Name: Roman la microscopie photoacoustique et tomographie par cohérence optique Dual-modalité Chorio-rétinienne imagerie dans les yeux de lapin vivant (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Découvrez l'imagerie chorio-rétinienne par microscopie photoacoustique et tomographie par cohérence optique chez le lapin vivant. Cette méthode non invasive permet de visualiser la saturation en oxygène et la distribution sanguine oculaire.

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Ce travail a été soutenu par le généreux soutien de la 4K12EY022299 de l’Institut National d’oeil (PMJ), lutte pour Sight-International rétinienne Research Foundation FFS GIA16002 (PMJ), sans restriction soutien du ministère de la recherche pour prévenir la cécité et les Département d’ophtalmologie de l’Université du Michigan et Sciences de la vision. Ce travail a utilisé le Centre Core for Vision Research financé par P30 EY007003 du National Eye Institute.

Les lapins sont qu'un United States Department of Agriculture (USDA) a couvert les espèces. Son utilisation dans la recherche biomédicale doit suivre des règles strictes. Toutes les expériences de lapin ont été effectuées conformément à la déclaration de l’ARVO (The Association for Research in Vision and Ophthalmology) pour l’utilisation des animaux en ophtalmique et Vision Research, après l’approbation du protocole animal de laboratoire de l’Université Comité sur l’utilisation et aux soins des animaux (UCUCA) de l’Université du Michigan (protocole PRO00006486, Yannis Paulus PI).
1. configuration du système
<ol><li>Microscopie photoacoustique (PAM)<ol>
<li>Utilisation d’un oscillateur paramétrique optique (OPO) laser pompé par un laser solide pompé par diode comme source lumineuse des spécifications techniques appropriées PAM. Select, tels que taux de répétition d’impulsion 1kHz, pouls Durée 3-6 ns et longueurs d’onde accordable 405-2600 nm.</li>
		<li>Réflexion du faisceau émane du laser à 570 nm par deux miroirs (M1 et M2), puis faire passer à travers un atténuateur de demi-onde plaque monté sur un filtre motorisé de platine de rotation et enfin mise au point et il collimater par un collimateur de faisceau (Figure 1). Optimiser la conception du collimateur de faisceau. Un exemple de configuration le collimateur faisceau comprend une lentille de focalisation L1 (longueur focale 250 mm), un trou d’épingle (diamètre 50 µm) et un collimateur L2 (longueur focale 30 mm).</li>
		<li>Diviser le faisceau collimaté par un séparateur de faisceau (BS1) avec un coefficient de fractionnement de 90/10 (réflexion/transmission). Enregistrer la partie transmise par une photodiode pour la surveillance de l’énergie pulse-pulse laser. Successivement dévier la partie réfléchie par un miroir (M3) et d’un miroir dichroïque (DM) et raster-scan à l’aide d’un galvanomètre à deux dimensions. Le galvanomètre est un composant partagé avec le domaine spectral (SD)-système d’OCT (décrit ci-dessous).</li>
		<li>Remettre le faisceau numérisé à travers un télescope composé d’une lentille de scan (longueur focale 36 mm) et une lentille ophtalmique (OL, focale 10 mm) et enfin le focus sur le fond de l’oeil par l’optique oeil de lapin.</li>
		<li>Sélectionnez un transducteur ultrasonore en forme d’aiguille avec spécifications techniques appropriées, par exemple, la fréquence centrale 27 MHz, bidirectionnel −6 dB bande passante 60 %. Placez-le au contact de la conjonctive hors l’axe visuel central pour capter le signal photoacoustique excité.</li>
		<li>Amplifier le signal à l’aide d’un amplificateur à ultrasons (par exemple, 57 dB de gain), il filtre par un filtre passe bas (par exemple, la fréquence de coupure 32 MHz) et il numériser par un numériseur haute vitesse à une fréquence d’échantillonnage de 200 MÉCH. / s.</li>
		<li>Place un wattmètre qui précède le lapin des yeux et mesure l’énergie d’impulsion laser sur la cornée de lapin pour le garder sous la sécurité ANSI limiter 160 nJ à 570 nm38. Bloquer le faisceau pour éviter une surexposition de laser à l’aide d’un obturateur de laser contrôlé à partir de Matlab par une électronique de synchronisation.</li>
		<li>Synchroniser le laser, le galvanomètre et le numériseur à travers une carte d’acquisition (DAQ) de données. Programmer le logiciel pour système contrôle et acquisition de données dans Matlab.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tomographie en cohérence optique spectral-domaine (SD-OCT)<ol>
<li>Adapter le système SD-OCT basé sur un système disponible dans le commerce en ajoutant une lentille ophtalmique (OL) après la lentille de scan (SL) et un morceau de verre de compensation de dispersion (DCG) dans le bras de référence (Figure 1). La modification permet que le système de l’OCT peut l’image du segment postérieur de l’oeil du lapin.</li>
		<li>Utiliser un tube de logement zoom pour ajuster la longueur du bras de référence afin d’assurer son match avec la longueur du trajet optique du bras de l’échantillon. Un iris permet de contrôler l’intensité de la lumière rétro-réfléchi de référence afin d’assurer son match avec intensité lumineuse éparpillés à l’arrière de le œil du lapin pour atteindre le contraste de l’image maximale.</li>
		<li>Utiliser une caméra de dispositif à couplage de charge (CCD) encapsulée dans la tête de balayage pour la visualisation en temps réel du fundus de lapin avec un éclairage diode électroluminescente (del comme source d’éclairage externe).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. alignement du système
<ol><li>Initialiser la position du galvanomètre et aligner le système OCT en ajustant les vis de la monture de collimateur de fibre et le cube de diviseur de faisceau. Remarque : Les procédures détaillées sont disponibles dans le manuel du système OCT commercialement acquis et ne seront pas couverts ici. Cette étape est principalement d’assurer l’alignement correct du collimateur de la fibre, le bras de référence et l’objectif de balayage pour maximiser le rendement du système OCT.</li>
	<li>Ajustez la position x, yet z de la sténopé autour de l’objet de la lentille de focalisation à filtrer dans l’espace le faisceau laser et transmettre au maximum l’énergie laser. Vérifiez la hauteur du faisceau laser avant et après le trou d’épingle à l’aide d’un outil de mesure de hauteur pour s’assurer qu’elles sont les mêmes.</li>
	<li>Ajuster les tilt, décentrer et la position z du collimateur L2 à collimater le faisceau filtré. Faire en sorte que le faisceau a environ de même taille et la hauteur observée dans le champ proche et le champ lointain.</li>
	<li>Coaxialement combiner le faisceau laser de PAM et le faisceau lumineux de l’OCT en syntonisant les inclinaisons du miroir et le SM. Après cette étape, PAM laser et lumière OCT devraient être entièrement coïncidentes et balayage des régions sur le œil du lapin sont les mêmes.</li>
	<li>Réglage de l’inclinaison et décentrer de la lentille de l’OL pour l’aligner correctement dans le chemin optique. Une fois cela fait, le système de double-modalité est prêt pour l’imagerie. Remarque : Une pouvez utiliser la méthode auto-collimation pour y parvenir, c'est-à-dire vérifiant la lumière arrière-réfléchie par la surface des lentilles OL pour s’assurer qu’elle remonte le long de la même manière que la lumière incidente.</li>
</ol>3. préparation lapin
<ol><li>Prendre un lapin blanc de Nouvelle-Zélande de l’animalerie et enregistrer les informations individuelles, telles que numéro de l’organisme animal et de poids.</li>
	<li>Monter des plates-formes de lapin, y compris le soutien de l’organe et le support de tête sur la table optique sous le système d’imagerie. Mettre une couverture de chauffage à circulation d’eau sur le soutien de l’organe et régler la température de l’eau en circulation à 38 ° C, pour aider à maintenir la température du corps du lapin chaud pendant la durée de l’expérience et la récupération.</li>
	<li>Enregistrer les données vitales de procédure préalable, y compris l’État dans l’ensemble animal, couleur de la muqueuse, fréquence cardiaque, fréquence respiratoire et la température corporelle rectale. Anesthésier le lapin avec un mélange de kétamine (40 mg/kg) et de xylazine (5 mg/kg) par injection intramusculaire (IM) et enregistrer l’utilisation de la kétamine (substance réglementée de l’annexe III). Confirmer le niveau de l’anesthésie en vérifiant sa fréquence cardiaque, fréquence respiratoire et état général.</li>
	<li>Dilater les pupilles de lapin à l’aide d’une goutte de Tropicamide 1 ophtalmique et phényléphrine chlorhydrate 2,5 % ophtalmiques.</li>
	<li>Utiliser un spéculum pour tenir les paupières de la route et appliquez une goutte de lubrifiant oculaire afin d’humidifier la cornée. Instiller une goutte de tétracaïne topique 0,5 % dans le œil avant la procédure d’imagerie. Remarque : Pour les plus longs des procédures ou avec un inconfort possible à l’animal, donner le lapin une injection sous-cutanée de meloxicam avant l’expérience pour assurer le confort animal.</li>
</ol>4. l’imagerie SD-OCT
<ol><li>Transférer le lapin à la plate-forme d’imagerie d’une caméra de fond de œil clinique et prendre 50 degrés des images du fond de œil, rouge gratuit et autofluorescence avant l’OPO session d’imagerie. Cela permet de vérifier la transparence optique de le œil et reconnaître la morphologie de navire du fundus et monuments, comme le nerf optique et le système vasculaire rétinien de rayons médullaires.</li>
	<li>Transférer le lapin dans la plate-forme du système OCT et ajuster sa posture pour positionner à peu près un des yeux sous le permis d’exploitation. Illuminer le œil à l’aide de la lumière LED. Remarque : Pour faciliter la traduction clinique de la technique, aux yeux de lapin ne sont pas stabilisés à l’aide d’autres méthodes, et la tête de lapin est vient de mettre sur le support de tête sans aucune fixation.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel OCT et vérifiez d’abord l’image de la caméra CCD du fond de le œil. Finement, ajuster la hauteur et l’angle de l’appui tête si nécessaire pour assurer la région d’intérêt (ROIs), tels que choroïdienne navires et vaisseaux rétiniens, sont dans le champ de vision (FOV) de la caméra. Remarque : Si le lapin est sous un niveau de bonne anesthésie, une séance d’imagerie séquentielle peut durer aussi longtemps que 10 min sans la nécessité d’un réajustement de la tête de lapin.</li>
	<li>Dessiner une ligne droite pour représenter le OCT B-scan d’intérêt et lancer le balayage. Ajuster la longueur de bras de référence pour visualiser l’image de l’OCT et optimiser le facteur de compensation de dispersion dans le logiciel OCT pour obtenir les images les plus nettes. Remarque : Lorsque vous ajustez la longueur de bras de référence, deux images OCT miroirs apparaîtra l’un après l’autre. La bonne image se distinguaient basée sur une connaissance préalable de l’anatomie de le œil.</li>
	<li>Définir les paramètres d’acquisition de données, tels que le nombre de pixels et moyennes et enregistrer des images.</li>
	<li>Observer la fréquence respiratoire et la fréquence cardiaque du lapin pour estimer le niveau de l’anesthésie et l’animal confort. Pour les sessions plus longues, une dose d’un tiers de kétamine supplémentaire ou inhalation isoflurane sont envisageables avec l’intubation endotrachéale, un V-gel ou un masque facial pour maintenir le plan de l’anesthésie si nécessaire.</li>
	<li>Rincer la cornée de lapin avec douche oculaire toutes les 2 min pendant l’expérience pour prévenir la déshydratation de surface cornéenne et cornéen superficiel kératopathie épithéliale ponctuée. Vitals animaux surveiller et enregistrer toutes les 15 min.</li>
</ol>5. PAM imagerie
<ol><li>Porter des lunettes de protection laser approprié et allumer l’appareil de l’OPO.</li>
	<li>Lancez le logiciel de contrôle de PAM, régler la longueur d’onde du laser à l’un des pics d’absorption des chromophores ciblés (p. ex., 570 nm pour l’hémoglobine), initialiser la position du galvanomètre et énergie laser moniteur avant de la cornée de lapin afin d’assurer qu’elle est inférieure à la limite de sécurité ANSI.</li>
	<li>Monter le capteur ultrasonique sur une scène en trois dimensions (3D) traduction et positionner la pointe de la sonde au contact de la conjonctive de lapin pointant vers le fond de l’oeil. Utiliser une goutte de lubrifiant oculaire au meilleur couple de la conjonctive de pointe et le lapin du transducteur.</li>
	<li>Allumez l’éclairage LED et de visualiser le fundus lapin via le logiciel Matlab.</li>
	<li>Jeu le ROI balayage (vaisseaux rétiniens ou navires choroïdienne), y compris le centre et la taille physique. Ouvrir l’obturateur de laser et commencez à B-scan de la poutre. Par à peu près aligner le transducteur, on devrait pouvoir voir détection photoacoustique signal sur l’oscilloscope. Si ce n’est pas le cas, ajustez légèrement la position de le œil pour numériser une région différente de la cornée ou de passer à l’autre oeil et de répéter le processus ci-dessus.</li>
	<li>Observer la détection photoacoustique de signaux sur l’oscilloscope et de régler finement la position de la sonde afin de maximiser l’intensité du signal le long de l’ensemble B-scan. Remarque : En raison de la largeur du faisceau limité, transducteur ultrasonique a généralement une petite FOV41. Cette étape détermine la modulation de l’arrière-plan des images finales de PAM. Désalignement conduira à des images de PAM avec arrière-plan hétérogène et dégrader la qualité d’image considérablement.</li>
	<li>Définissez les paramètres d’acquisition de données. Cela inclut le nombre de pixels (e.g., 256 × 256 pixels), fréquence d’échantillonnage (e.g., 200 MÉCH. / s) et la durée du retard. Démarrer l’acquisition de données. Le logiciel Matlab ouvre automatiquement l’obturateur pour passer le faisceau laser, une fois lancée, fermer l’obturateur pour bloquer la poutre lorsque vous avez terminé pour éviter une surexposition de laser. Remarque : Limité par le taux de répétition des impulsions (1 kHz) du laser, il faut environ 1 min pour terminer l’acquisition des données d’une image avec 256 × 256 pixels.</li>
	<li>Traiter les données brutes et de visualiser l’image de PAM en deux dimensions (2D) grâce à l’intensité maximale de projection (MIP)13 ou en 3D par le biais de rendu volumique38.</li>
	<li>Démonter le capteur ultrasonique, rincer l’embout à l’aide de l’eau désionisée et remettre à l’étui de rangement.</li>
	<li>Transférer le lapin à la caméra du fundus et réexaminer le fond de l’oeil. Cette étape permet de vérifier s’il y a des changements morphologiques de le œil après la séance d’imagerie.</li>
	<li>Rincer la cornée de lapin avec douche oculaire toutes les deux minutes pendant l’expérience pour prévenir la kératopathie et déshydratation de surface cornéenne. Vitals animaux surveiller et enregistrer toutes les 15 min. Remarque : Le PAM, OCT et le fond d’imagerie séances prennent environ 1 h.</li>
</ol>6. imagerie post
<ol><li>Après réexamen du fond de œil à l’aide de la caméra de fond d’oeil, déconnecter le V-gel si connecté. Bien rincer l’oeil à l’aide de douche oculaire, appliquer flurbiprofen ophtalmique et néomycine et polymyxine B sulfate pommade ophtalmique de dexaméthasone et fermer le œil.</li>
	<li>Transférer le lapin avec la couverture de circulation d’eau dans une chambre de récupération. Protéger la zone de la lumière et attendez que le lapin se réveille naturellement. Durant cette période, surveiller les signes vitaux animal toutes les 15 min et conserver l’enregistrement et retourner un exemplaire à l’animalerie pour la tenue des dossiers.</li>
	<li>Une fois que le lapin se réveille et est actif, alerte et marche normalement, le transporter à l’animalerie. Si une expérience aiguë est prévue, euthanasier l’animal à l’aide de la solution de l’euthanasie (par exemple., Beuthanasia, 0,22 mL/kg, une injection intraveineuse dans la veine marginale oreille) et de disposer de la carcasse.</li>
	<li>Désactiver le logiciel et le laser. Nettoyer le banc optique.</li>
</ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Un film de larme intact et régulier est essentiel pour des images de haute qualité du fond de œil. Un cinéma de déchirure irrégulière et détériorés peut dégrader significativement image qualité42. Pour préserver l’intégrité du film lacrymal et empêcher la cornée kératopathie ponctuée superficielle, il est essentiel pour lubrifier la cornée à l’aide de douche oculaire très fréquemment, environ toutes les deux minutes. S’il n’y a aucune préoccupation au sujet de l’opacité de le œil, utiliser une lam...

Ces dernières décennies ont vu le développement explosif du champ de photoacoustique biomedical imagerie1,2,3,4,5,6,7 ,,8. Basé sur la conversion de l’énergie de la lumière en son, l’imagerie photoacoustique émergents peuvent visualiser des échantillons biologiques à échelles des organelles, cellules, tissus, organes de petits animaux tout le corps et peut révéler sa anatomiques, fonctionnelles, moléculaires, génétiques, et information métabolique1,2,9,10,11,12. L’imagerie photoacoustique a trouvé des applications dans une gamme de domaines biomédicaux, comme cell biology13,14, biologie vasculaire15,16, neurologie17,18 , oncologie19,20,21,22,23de la dermatologie, pharmacologie24et hématologie25,26. Son application en ophtalmologie, c'est-à-dire photoacoustique oculaire imaging, a attiré des intérêts substantiels à la fois scientifiques et cliniciens et est actuellement à l’étude active.
Contrairement aux couramment utilisé oculaire d’imagerie technologies27, tels que l’angiographie à la fluorescéine (FA) et angiographie de vert d’indocyanine (ICGA) (basé sur le contraste de fluorescence), tomographie à cohérence optique (OCT) (basé sur le contraste de la dispersion des optiques) et ses dérivé angiographie OCT (basé sur le contraste de la motion des globules rouges), photoacoustique oculaire d’imagerie d’absorption optique utilise le mécanisme de contraste. Cela diffère des technologies d’imagerie oculaires classiques et offre un outil unique pour l’étude des propriétés d’absorption optique de le œil, qui sont généralement associées à l’État physiopathologique des tissus oculaires28. À ce jour, significative, excellent travail a été fait dans photoacoustique oculaire d’imagerie29,30,31,32,33,34,35, 36,37, mais ces études se concentrent sur le segment postérieur des yeux des petits animaux, comme les rats et les souris. Le pionnier dans l’étude bien démontre la faisabilité de l’imagerie photoacoustique en ophtalmologie, mais il y a encore un long chemin à parcourir vers la traduction clinique de la technologie depuis tailles de globe oculaire des rats et des souris sont beaucoup plus petits (moins d’un tiers) à celle de l’homme. En raison de la propagation des ondes ultrasoniques sur une beaucoup plus longues distances, signal intensité et qualité d’image peut grandement souffrir lorsque la technique est utilisée pour l’imagerie du segment postérieur de plus grands yeux.
Pour atteindre cet objectif, nous avons récemment rapporté les non invasive, imagerie exempte d’étiquette Chorio-rétinienne chez les lapins vivants à l’aide intégrée microscopie photoacoustique (PAM) et le domaine spectral OCT (SD-OCT)38. Le système a d’excellentes performances et peut visualiser la rétine et la choroïde des yeux des animaux plus gros absorption endogène et contrastes de diffusion des tissus oculaires. Chez les lapins, les résultats préliminaires montrent que la PAM pourrait distinguer non invasive de vaisseaux sanguins rétiniens et choroïdienne individuels à l’aide d’une dose d’exposition laser (80 ~ nJ) significativement inférieures à la limite de sécurité American National Standards Institute (ANSI) (160 nJ) à 570 nm39; et l’outil OPO pourrait résoudre clairement la sclérotique, la choroïde et différentes couches rétiniennes. C’est la toute première démonstration de l’imagerie du segment postérieur de plus grands animaux à l’aide du PAM et pourrait être une étape importante vers la traduction clinique de cette technologie étant donné que la taille du globe oculaire de lapins (18,1 mm)40 est près de 80 % de la longueur axiale de humains (23,9 mm).
Dans ce travail, nous fournir une description détaillée du système dual-modalité d’imagerie et des protocoles expérimentaux utilisés pour l’imagerie non invasive et sans étiquette Chorio-rétinienne chez les lapins vivants et démontrer les performances du système par le biais de rétine représentatif et résultats de l’imagerie choroïdienne.

<table><tbody><tr><td>Système d’imagerie à double modalité</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPO laser</td><td>Ekspla (Vilnius, Lituanie)</td><td>NT-242</td><td></td></tr><tr><td>Atténuateur de faisceau</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>AHWP10M-600</td><td></td></tr><tr><td>Platine de rotation motorisée</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, USA)</td><td>PRM1/MZ8</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur</td> <td>de platine de rotation motoriséThorlabs, Inc. (Newton, NJ, États-Unis)</td><td>TDC001</td><td></td></tr><tr><td>Lentille de mise au point</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, États-Unis)</td><td>AC254-250-B</td><td></td></tr><tr><td>Sténopé</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, États-Unis)</td><td>P50S</td><td></td></tr><tr><td>Lentille collimative</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, États-Unis)</td><td>AC127-030-B</td><td></td></tr><tr><td>Photodiode</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, États-Unis)</td><td>PDA36A&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Obturateur laser</td><td>Vincent Associates Inc. (Toronto, Canada)</td><td>LS6S2T0</td><td></td></tr><tr><td>Pilote d’obturateur laser</td><td>Vincent Associates Inc. (Toronto, Canada)</td><td>VCM-D1</td><td></td></tr><tr><td>Miroir dichroïque</td><td>Semrock, Inc. (Rochester, NY, États-Unis)</td><td>Di03-R785-t3-25&times ; 36</td><td></td></tr><tr><td>Lentille de balayage</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, États-Unis)</td><td>OCT-LK3-BB</td><td></td></tr><tr><td>Lentille ophtalmique</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, États-Unis)</td><td>AC080-010-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>Transducteur à ultrasons</td><td>Optosonic Inc. (Arcadia, CA, États-Unis)</td>Amplificateur <td>personnalisé</td><td></td></tr><tr><td></td><td>L3 Narda-MITEQ (Hauppauge, NY, États-Unis)</td><td>AU-1647</td><td></td></tr><tr>Mini-circuits de<td>filtre passe-bande</td><td> (Brooklyn, NY, États-Unis)</td><td>BLP-30+</td><td></td></tr><tr><td>Numériseur</td><td>DynamicSignals LLC (Lockport, IL, USA)</td><td>PX1500-4&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Électronique de synchronisation</td><td>National Instruments Corporation (Austin, TX, États-Unis)</td><td>Module OCT USB-6353</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, États-Unis)</td><td>Ganymede-II-HR</td><td></td></tr><tr><td>Verre de compensation de dispersion</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, États-Unis)</td><td>LSM03DC</td><td></td></tr><tr><td>Éclairage LED</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, États-Unis)</td><td>MCWHF2&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Capteur de puissance</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, États-Unis)</td><td>S121C&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Interface de capteur de puissance</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, États-Unis)</td><td>PM100USB&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Outil de mesure de la hauteur&nbsp ;</td><td>Thorlabs, Inc. (Newton, NJ, États-Unis)</td><td>Caméra de</td> fond d’œil BHM1 <td></td></tr><tr><td></td><td>Topcon Corporation (Tokyo, Japon)&nbsp ;</td><td>TRC 50EX</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks (Natick, MA, États-Unis)</td><td>Oscilloscope 2017a</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Teledyne LeCroy (Chestnut Ridge, NY, États-Unis)</td><td>WaveJet 354T</td><td></td></tr><tr><td>Expérimentation animale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Couverture de circulation d’eau</td><td>Stryker Corporation (Kalamazoo, MI, États-Unis)</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de kétamine injection</td><td>Par pharmaceutical, Inc. (Woodcliff Lake, NJ, USA)</td><td>Code NDC 42023-115-10</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de xylazine</td><td>VetOne (Boise, ID, USA)</td><td>Code NDC 13985-704-10</td><td></td></tr><tr><td>Tropicamide ophtalmique</td><td>Akorn Pharmaceuticals Inc. (Lake Forest, IL, USA)</td><td>Code NDC 17478-102-12</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de phényléphrine ophtalmique</td><td>Paragon BioTeck, Inc. (Portland, OR, USA)</td><td>Code NDC 42702-102-15</td><td></td></tr><tr><td>Lubrifiant pour les yeux</td><td>Hub Pharmaceuticals LLC (Rancho Cucamonga, CA, États-Unis)</td><td>Code NDC 17238-610-15</td><td></td></tr><tr><td>Douche oculaire</td><td>Altaire Pharmaceuticals, Inc. (Aquebogue, NY, USA)</td><td>Code NDC 59390-175-18</td><td></td></tr><tr><td>Solution ophtalmique de chlorhydrate de tétracaïne</td><td>Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, États-Unis)</td><td>Code NDC 24208-920-64</td><td></td></tr><tr><td>Flurbiprofène sodium solution ophtalmique</td><td>Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, États-Unis)</td><td>Code NDC 24208-314-25</td><td></td></tr><tr><td>Sulfates de néomycine et de polymyxine B et onguent ophtalmique à la dexaméthasone</td><td>Bausch & Lomb, Inc. (Rochester, NY, États-Unis)</td><td>Code NDC 24208-795-35</td><td></td></tr><tr><td>Injection de méloxicam</td><td>Henry Schein Inc. (Queens, NY, États-Unis)</td><td>Code NDC 11695-6925-1</td><td></td></tr></tbody></table>

roman la microscopie photoacoustique et tomographie par cohérence optique dual-modalité chorio-rétinienne imagerie dans les yeux de lapin vivant

Novel Photoacoustic Microscopy and Optical Coherence Tomography Dual-modality Chorioretinal Imaging in Living Rabbit Eyes

Photoacoustique imagerie oculaire est une émergence ophtalmique technologie qui peut visualiser une façon non envahissante de tissus oculaires en convertissant l’énergie lumineuse en ondes sonores et est actuellement à l’étude intensive de l’image. Cependant, les plus signalés à ce jour se concentre sur l’imagerie du segment postérieur des yeux des petits animaux, comme les rats et les souris, qui pose des défis pour la traduction humaine clinique en raison des tailles petit globe oculaire. Ce manuscrit décrit une microscopie photoacoustique roman (PAM) et le système de double-modalité de tomographie par cohérence optique pour l’imagerie du segment postérieur des yeux des grands animaux, tels que des lapins. La configuration du système, alignement du système, préparation animaux et dual-modalité protocoles expérimentaux pour in vivo, non invasive et sans étiquette Chorio-rétinienne d’imagerie chez les lapins sont détaillées. L’efficacité de la méthode est démontrée par les résultats expérimentaux représentatifs, dont la vascularisation rétinienne et choroïdienne obtenue par le PAM et les PTOM. Ce manuscrit fournit un guide pratique pour reproduire les résultats de l’imagerie chez le lapin et l’avancement photoacoustique imagerie oculaire chez les animaux plus gros.

Le système dual-modalité d’imagerie et le protocole expérimental ont été testés avec succès en laboratoire des auteurs à l’aide de quatre lapins néo-zélandais blancs. Ce qui suit présente quelques résultats représentatifs.
La figure 1 illustre le schéma du système d’imagerie double-modalité de PAM et SD-OCT. Il est composé des modules suivants : photoacoustique light source, atténuateur variable las...

Ce manuscrit décrit la nouvelle configuration et consignes d’utilisation de la microscopie photoacoustique et système de double-modalité tomographie par cohérence optique pour l’imagerie non invasive et sans étiquette Chorio-rétinienne de grands animaux, tels que les lapins.

Roman la microscopie photoacoustique et tomographie par cohérence optique Dual-modalité Chorio-rétinienne imagerie dans les yeux de lapin vivant

Photoacoustic ocular imaging is an emerging ophthalmic imaging technology that can noninvasively visualize ocular tissue by converting light energy into ...

L’objectif global de cette nouvelle configuration d’imagerie et de cette procédure opératoire est d’effectuer une double modalité de microscopie photoacoustique et de tomographie par cohérence optique pour l’imagerie choriorétinienne non invasive et sans marquage des yeux de grands mammifères, tels que les lapins. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en imagerie ophtalmique sur la profondeur d’imagerie, la résolution et la traduction clinique nécessaires pour discerner la saturation en oxygène, la distribution du sang et la mélanine chez les animaux de grande taille. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une visualisation non invasive du tissu oculaire pour l’acquisition d’images de microscopie photoacoustique et de tomographie par cohérence optique.Pour commencer, sélectionnez un oscillateur paramétrique optique pompé par un laser à semi-conducteurs à pompe à diode comme source de lumière pour le microscope photoacoustique et utilisez un séparateur de faisceau pour diviser le faisceau assisté par colonne avec un rapport de séparation de 19 réflexion pour 10 transmission. Déviez successivement la partie réfléchie par le miroir M3 et le miroir dichroïque et utilisez un galvanomètre bidimensionnel pour balayer la réflexion. Délivrez le faisceau numérisé à travers un télescope composé d’une lentille numérisée d’une distance focale de 36 millimètres et d’une lentille ophtalmique d’une distance focale de 10 millimètres et focalisez le faisceau sur le fond d’œil par l’optique œil de lapin.Avant de commencer la procédure d’imagerie, placez une couverture chauffante de circulation d’eau sur le support corporel et réglez la température de l’eau en circulation à 38 degrés Celsius. Enregistrez les signes vitaux avant la procédure et confirmez le niveau approprié de sédation par les fréquences cardiaque et respiratoire du lapin. Dilater les pupilles du lapin avec une goutte de tropiciamide 1 % ophtalmique et de chlorhydrate de phényléphrine 2,5 % ophtalmique.Utilisez un amplificateur à ultrasons pour amplifier le signal et filtrez le signal par un filtre passe-bas. Placez un wattmètre au-dessus de l’œil du lapin et mesurez l’énergie de l’impulsion laser sur la cornée du lapin pour la maintenir en dessous de la limite de sécurité de l’American National Standards Institute. Pour permettre à la tomographie par cohérence optique ou au système OCT d’imager le segment postérieur de l’œil de lapin, ajoutez une lentille ophtalmique après la lentille de balayage.À l’aide d’un tube de boîtier à zoom, ajustez la longueur du bras de référence afin de confirmer sa correspondance avec la longueur du chemin optique du bras d’échantillonnage. Pour l’imagerie OCT dans le domaine spectral, placez le lapin sur la plate-forme d’imagerie d’une caméra de fond d’œil clinique et obtenez des images à 50 degrés sans fond d’œil rouge et autofluorée. Ensuite, transférez l’animal sur la plate-forme du système OCT avec un œil sous la lentille ophtalmique.Illuminez l’œil à l’aide de la lumière LED et ouvrez le logiciel OCT. Vérifiez l’image de la caméra CCD du fond d’œil et tracez une ligne droite dans le logiciel pour représenter le balayage OCT B d’intérêt. Commencez le balayage en ajustant la longueur du bras de référence pour visualiser l’image OCT et optimiser le facteur de compensation de dispersion dans le logiciel OCT afin d’obtenir les images les plus nettes.Définissez ensuite les données, les paramètres d’acquisition de données appropriés et enregistrez les images. Pour l’imagerie au microscope photoacoustique, activez le laser oscillateur paramétrique optique. Démarrez le logiciel de contrôle du microscope photoacoustique et réglez la longueur d’onde lase sur l’un des pics d’absorption de la force de chrominance ciblée.Initialisez la position du galvanomètre et surveillez l’énergie du laser avant la cornée du lapin pour confirmer qu’elle est inférieure à la limite de sécurité de l’American National Standard Institute. Cartographiez le transducteur à ultrasons sur une platine de translation tridimensionnelle et placez l’extrémité du transducteur en contact avec la conjonctive de lapin de manière à ce que l’extrémité pointe vers le fond d’œil. Utilisez une goutte de lubrifiant pour les yeux pour mieux coupler l’extrémité de la sonde dans la conjonctive du lapin et allumez la lumière LED.Visualisez le fond d’œil du lapin à l’aide du logiciel MatLab et définissez la zone de balayage d’intérêt, y compris le centre et la taille physique de la région. Ouvrez l’obturateur laser et lancez le balayage B du faisceau, en observant le signal photoacoustique détecté sur l’oscilloscope, et enfin en ajustant la position du transducteur pour maximiser l’intensité du signal tout au long du balayage B si nécessaire. Ensuite, définissez les paramètres d’acquisition des données, traitez les données brutes et visualisez l’image du microscope photoacoustique en deux dimensions.À la fin de la séance d’imagerie, transférez le lapin à la caméra du fond d’œil pour examiner le fond d’œil à la recherche de tout changement morphologique post-imagerie et rincez la cornée du lapin avec un lavage oculaire. Appliquez du flurbiprofène ophtalmique, de la néomycine et des sulfates de polymyxine B et de la pommade ophtalmique à la dexaméthasone sur la cornée et fermez l’œil. Transférez ensuite le lapin et la couverture d’eau circulant dans une chambre de récupération avec surveillance jusqu’à rétablissement complet.Sur cette photographie représentative du fond d’œil, les vaisseaux choroïdiens sont répartis sur la plupart des fonds du lapin, tandis que les vaisseaux rétiniens sont confinés dans le rayon médullaire. Ici, une image typique de microscopie photoacoustique du système vasculaire choroïdien dans le fond d’œil est montrée avec les vaisseaux choroïdiens délimités à haute résolution latérale. Dans cette image scintigraphiée OCT B, la rétine, la choroïde et la sclérotique sont visualisées avec une résolution axiale élevée, les vaisseaux choroïdiens étant observés sous la couche d’épithélium pigmentaire rétinien.En utilisant le système d’imagerie à double modalité, la projection 2D d’intensité maximale et le rendu volumétrique 3D des vaisseaux rétiniens peuvent être obtenus par imagerie photoacoustique. Des coupes orthogonales de l’image 3D montrent comment la microscopie photoacoustique peut également être utilisée pour visualiser les vaisseaux rétiniens individuels qui se trouvent au-dessus de la couche d’épithélium pigmentaire rétinien et pour confirmer les différentes profondeurs auxquelles se trouvent les vaisseaux rétiniens et choroïdiens. Ici, une image scan OCT B montre des vaisseaux rétiniens individuels.Et la couche de fibres nerveuses confirmant les résultats de l’imagerie par microscopie photoacoustique. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ une heure si elle est exécutée correctement via : n’oubliez pas de régler l’irradiance laser à faible ANLI, de fixer des limites pour raviver les lubrifiants une fois les yeux rincés pour éviter la déshydratation et de surveiller l’état du lapin toutes les 15 minutes. Après la procédure, une immunohistochimie automatisée sur lame peut être effectuée pour répondre à une question supplémentaire sur la confirmation du développement de la néovascularisation choroïdienne et pour amplifier le volume de la néovascularisation chez le lapin.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’ophtalmologie pour explorer les maladies choroïdiennes dans des modèles de maladies portant des lapins, y compris des modèles de néovascularisation choroïdienne. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de détecter les vaisseaux sanguins choriorétiniens uniques dans les yeux de lapin à l’aide d’un nouveau système d’imagerie moléculaire multimodale pour le diagnostic précoce de la dégénérescence maculaire liée à l’âge. N’oubliez pas cela.Travailler avec du verre, des chutes, des lasers et des animaux peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que le port de lunettes et de blouses de laboratoire doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Engineering

Ingénierie

Photoacoustique ophtalmologie (PAOM), une modalité d'imagerie optique basée sur l'absorption, fournit l'évaluation complémentaire de la rétine aux technologies actuellement disponibles imagerie ophtalmique. Nous rapportons l'aide de PAOM intégré domaine spectral tomographie par cohérence optique (SD-OCT) pour une utilisation simultanée imagerie rétinienne chez le rat multimodal.

Intégré ophtalmoscopie photoacoustique et Spectral-domaine tomographie par cohérence optique

Source : Jagodzinska, J., et. al., Tomographie par cohérence optique : imagerie des cellules ganglionnaires rétiniennes de souris In Vivo. J. Vis. Exp. (2017)  Dans cette vidéo, nous démontrons l’utilisation de la tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral (SD-OCT) pour imager les couches rétiniennes et évaluer les changements structurels dans un modèle de souris génétiquement modifié avec neuropathie optique.

Imagerie in vivo de la rétine de souris par tomographie par cohérence optique

Ce protocole décrit comment haute résolution techniques d’imagerie comme la tomographie par cohérence optique de domaine spectral et numérisation laser ophtalmologique peut être utilisé dans les petits rongeurs, à l’aide d’un système de plate-forme d’imagerie ophtalmique, pour obtenir des informations sur épaisseur de la rétine et microgliales cellulaire distribution, respectivement.

In Vivo Imagerie des souris journaliste Cx3cr1gfp/gfp avec domaine Spectral Optical Coherence Tomography et numérisation Laser ophtalmologique

Cellules épithéliales pigmentaire rétinien pouvaient constituer une thérapie cellulaire-remplacement de la forme avancée de la dégénérescence maculaire sèche liée à l’âge. Ce protocole décrit la génération d’un modèle grand aux yeux de l’atrophie géographique et la sous-rétinienne transplantation de cellules épithéliales pigmentaire rétinien dérivé de cellules souches embryonnaires humaines dans ce modèle de la maladie.

Sous-rétinienne Transplantation de cellules souches embryonnaires humaines pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules épithéliales dans un modèle grand aux yeux de l’atrophie géographique

Nous présentons ici un protocole pour obtenir un grand champ de vision (FOV) en trois dimensions (3D) fluorescence et l’image rétinienne OCT en utilisant une nouvelle plate-forme multimodale d’imagerie. Nous allons introduire la configuration du système, la méthode de l’alignement et les protocoles opérationnels. L’imagerie in vivo sera démontrée, et recevront les résultats représentatifs.

Multimodal d’imagerie rétinienne volumétrique Oblique à balayage Laser ophtalmologique (oSLO) et la tomographie en cohérence optique (OCT)

Un protocole détaillé pour l’évaluation des afficheurs structurels et visuelles chez les rongeurs par réaction d’optocinétique et de tomographie par cohérence optique est présenté. Les résultats fournissent des indications précieuses pour la recherche ophtalmologique ainsi que neurologique.

Utilisant la tomographie par cohérence optique et réponse optocinétique comme lectures structurale et fonctionnelle de système visuel chez les souris et les Rats

Ici, nous décrivons l’utilisation de la tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral (SD-OCT) pour visualiser les structures rétiniennes et oculaires in vivo dans des modèles de dégénérescence rétinienne, de glaucome, de rétinopathie diabétique et de myopie.

Évaluations structurales in vivo des maladies oculaires dans des modèles de rongeurs utilisant la tomographie par cohérence optique

L’imagerie in vivo est un outil puissant pour l’étude de la biologie dans la santé et la maladie. Ce protocole décrit l’imagerie transpupillaire de la rétine de la souris avec un microscope standard à deux photons. Il démontre également différentes méthodes d’imagerie in vivo pour marquer par fluorescence plusieurs cohortes cellulaires de la rétine.

Transpupillaire Imagerie in vivo à deux photons de la rétine de souris

Nous décrivons ici une technique d’imagerie in vivo utilisant la tomographie par cohérence optique pour faciliter le diagnostic et la mesure quantitative de la rétinopathie chez la souris.

Application de la tomographie par cohérence optique à un modèle murin de rétinopathie

Ce protocole décrit une méthode fiable pour obtenir des cryosections de haute qualité d’yeux de lapin entiers. Il détaille les procédures de dissection, de fixation, d’intégration et de sectionnement de l’œil de lapin, qui peuvent être facilement adaptées pour être utilisées dans toute étude utilisant l’immunohistochimie dans des yeux plus grands.

Obtention de cryosections de haute qualité d’œil de lapin entier 

Découvrez l'imagerie chorio-rétinienne par microscopie photoacoustique et tomographie par cohérence optique chez le lapin vivant. Cette méthode non invasive permet de visualiser la saturation en oxygène et la distribution sanguine oculaire.

Roman la microscopie photoacoustique et tomographie par cohérence optique Dual-modalité Chorio-rétinienne imagerie dans les yeux de lapin vivant (Vidéo) | JoVE Journal

Roman la microscopie photoacoustique et tomographie par cohérence optique Dual-modalité Chorio-rétinienne imagerie dans les yeux de lapin vivant

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