Name: Dérivation des cellules souches embryonnaires humaines par Immunosurgery (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-13T00:28:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Apprenez la dérivation de cellules souches embryonnaires humaines par immunochirurgie pour la biologie des cellules souches. Cette méthode permet d'isoler la masse cellulaire interne et d'établir des lignées viables.

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AEC est membre de la Jane Coffin Childs Memorial Fund pour la recherche médicale et de laboratoires de recherche Merck. Nous remercions D. Egli et C. Cowan pour des conseils d&#39;expérimentation et de discussion.

<html> Frozen embryons humains utilisés pour la dérivation de cellules souches humaines embryonnaires humaines (hES) ont été donnés pour la recherche après consentement éclairé appropriée en vertu des protocoles de recherche qui ont été examinés et approuvés tant par le Comité sur l&#39;utilisation de sujets humains et les cellules souches embryonnaires de surveillance du comité de recherche à l&#39;Université Harvard . Protocole écrit ci-dessous est basée sur des paramètres publié rapportés par Cowan et al. 2004, avec de légères modifications. Culture des embryons Dégel des embryons humains en utilisant Kit Quinn Avantage dégel et la culture en gouttes de milieu mondiale complétée par Plasmanate 15% jusqu&#39;au développement jusqu&#39;au stade blastocyste élargi. Immunosurgery basée sur l&#39;isolement de la masse cellulaire interne Préparation: <ol><li> Préparer les plaques pour le retrait de la zone pellucide et immunosurgery (voir ci-dessous) en mettant en place des gouttes de chaque solution dans des assiettes de 10 cm. Superposition avec l&#39;huile minérale pour éviter l&#39;évaporation. Préparer une seule rangée par embryon destiné à la dérivation. <ul><li> EmbryoMax Tyrodes acide, utiliser tel quel. </li><li> les médias dérivation de cellules hES: 75% KO-DMEM, 10% KO-Sérum remplacement, Plasmanate 10%, 2,5% des cellules ES testé sérum fœtal bovin (FBS), 2 mM Glutamax-I, 1% de non-acides aminés essentiels, 50 unités / ml de pénicilline, la streptomycine 50μg/ml, 0.055mM b-mercaptoéthanol, 5ng/ml bFGF. </li><li> Lapin anticorps anti-humain de globules rouges primaire, reconstitué selon la suggestion du fabricant, dilué à 1:10 avec les médias dérivation de cellules hES. </li><li> Guinée-sérum de porc complément, reconstitué selon la suggestion du fabricant, dilué à 1:10 avec les médias dérivation de cellules hES. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_9_18_6/574_Figure-01.png" alt="574_Figure-01" width="600" height="166" /> </li></ul></li><li> Equilibrer toutes les plaques à 37 ° C en incubateur de culture tissulaire avant utilisation. </li><li> Tirez 50 pl-100 ul pipettes capillaires (VWR) pour une utilisation dans des embryons de transfert. Extrémités coupées à la plume de diamants et de l&#39;utilisation avec des tubes pipeter à la bouche équipé d&#39;un filtre 0,2 um. </li></ol> Procédure Immunosurgery: Notes: <ul><li> Dans cette procédure, les cellules du trophectoderme sont détruits par une brève exposition à des anticorps dirigés contre les cellules humaines en tandem avec l&#39;activité du complément. Par conséquent, le protocole fonctionne mieux avec embryons de grande qualité avec un trophectoderme intacte, comme seule l&#39;intégrité structurale du blastocyste empêche l&#39;ICM d&#39;être aussi sensibles à la réaction immunologique. </li><li> Toutes les procédures effectuées en utilisant un champ de dissection équipés de platine chauffante. </li></ul> Étapes: <ol><li> Rincer la pipette bouche pour être utilisé pour le transfert d&#39;embryons avec du FBS embryons pour éviter de coller. </li><li> Transfert blastocyste de boîte de culture pour la tenue hES goutte d&#39;AT plat. </li><li> Début de la procédure par le transfert de blastocyste de déposer hES grâce à une série d&#39;AT gouttes. En troisième baisse, montre pour la dissolution de la zone pellucide (secondes en général 5-30). Attention à ne pas l&#39;intégrité sur-traiter ou de l&#39;embryon peut être compromise. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_2/574_Figure-02.png" alt="574_Figure-02" width="551" height="273" /> </li><li> Blastocyste transfert grâce à une série de médias dérivation de cellules hES gouttes de rincer à l&#39;arrêt. Pipette préchargement avec les médias est recommandé de neutraliser immédiatement la réaction. Blastocystes peut être tenu ici jusqu&#39;à ce que tous ont été au-traitées. </li><li> Transfert blastocyste grâce à une série de gouttes d&#39;anticorps primaires, laissant en troisième baisse pour 30 minutes d&#39;incubation à 37 ° C dans un incubateur de culture tissulaire. </li><li> Blastocyste transfert grâce à une série de médias dérivation de cellules hES tombe à rincer primaire. </li><li> Transfert blastocyste grâce à une série de gouttes complètent, en laissant au troisième baisse de regarder pour la lyse des cellules du trophectoderme. Observez blastocyste pour les 30 premières secondes sur scène pour &quot;bouillonnante&quot; des cellules du trophectoderme comme ils lysent. Si la lyse est observée dans ce délai, gardez plat sur la platine du microscope pour surveiller la réaction jusqu&#39;à son achèvement. Si aucun bullage est observé pendant les 30 premières secondes, retour à la pépinière, en vérifiant toutes les 5 minutes jusqu&#39;à ce que la plupart des trophectoderme a lysées. Cela peut prendre 5-15 minutes. Surveiller de près la réaction afin de minimiser le temps de réaction et les dommages potentiels à la masse cellulaire interne. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_3/574_Figure-03.png" alt="574_Figure-03" width="571" height="273" /> </li><li> Blastocyste transfert grâce à une série de médias dérivation de cellules hES gouttes pour laver l&#39;activité du complément. </li><li> En utilisant une pipette en verre avec un diamètre qui est légèrement plus petit que le blastocyste (tirée de tubes capillaires VWR 10 ul), dessiner le blastocyste haut et bas pour dépouiller la plupart des trophectoderme lysées. g &quot;alt =&quot; 574_Figure-0 &quot;width =&quot; 577 &quot;height =&quot; 270 &quot;/&gt; </li><li> Plaque d&#39;isoler l&#39;ICM sur les cellules nourricières de la mitose des fibroblastes d&#39;embryon de souris inactivées (FAE). FAE devrait être préparé la veille et sont passés à la dérivation de cellules hES dérivation journée des médias d&#39;. 4-plats ainsi NUNC fonctionnent bien pour des mesures initiales de la dérivation. </li><li> Ne pas déranger la plaque pour la première 1-2 jours. Par la suite, chaque jour vérifier excroissance de cellules souches embryonnaires colonies (généralement apparente dans 1-2 semaines). Les médias devraient être changés dans les volumes moitié tous les deux jours commence le jour 3. </li></ol> Excroissance de cellules ES et repiquage Lorsque l&#39;excroissance de cellules hES a atteint environ 0,5 mm ou plus, il est prêt pour l&#39;expansion par la cueillette mécanique. <ol><li> Mécaniquement disperser la moitié de l&#39;excroissance et transfert à de nouvelles plaques contenant mangeoires frais. Touffes de cellules souches embryonnaires doivent être d&#39;environ 30-50 cellules chacune. Laisser l&#39;autre moitié d&#39;excroissance comme un back-up pour le premier passage (P1). L&#39;excroissance (p0) peut être capté à partir plusieurs fois car il continue à se développer. <img src="/files/ftp_upload/old/574_2008_7_21_5/574_Figure-05.png" alt="574_Figure" width="639" height="219" /> </li><li> Colonies secondaires peuvent être également dispersées et étendu à l&#39;ensemble des boîtes de culture plus que les passages 3-5, époque à laquelle les lignées cellulaires de nouvelles peuvent être adaptées aux repiquage enzymatique à la trypsine. Le contenu du sérum des milieux de culture doivent également être progressivement ramenée à 1% et 0% au cours de ces passages initiaux afin de minimiser la différenciation des cellules ES. </li><li> Tous établie lignées cellulaires embryonnaires souches devraient être mis en réserve par le gel jusqu&#39;à une partie de passages tôt pour de futures expansions. </li><li> En outre, chaque lignée cellulaire devrait être caractérisé par l&#39;analyse du caryotype et validé par des études de pluripotence et différenciation in vitro et in vivo. </li></ol>

<ol><li>Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Whitmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S. P., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+embryonic+stem-cell+lines+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22N+ENGL+J+MED%22%5BJournal%5D)">Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts.</a> N ENGL J MED. 350 (13), 1353-1356 (2004).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Le protocole présenté ici fournit aux chercheurs une présentation concise, facile à suivre aperçu de la façon de dériver des lignées cellulaires embryonnaires souches par l&#39;isolement immunosurgical de la masse cellulaire interne.

<table><tbody><tr><td>Kit de décongélation Quinn&amp;rsquo;s Advantage </td><td>Sage</td><td>ART-8016</td><td></td></tr><tr><td>Milieu Global</td><td>Life Global</td><td>GMGB-050</td><td></td></tr><tr><td>Plasmanate</td><td>Talecris</td><td>61325</td><td></td></tr><tr><td>Acidité de Tyrode EmbryoMax</td><td>Chemicon International</td><td>MR-004-D</td><td></td></tr><tr><td>KO-DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>Substitut sérique KO</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal testé pour cellules ES, défini</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>Acides aminés non essentiels</td><td>Invitrogen</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance fibroblastique basique humain recombinant</td><td>Invitrogen</td><td>13256-029</td><td></td></tr><tr><td>Bêta-mercapto&amp;#8211;éthanol </td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps primaire anti-érythrocytes humains de lapin</td><td>Rockland Immunochemicals</td><td>109-4139</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de complément de cobaye</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1639</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes capillaires de 10 µL, 50 µL, 100 µL</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes buccales avec tubulure</td><td>VWR international</td><td></td><td>fournies avec les pipettes capillaires de VWR</td></tr><tr><td>Filtre à seringue Acrodisc de 0,2 µm </td><td>Pall Corporation</td><td>PN4192</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA à 0,5 %</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope stéréoscopique Nikon SMZ1500 équipé d'un plateau chauffant Nikon Tokai Hit ThermoPlate </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellules fibroblastiques embryonnaires de souris (E12,5)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dérivation des cellules souches embryonnaires humaines par immunosurgery

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

La capacité des cellules souches embryonnaires humaines à se renouveler et se différencier en tous les types cellulaires du corps donne à penser qu&#39;ils sont très prometteurs pour les applications médicales et comme un outil de recherche pour aborder les questions fondamentales dans le développement et la maladie. Ici, nous fournissons un résumé concis, étape par étape de protocole pour la dérivation de cellules souches embryonnaires humaines à partir d&#39;embryons par l&#39;isolement immunosurgical de la masse cellulaire interne.

Dérivation des cellules souches embryonnaires humaines par Immunosurgery

La capacité des cellules souches embryonnaires humaines à s'auto-renouveler et à se différencier en tous les types cellulaires de l'organisme suggère qu'elles sont très prometteuses tant pour...

Bonjour, je m'appelle Alice Chen. Je suis postdoctorante dans le laboratoire de melting et aujourd'hui, je vais vous montrer comment nous obtenons des cellules souches embryonnaires à partir d'embryons humains. Nous recevons des embryons à différents stades de développement et nous les cultivons in vitro jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade approprié de blastocyste élargi.Voici des exemples de la manière dont l'embryon se développe depuis le premier stade, celui de la cellule unique, jusqu'au stade de blastocyste précoce, puis au blastocyste élargi, à partir duquel nous obtenons les cellules souches embryonnaires humaines. Les embryons de haute qualité sélectionnés pour l'obtention sont ensuite transférés à travers trois gouttes de milieux ACE, où on les laisse et on surveille la dissolution de la zone pellucide. Le processus de déplétion immunologique est un processus non spécifique au cours duquel l'anticorps anti-humain de lapin se lie à la couche externe des cellules.Dans ce cas, il s'agit du trio derm. Après l'ajout de complément de sérum de cobaye, toutes ces cellules auxquelles des anticorps sont fixés seront lysées. Pour commencer, nous souhaitons préparer trois plaques.La première plaque est destinée aux tyros ACE, que nous utilisons pour éliminer le zita. Les deuxième et troisième plaques sont destinées à la chirurgie immunologique. Je vais d'abord commencer par générer la plaque sur laquelle nous placerons les gouttes de tyros acides et la dérivation de cellules souches embryonnaires humaines.Gouttes de milieu. Préparez trois gouttes d'acide tyros du côté gauche de la plaque, et du côté droit de la plaque, préparez trois gouttes de milieu de culture de cellules souches humaines. La seconde plaque contient l'anticorps primaire, qui est un anticorps polyclonal de lapin anti-globules rouges humains.À nouveau, le côté gauche de la plaque sera réservé à l'anticorps primaire, avec trois gouttes par embryon, et le côté droit de la plaque sera réservé à la culture de cellules souches embryonnaires humaines. Gouttes de milieu, là encore, trois gouttes par embryon pour la plaque de complément. Nous placerons de nouveau trois gouttes de complément sur le côté gauche de la plaque, puis trois gouttes de milieu de culture de cellules souches embryonnaires humaines sur le côté droit de la plaque.À nouveau, chaque ligne est dédiée à un embryon. Les trois plaques sont recouvertes d'huile minérale afin d'éviter l'évaporation, puis placées dans l'incubateur pour équilibrage. Il s'agit d'un microscope de dissection installé dans une cabine de prélèvement propre, équipée d'un flux laminaire, similaire à celle utilisée en culture tissulaire, et c'est dans cet espace que nous réalisons la majeure partie de nos manipulations d'embryons humains.La première chose à préparer avant de commencer à travailler avec vos embryons est la pipette buccale. Il s'agit d'un tube de pipette buccale standard, sauf que nous avons inséré un filtre de 0,2 micron entre votre bouche et l'extrémité où se placerait la pipette. Cela permet simplement d'assurer l'asepsie.Laissez-moi vous montrer comment tirer des pipettes buccales. J'aime fabriquer une variété de tailles. Vous pouvez toutes les obtenir chez VWR, et j'aime réaliser des diamètres de 10 microlitres, 50 microlitres et 100 microlitres.J'utilise maintenant une broche en diamant pour couper le tube de montage. Pour cette première étape, vous devez utiliser un diamètre assez grand, car vous manipulez l'embryon entier. Les embryons de haute qualité sélectionnés pour la dérivation sont ensuite transférés à travers trois gouttes.Des gouttes OFCI passent simplement de la première goutte à la deuxième goutte, puis à la troisième goutte, où vous les laissez et observez la dissolution de la zap palita. Ce processus prend généralement moins de 30 secondes, et vous pouvez effectivement voir la zop palita se dissoudre. Lorsque la zap palita est complètement dissoute.Les embryons sont ensuite transférés à travers trois gouttes de milieu de culture humain Es, en passant par la première, la deuxième et la troisième goutte de lavage. Ensuite, l'embryon est transféré dans les gouttes d'anticorps primaire, en passant à nouveau de la première à la deuxième puis à la troisième goutte, où il reste pendant une demi-heure d'incubation dans l'incubateur de culture tissulaire. La lyse du trifecta derm devient apparente lorsque vous observez des bulles apparaître sur les cellules situées à l'extérieur de l'embryon. C'est le début de la lyse des cellules dermiques du trifecta.Lorsque la lyse est visible sur tout le pourtour externe de l'embryon, l'embryon est alors prêt à être lavé à travers trois gouttes de milieu de culture humanus. Après la chirurgie immuno, les embryons sont triturationnés mécaniquement à l’aide d’une pipette buccale de plus petit calibre. Ce pipetage buccal doit avoir un diamètre inférieur à celui de la première pipette afin de rendre le processus de trituration plus efficace pour enlever la trifecta lysée.Cellules dermiques. À la fin de l'agitation mécanique, il reste un agrégat de cellules au centre. On y trouve la masse cellulaire interne, qui est intacte.Autour de cette structure, on trouve de nombreuses cellules dermiques trifecta lysées, ainsi que quelques cellules dermiques trifecta intactes. L'isolat de masse cellulaire interne est ensuite placé dans un puits préparé avec une couche de cellules nourricières d'embryon de souris. La plaque de cellules nourricières a été préparée la veille au soir, et ce matin j'ai changé le milieu, en passant du milieu pour fibroblastes embryonnaires de souris au milieu de dérivation pour cellules souches humaines.L'isolat de la masse cellulaire interne est ensuite transféré des gouttes de lavage après complémentation dans ce puits contenant les cellules de la couche d'alimentation. Cette boîte est ensuite replacée dans l'incubateur et laissée intacte pendant quelques jours afin de permettre l'attachement de l'isolat de la masse cellulaire interne. Voici un exemple de la manière dont le bourgeonnement se développe.Lorsque l'expansion est suffisamment grande, nous pouvons procéder au premier passage en divisant cette expansion en deux. Il s'est écoulé 14 jours depuis la dérivation initiale, et voici un exemple d'expansion provenant de l'une de nos dérivations.Il s'agit d'un exemple de bourgeonnement de ce type, dont je vais prélever aujourd'hui la moitié. Ce bourgeonnement sera divisé en deux moitiés, puis découpé en morceaux carrés, et chacun de ces morceaux sera transféré dans un nouveau puits contenant des cellules nourricières. Il est conseillé de laisser intacte la moitié du bourgeonnement afin de disposer d'une source continue de cellules à laquelle vous pourrez vous référer ultérieurement pour amplifier vos cellules et sauvegarder tous les passages que vous effectuerez.Pendant les deux ou trois premiers passages, il est conseillé d'effectuer le passage de manière mécanique, puis d'adapter progressivement les cellules à une dissociation enzymatique pour un conditionnement plus efficace. Notre laboratoire établit systématiquement des lignées de cellules souches embryonnaires humaines afin d'étudier le développement et la différenciation.Ces lignées sont également distribuées dans le monde entier à des chercheurs en cellules souches. Je pense qu'il existe quatre facteurs principaux qui influencent le succès de l'isolement. Le premier concerne la qualité de l'embryon, qui dépend également du fond génétique, de la qualité du congélation-décongélation des embryons, ainsi que de la qualité de la culture in vitro jusqu'au stade d'isolement au stade de la blastocyste.Le deuxième facteur est probablement l'intégrité qualitative de la masse cellulaire interne après l'isolement, ce qui peut dépendre de la technique utilisée pour isoler la masse cellulaire interne et peut également dépendre de l'expérience et du savoir-faire. Le troisième facteur est la qualité de l'attachement de la masse cellulaire interne isolée aux couches d'alimentation, et le quatrième facteur est l'expansion de cet isolat de MCI. Je ne pense pas que ce soit un processus difficile sur le plan technique.Il suffit d'un peu de pratique. En fait, chaque étape est assez simple, donc tant que vous pouvez suivre le protocole, avec un peu d'entraînement, je pense que n'importe qui peut y arriver. Ce que nous avons constaté en laboratoire, c'est que chaque lignée est un peu différente pour des raisons que nous ne comprenons pas entièrement.Par exemple, si vous deviez tester le potentiel de différenciation de 10 lignées, deux ou trois de ces lignées pourraient être plus susceptibles de se développer en le type de cellule qui vous intéresse. Je pense que ces différences sont liées au stade auquel les cellules se trouvaient, au stade de l'embryon à partir duquel les lignées de cellules souches embryonnaires ont été établies, ainsi qu'à la manipulation manuelle de ces cellules. Je crois que leurs propriétés changent parfois, et que l'hétérogénéité des lignées cellulaires et leur potentiel sont des éléments auxquels tout chercheur en cellules souches doit prêter attention.Encore une fois, je ne sais pas ce qui provoque cela, mais certainement, à titre d'exemple pour mes recherches, notre objectif ultime est de produire des cellules bêta du pancréas capables de sécréter de l'insuline. La première étape pour obtenir ce type de lignée cellulaire consiste à générer de l'endoderme à partir de cellules souches embryonnaires, et lors d'une comparaison entre 10 à 20 lignées, nous avons constaté qu'une ou deux de ces lignées peuvent produire efficacement de l'endoderme, tandis que la moitié d'entre elles le font peut-être de manière moins efficace, et certaines ne parviennent pas du tout à bien générer de l'endoderme. Ainsi, grâce à ce processus de criblage initial, nous sélectionnons les cellules ayant une plus forte tendance à former le type cellulaire recherché, puis nous poursuivons la différenciation restante en utilisant ces types cellulaires.La première dérivation de cellules souches embryonnaires humaines a été rapportée par Thompson et al. en 1998, et en 2004, notre laboratoire a rapporté la dérivation de 17 nouvelles lignées de cellules souches embryonnaires humaines. En modifiant ces protocoles publiés, modifications qui visaient simplement à rendre le processus de dérivation plus efficace, nous avons apporté des changements concernant la composition du milieu, la méthode de passage des cellules et la manière dont elles sont congelées et décongelées.Depuis lors, lors de chaque dérivation, nous cherchons de nouvelles façons d'améliorer le protocole et le taux de dérivation. Par exemple, notre laboratoire explore des méthodes alternatives pour isoler la masse cellulaire interne, sans utiliser de réactifs xénogènes comme l'anticorps de lapin ou le complément sérique de cobaye, mais en dissociant mécaniquement la masse cellulaire interne. Espérons que ces méthodes conduiront à une méthode au moins comparable, voire meilleure, pour isoler la masse cellulaire interne.

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