine « appât » marquée à la biotine, sont pipetées dans un tube de microfuge. Les billes sont ensuite centrifugées et le surnageant est soigneusement éliminé par aspiration. Les billes sont ensuite lavées avec un tampon, centrifugées et le surnageant éliminé.
Les cellules contenant la protéine présumée « proie », qui a une affinité pour la protéine « appât », sont récoltées par centrifugation. Le surnageant est ensuite ajouté au tube de microfuge contenant la résine, et incubé à 4 ? C pendant 3 h sur un agitateur. La résine est ensuite centrifugée, le surnageant éliminé et la résine lavée pour éliminer les protéines non liées. Un tampon d’élution est ajouté à la résine et le mélange est incubé à température ambiante pendant 30 min sur un agitateur. La résine est ensuite centrifugée et le surnageant contenant le complexe souhaité est analysé par immunoblottage.
Maintenant que nous avons passé en revue les procédures, examinons quelques-unes des applications utiles de la co-immunoprécipitation et des tests de traction.
La co-immunoprécipitation peut être utile pour mieux comprendre le mécanisme d’action des enzymes. Les protéines de résistance aux myxovirus, ou Mx-, inhibent un large éventail de virus, y compris la grippe A, dont le mécanisme est mal compris. La co-immunoprécipitation a été utilisée pour étudier l’interaction entre la protéine Mx1 de souris et la nucléoprotéine de la grippe.
Les tests pull-down se sont avérés utiles pour étudier les effets des seconds messagers, qui sont des protéines qui communiquent un signal de l’environnement cellulaire. Ils sont un composant d’une voie de signalisation où plusieurs protéines interagissent en réponse à des signaux environnementaux. Les ions calcium agissent comme des messagers secondaires en se liant à la calmoduline, qui, à son tour, se lie à une grande variété de protéines, médiant de nombreux types de réponses biologiques. Sans calcium, la protéine ne peut pas se lier à la calmoduline. Un test pull-down a été effectué pour tester la capacité des protéines à se lier à la calmoduline en présence ou en l’absence d’ions calcium.
Les tests de co-immunoprécipitation et de pull-down sont généralement utilisés pour analyser les interactions protéiques stables ou fortes, mais pas les interactions transitoires. Un développement récent dans le domaine des tests pull-down, le HaloTag, a simplifié l’étude des interactions protéiques transitoires ; HaloTag est un marqueur de fusion de protéines génétiquement codé, fusionné à la protéine d’intérêt, capable de réagir chimiquement avec un support solide d’haloalcane. Si une analyse fonctionnelle est souhaitée, le complexe protéique, moins l’étiquette, dans son intégralité, pourrait alors être isolé par incubation avec de la protéase virale de gravure du tabac.
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