Perturbation de gène hautement efficace des cellules progénitrices hématopoïétiques murins et humains par CRISPR/Cas9

L’objectif global de ce protocole est d’obtenir une perturbation génétique rapide et efficace par CRISPR/Cas9 et les cellules progénitrices hématopoïétiques primaires en utilisant une approche ribonucléoprotéique. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans les domaines de l’hématopoïèse normale et maligne, telles que les conséquences moléculaires et phénotypiques de la perte du gène X.Le principal avantage de cette technique est qu’elle est extrêmement facile, rapide et rentable. Le temps estimé nécessaire entre la conception de l’expérience et l’exécution est inférieur à une semaine.

Bien que cette méthode ait été optimisée pour les cellules progénitrices hématopoïétiques, elle peut être appliquée à d’autres types de cellules, telles que les cellules T primaires, les lignées cellulaires hématopoïétiques de souris et d’humains et les échantillons de leucémie primaire. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons réalisé que d’autres approches d’administration CRISPR/Cas9, y compris les plasmides et les virus, étaient soit toxiques pour nos cellules, soit avaient des délais d’exécution lents. Afin de concevoir des ARN à guide unique d’intérêt, rendez-vous d’abord sur le site Web de CRISPRscan.

En fonction de la cellule d’intérêt, appuyez sur le bouton Souris ou Humain, puis entrez le gène d’intérêt dans le champ de recherche UCSC et cliquez sur go. Ensuite, zoomez sur l’exon que vous souhaitez cibler. Vérifiez si des séquences cibles d’ARN à guide unique sont répertoriées sous la rubrique Prédictions CRISPRscan sur les gènes.

Ensuite, cliquez sur un ARN monoguide cible étiqueté par un rectangle vert et copiez la séquence complète affichée sous la séquence Oligo. Collez ensuite la séquence dans un document texte. Ensuite, ajoutez les nucléotides ATAGC aux trois extrémités premières de la séquence.

Passez la commande pour la séquence complète. Maintenant, pour synthétiser la matrice d’ADN de l’ARN à guide unique, dissolvez puis diluez les amorces avant et inverse universelles de l’ARN à guide unique. Ajoutez ensuite tous les réactifs dans un tube PCR pour effectuer la PCR qui se chevauche.

Après avoir constitué la réaction PCR, placez le tube dans un thermocycleur et exécutez le programme. Une fois le programme terminé, purifiez le produit PCR à l’aide de colonnes de purification d’ADN. Diluez l’ADN dans 11,5 microlitres de tampon d’élution.

Ensuite, utilisez le tampon d’élution comme blanc sur le spectrophotomètre. Mesurez la concentration de l’ADN de l’échantillon sur le spectrophotomètre. Tout d’abord, mélangez l’ADN élué, les phosphates désoxynucléotidiques, le tampon de réaction et l’enzyme ARN polymérase T7 dans les tubes de bandelettes PCR.

Ensuite, incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant quatre heures. Ensuite, appliquez l’agent de nettoyage RNase pour éliminer la RNase des gants utilisés. Ensuite, ajustez le volume de chaque échantillon d’ARN à 50 microlitres avec de l’eau sans nucléases.

Purifiez l’ARN en suivant les instructions du fabricant. Enfin, éluez l’ARN dans 50 microlitres d’eau sans nucléases. Tout d’abord, utilisez l’eau exempte de nucléases pour masquer le spectrophotomètre, puis mesurez la concentration de l’ARN élué.

Utilisez l’exclusion du bleu trypan pour compter le nombre de cellules. Pour chaque répétition, prélevez 200 000 cellules viables par répétition, puis ajoutez une solution saline tamponnée au phosphate pour laver les cellules. Ensuite, faites tourner le tube à 300 fois g pendant sept minutes.

Après la centrifugation, retirez soigneusement le surnageant. Au cours de la centrifugation, incuber 1,5 microgramme de Cas9 avec un microgramme d’ARN monoguide total dans un tube PCR pendant 20 à 30 minutes. Il s’agit de préparer les complexes RNP Cas9-sgRNA pour chaque réplication.

Après avoir calculé le volume du tampon de remise en suspension T nécessaire, dissoudre la pastille cellulaire obtenue dans le tampon de remise en suspension T. Ajoutez ensuite 10 microlitres de suspension cellulaire dissoute dans le tube PCR avec les complexes Cas9-sgRNA RNP. Ensuite, allumez l’unité d’électroporation. Faites glisser la cuvette dans le porte-cuvette.

Ajoutez ensuite trois millilitres de tampon E.Réglez les conditions sur le dispositif d’électroporation. Pour effectuer l’électroporation, tenez d’abord la pipette d’électroporation, puis étendez la griffe et saisissez le disque à l’intérieur de la pointe de la pipette, puis appuyez fermement sur la pipette pour fixer la pointe. Ensuite, mélangez l’échantillon en le pipetant 10 fois de haut en bas.

Prélevez 10 microlitres de l’échantillon et assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air. Ensuite, insérez l’embout directement dans le tampon électrolytique de la cuvette d’électroporation. Appuyez ensuite sur Démarrer à l’écran.

Laissez le message complet apparaître à l’écran. Retirez ensuite la pipette de la cuvette. Ensuite, versez le contenu de la cuvette dans le puits rempli d’un nouveau milieu de culture HSPC.

Pour étudier l’efficacité de l’électroporation de la RNP Cas9-sgRNA, les HSPC isolées chez les souris sont électroporées avec de la RNase à guide unique ciblant soit la GFP, soit la tdTomato. Ces HSPC exprimaient de manière ubiquitaire la GFP ou la tomate. L’analyse cytométrique en flux montre une perte d’expression d’environ 75 et 74 % de la GFP ou de la tdTomato dans les HSPC au niveau protéique.

Ensuite, un test basé sur l’endonucléase T7 est effectué avec de l’ADN amplifié par PCR à partir du locus GFP des cellules électroporées. Il s’agit de quantifier l’efficacité de la GFP en matière de perturbation génique. Le logiciel ImageJ est utilisé pour calculer le rapport entre les intensités des bandes clivées et des bandes non clivées afin de calculer le pourcentage de clivage.

L’efficacité de trois ARN monoguides différents ciblant le CD45 humain est testée dans la lignée cellulaire HL-60 AML. La cytométrie en flux montre que l’ARN1 à guide unique est le plus efficace avec une efficacité de 98 % par rapport au contrôle. Ensuite, l’inactivation de CD45 est également réalisée dans les HSPC CD34 positives primaires du sang de cordon ombilical humain à l’aide d’ARN1 à guide unique.

L’analyse par cytométrie en flux montre que près de 80 % des cellules présentent une perte de CD45 sans altération de l’expression de CD34 par rapport à Cas9 uniquement. Afin d’étudier la greffe de HSPC humaines knock-out CD45, des cellules de la moelle osseuse et de la rate sont prélevées sur des souris NSG transfectées rétro-orbitales CD34 positives pour analyse, montrant que les cellules modifiées sont HLA-ABC positives et CD45 négatives. Une fois maîtrisé, ce protocole peut être complété en trois jours, s’il est effectué corrigé.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de garder toutes les surfaces et tous les réactifs exempts de RNase, de vérifier l’efficacité de la perturbation génique à l’aide de plusieurs techniques et d’utiliser les contrôles expérimentaux appropriés. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de concevoir, synthétiser et transfecter les ribonucléoprotéines Cas9-sgRNA dans des cellules progénitrices hématopoïétiques pour obtenir une perturbation génétique rapide et efficace.