Préparation tranches rétiniennes fraîches de poisson-zèbre adulte pour Ex Vivo des expériences d’imagerie

L’objectif global de cette procédure est de préparer des tranches fraîches de rétines de poisson-zèbre pour des expériences nécessitant l’imagerie en direct de protéines fluorescentes ou de biocapteurs. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur la vision, telles que les rôles physiologiques et métaboliques des ions calcium dans des types de cellules et des compartiments cellulaires spécifiques au sein d’une rétine. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit des informations spatiales et temporelles sur les métabolites clés et les molécules de signalisation dans les tissus vivants.

Pour permettre d’éliminer l’épithélium pigmentaire rétinien, ou EPR, du poisson zèbre, adaptez le poisson pendant une heure avant de faire des coupes de tissu. Pour une chambre de tranchage, peignez des lignes de vernis à ongles sur une lame. À l’aide de vernis à ongles transparent, peignez des lignes étroites pour créer un rectangle.

Repeignez le vernis une fois qu’il est sec. Si la chambre doit être utilisée pour l’imagerie statique ou des expériences d’injection avec un débit de solution minimal, utilisez une seringue pour appliquer deux bandes parallèles de vaseline sur une lamelle, d’un centimètre de long et de 0,5 centimètre de distance. Préparez maintenant les lames.

Tout d’abord, nettoyez un rasoir à double tranchant avec de l’éthanol et laissez-le sécher à l’air. Ensuite, utilisez des ciseaux pour le couper en morceaux d’environ un centimètre. Ensuite, placez la chambre de tranchage sur la platine de la trancheuse à tissus, centrez-la horizontalement sur la platine et marquez le bord long avec un marqueur permanent pour l’alignement.

Ensuite, chargez un morceau de lame sur le bras de la trancheuse. Fixez la lame de sorte que le bord soit au milieu de la diapositive et soit parallèle à la surface de la diapositive, mais ne touche pas le vernis à ongles. Abaissez ensuite le bras de la lame à l’aide d’un quart de tour.

Maintenant, essayez de trancher du papier filtre. Remontez la lame si nécessaire. Pour procéder, à l’aide de la seringue, déposez un seul petit point de gelée dans un plat de 10 centimètres, à environ 1,5 centimètre du point médian.

Appuyez ensuite sur le côté sec d’une lamelle dans la gelée à l’aide d’une pince. Ensuite, placez un autre petit point de gelée à environ un centimètre du bord d’entrée de la chambre d’imagerie. Maintenant, utilisez une aiguille de calibre 20 pour faire deux fines bandes parallèles de vaseline d’un centimètre de long dans le sens de la longueur le long du centre de la chambre de tranchage à environ un centimètre de distance.

Transférez ensuite le poisson-zèbre dans un plat et disloquez le poisson par le col de l’utérus sans le décapiter. Maintenant, utilisez une boucle de fil pour desserrer le tissu conjonctif autour d’un œil, puis tirez doucement l’œil vers l’avant. Ensuite, coupez soigneusement le nerf optique blanc sous l’œil à l’aide de microciseaux, mais ne coupez pas l’arrière de l’œil.

Pour continuer, transférez l’œil dans un plat de solution froide de Ringer sur de la glace. Récoltez ensuite l’autre œil. Continuez à travailler sous une lumière rouge jusqu’à ce que tout le RPE soit retiré.

Ensuite, transférez un œil dans une goutte de solution froide de Ringer sur une lame de verre sur une boîte de Pétri. Placez ensuite la parabole sous un microscope de dissection de faible puissance pour disséquer l’œilleton sous une lumière rouge. Tout d’abord, percez la cornée avec une pince fine.

Ensuite, utilisez des pinces et des ciseaux pour retirer délicatement des morceaux de cornée claire et cassante et de sclère argentée. Retirez et jetez ensuite la lentille et la majeure partie de la sclérotique pour isoler l’œilleton. Avec une manipulation minimale, retirez tous les morceaux de graisse et de sclérotique qui restent attachés à l’œilleton sans enlever la rétine.

Si la rétine se sépare de l’EPR, faites preuve d’une prudence accrue pour éviter d’endommager la rétine délicate. Maintenant, repositionnez l’œilleton avec le côté ouvert vers le bas et coupez-le en trois ou en quartiers avec une nouvelle lame. Jetez les morceaux d’œilleton qui sont trop incurvés pour s’aplatir.

Ces pièces sont souvent trop petites pour être utiles dans tous les cas. Pour monter les sections de rétine, mouillez un morceau de papier filtre avec la solution de Ringer et utilisez une pince plate pour le placer à côté des morceaux d’œilletons. Plongez ensuite le papier filtre et les mouchoirs dans la solution froide de Ringer.

Ensuite, à l’aide d’une pince, positionnez les morceaux de rétine sur le papier filtre avec l’EPR et les photorécepteurs vers le haut. Manipulez délicatement les bords des morceaux de l’œilleton à l’aide d’une pince fine pour les orienter en une seule ligne au centre du papier filtre. Maintenant, aplatissez la rétine à l’aide d’une pince pour soulever le papier filtre avec la rétine attachée et placez-le sur une serviette en papier sèche.

Pendant environ trois secondes, laissez la force de l’évacuation du liquide dans l’essuie-tout aplatir la rétine. Traitez tous les morceaux de rétine de cette manière, mais ne les laissez pas se dessécher. Maintenant, appliquez une goutte de la solution de Ringer et utilisez des pinces fines pour retirer toutes les feuilles noires restantes d’EPR du tissu.

Décollez doucement, et si la rétine se soulève du papier, évacuez plus de solution comme avant et il devrait s’aplatir à nouveau. Maintenant, transférez le papier avec des morceaux de rétine sur une lame et coupez le papier en un rectangle en laissant environ 0,5 centimètre de chaque côté de la rangée de tissus. Ensuite, déplacez le papier filtre dans la chambre de tranchage préparée.

Enfoncez les bords longs du papier filtre dans les fines lignes de vaseline à l’aide d’une pince, puis plongez les rétines dans trois à quatre gouttes de solution froide de Ringer. Tout d’abord, transférez la préparation à l’étape de la trancheuse à tissus. Positionnez le bord long le long de la ligne marquée et fixez les extrémités de la chambre à la platine avec du ruban adhésif de laboratoire.

Ensuite, en commençant par une extrémité, coupez la rétine et le papier filtre en exerçant une pression ferme et douce sur le bras de tranchage. Vérifiez que la première tranche a été entièrement coupée, puis utilisez le micromètre pour couper des tranches d’environ 400 microns d’épaisseur. Ensuite, transférez la chambre avec des sections tranchées dans la boîte de Pétri contenant la lamelle préparée, qui servira d’échelle d’imagerie.

Inondez la parabole de solution froide de Ringer et placez-la sur la platine du microscope de dissection. Maintenant, sous un faible grossissement, utilisez la pince pour fixer une bande et la déplacer sur l’échelle d’imagerie en faisant glisser la boîte de Pétri sous-jacente. Faites pivoter les tranches de 90 degrés et enterrez les bords du papier filtre dans la gelée.

Il est important de garder la rétine immergée et d’éviter tout contact direct avec la rétine. Ensuite, repositionnez les tranches dans les échelles de manière à ce que les couches de la rétine soient clairement visibles. Pour les tranches à chaque extrémité de l’échelle, faites en sorte que la rétine soit tournée vers l’intérieur vers les autres tranches afin de minimiser le mouvement pendant l’injection ou l’écoulement.

Jetez les tranches qui n’adhèrent pas bien au papier. Maintenant, colorez le tissu. Pendant ce temps, préparez la chambre d’imagerie et l’appareil d’injection.

Tout d’abord, rincez le tube avec la solution de Ringer, jusqu’à ce qu’il ne reste plus de bulles d’air. Ensuite, fixez le tube à l’entrée de la chambre d’imagerie et fermez le robinet d’arrêt. Ensuite, remplissez la seringue avec la solution injectable et rattachez-la à la tubulure.

Maintenant, utilisez une pince pour transférer l’échelle d’imagerie préparée dans la chambre d’imagerie. Pressez-le dans le point de gelée près du bord de l’entrée et remplissez la chambre avec la solution de Ringer pour couvrir les tranches. Procédez ensuite à l’imagerie.

En utilisant les techniques décrites, des coupes parfaitement transversales peuvent être imagées à travers toutes les couches rétiniennes. Lorsqu’ils sont légèrement tournés, des faisceaux des segments extérieurs seront visibles. Grâce à la coloration PI, les cellules mortes peuvent être éliminées de l’analyse.

Les photorécepteurs sains PI-négatifs ont une morphologie allongée polarisée stéréotypée. Lorsqu’ils sont dans des cellules Ringer oxygénées, ils peuvent être imagés jusqu’à quatre heures. Une stratégie d’imagerie consiste à visualiser la dynamique du réticulum endoplasmique des photorécepteurs coniques par rapport au noyau.

En utilisant des tissus qui expriment la GFP et le cône ER, tout en contre-colorant avec un colorant nucléaire. Une stratégie similaire peut être utilisée pour visualiser le cytosquelette d’actine avec du tissu exprimant de l’actine fusionnée à la GFP. À l’aide de l’imagerie en accéléré, il est possible d’observer des dynamiques cellulaires telles que les fluctuations cytosoliques du calcium dans un photorécepteur conique.

Par exemple, tout en appauvrissant isotoniquement le sodium dans la chambre d’imagerie, GCaMP peut être utilisé pour visualiser l’augmentation des concentrations de calcium cytosolique. En quantifiant les réponses de fluorescence à partir de segments externes à cône unique, de corps cellulaires et de synapses, la dynamique intracellulaire du calcium peut être déterminée lors de manipulations pharmacologiques et ainsi de suite. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’utiliser le voyant rouge avant de retirer le RPE.

Aplatissez soigneusement les œilletons avant de les trancher et gardez les tranches immergées en tout temps. Une fois maîtrisés, le curage tissulaire, le tranchage et la préparation à l’imagerie peuvent être effectués en moins de 30 minutes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des tranches rétiniennes de poisson-zèbre pour étudier le métabolisme et la physiologie de types de cellules spécifiques dans les compartiments cellulaires.