Name: Profonde cutanée Injection comme un modèle d’Infection de la peau de Candida albicans pour les Analyses histologiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Apprenez une injection cutanée profonde avec Candida albicans pour analyser l'activation immunitaire et la localisation cellulaire dans la peau infectée. Cette méthode préserve l'architecture tissulaire.

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FG est pris en charge par l’Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 2016Id.18842), Fondation Cariplo (Grant 2014-0655) et Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB). IZ est pris en charge par les NIH grant 1R01AI121066-01 a 1, 1R01DK115217, grant HDDC P30 DK034854, Harvard Medical School trouvé de Milton, CCFA Senior Research Awards (412708), l’Eleanor et le Miles rive 50e anniversaire du programme de bourses et la Fondation Cariplo ( 2014-0859).

Toutes les procédures ont été approuvés dans le Comité de l’emploi (IACUC) animalier institutionnel et exploités sous la supervision du ministère des ressources animales chez les enfants de l’hôpital (ARC) à l’hôpital pour enfants de Boston ou ont été approuvées par l’italien Ministère de la santé et réalisé par le Comité de protection des animaux institutionnelle à l’Université de Milan-Bicocca.
1. préparation de c. albicans
<ol><li>La culture C. albicans, souche CAF3-113, dans des tubes contenant du milieu riche (levure extrait peptone dextrose (YEPD), extrait de levure 1 % (p/v), 2 % (p/v) de Bacto Peptone, 2 % (p/v) de glucose) additionné de l’uridine (50 mg/L) à 25 ° C. Dans ces conditions, c. albicans se développe comme une levure. Remarque : Autres souches de c. albicans peuvent être utilisés, comme la clinique isoler la souche SC5314 de c. albicans 13. Étant donné que nous avons récemment démontré que le processus ulcéreuse est induit par l’activation du système immunitaire inné14, théoriquement chaque souche de c. albicans qui maintient ses composants de la paroi cellulaire et de la structure, ainsi que la capacité à l’origine des projections des hyphes, pourrait être utilisé.</li>
	<li>Surveiller la culture en comptant la concentration cellulaire en utilisant un analyseur de compteur de cellules.</li>
	<li>Récolter la culture lorsqu’il atteint une concentration d’environ 8 x 106 cellules/mL. Vous pouvez également utiliser un spectrophotomètre pour mesurer l' OD600. Remarque : Généralement, une valeur de OD600 = 1 correspond à une concentration de levure de 3 x 107 cellules/mL, mais le titrage est recommandé.</li>
	<li>Remettre en suspension de la culture dans un milieu YEPD-uridine, utilisant HEPES (50 mM, pH 7,5) comme un agent tampon et incuber la culture à 37 ° C pour induire la formation d’hyphes. Vérifier la formation des hyphes sous un microscope grossissement X 100. Formation des hyphes est visible 5 h après mise en culture à 37 ° C ; Cependant, utiliser les cellules 16 h après incubation à 37 ° C, lorsque le pourcentage des hyphes atteint près de 95 % de la culture totale.</li>
	<li>D’enrichir encore la préparation à la concentration des hyphes, centrifugeuse aliquotes de la culture à 3 300 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant et Resuspendre le culot dans du PBS stérile à une concentration de 1 x 108 hyphes/mL.</li>
</ol>2. profondeur dermique Injection
<ol><li>24h avant la procédure de l’infection, anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de kétamine (80-100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) et ensuite se raser le flanc des souris à l’aide d’une tondeuse électrique. Remarque : Après toute procédure impliquant l’anesthésie, placez les souris sous une lampe chauffante jusqu'à ce qu’ils ont récupéré efficacement.</li>
	<li>Reposer les souris pendant 24 heures afin d’éviter toute inflammation due au processus de rasage.</li>
	<li>24h après l’intervention de rasage, anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de kétamine (80-100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg).</li>
	<li>Vérifier le réflexe de la patte pour s’assurer que les souris sont profondément anesthésiés. Évaluer le réflexe de la patte en pinçant fermement la patte. Si l’anesthésie est obtenu, l’animal ne sent pas de douleur et ne bouge pas.</li>
	<li>Injecter dans le derme profond à l’aide d’une seringue à insuline 0,3 mL avec une aiguille de 30 x 8 mm dans un volume final de 50 µL/injection, correspondant à 5 x 106 hyphes/injection, les hyphes de c. albicans .<ol>
<li>Tendre la peau du flanc rasé à l’aide de deux doigts pour injecter le volume directement dans le derme profond. Insérer l’aiguille à un angle de 10-15° avec le biseau de l’aiguille vers le haut.</li>
		<li>Avec cet angle, l’agent pathogène sera injecté avec une profondeur d’environ 300 à 500 µm. Afin d’assurer que l’injection est bien effectuée, vérifiez que le volume injecté forme une bosse qui est absorbé quelques minutes après l’injection. Remarque : La bosse formée après que l’injection sera d’environ 1 cm2. Il s’agit de la zone qui sera supprimée au point de temps désigné pour l’analyse moléculaire ou histologique.</li>
		<li>Pour des moments de moins de 24 h (recommandé), délimiter la zone d’infection avec un marqueur, puisque la bosse formée avec l’injection persiste pendant quelques minutes, après quoi il est absorbé. Pour les points de temps de 24h ou plus, cette étape n’est pas nécessaire, car un ulcère ou un kyste sera clairement visible.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. exemple de prélèvement et la préparation pour la coloration histologique
<ol><li>Euthanasier les souris selon les procédures institutionnelles.</li>
	<li>À l’aide de pinces chirurgicales, tirer la peau à la frontière du site injecté, précédemment marqué par le marqueur. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, l’accise le site infecté en coupant la peau après la ligne tracée. Remarque : Veillez à séparer la peau du péritoine à l’aide de ciseaux de pointe ogive.</li>
	<li>Immerger la peau dans un moule jetable rempli de température de coupe optimale (OCT), composée de la face interne de la peau vers le haut. Congeler l’échantillon dans l’azote liquide jusqu'à ce que le composé devient blanc. Ne pas laisser l’azote liquide couvre l’échantillon avant il est complètement gelée que cela nuirait à l’échantillon. Remarque : attention ! Au cours de l’étape 3.3, porter un écran facial de protection à l’azote liquide.</li>
	<li>Si les échantillons ne sont pas utilisés immédiatement pour la préparation de la diapositive, rapidement les stocker à-80 ° C. NOTE : Échantillons peuvent être conservés indéfiniment à-80 ° C.</li>
</ol>4. préparation des lames
<ol><li>Couper l’échantillon en deux pour préparer les tranches pour histologie à partir du centre de l’échantillon.</li>
	<li>Couper 5 µm tranches épaisses avec un cryostat. Remarque : Pour les échantillons de peau, la température du cryostat ne doit pas être supérieure à-25 ° C. Une température plus élevée provoque une fusion partielle de la H-OCT et c’est pourquoi les échantillons ne seraient pas maintenus en bonne position au cours de la procédure de coupe.</li>
	<li>Lames de microscope chargés positivement permet de recueillir les tranches.</li>
	<li>Si les tranches collectés ne servent pas peu de temps après la préparation, les stocker à-20 ° C. À ce stade, tranches peuvent être conservés à-20 ° C indéfiniment.</li>
</ol>5. hématoxyline et éosine coloration
<ol><li>Tacher les diapositives par immersion dans l’hématoxyline Gill pendant 4 min. laver les lames dans l’eau courante pendant 5 min.</li>
	<li>Tache de que les diapositives par immersion dans une solution d’éosine Y pendant 1 min. Lavez les diapositives dans la gestion de l’eau du robinet pendant 5 min. Rincer les diapositives à l’aide l’eau distillée avant de continuer le protocole.</li>
	<li>Déshydrater par immersion dans la série des concentrations croissantes de solutions éthanoliques (50 %, 70 %, 80 %, 95 %, 100 %). Plonger les lames pendant 15 s dans chaque solution d’éthanol.</li>
	<li>Désactivez les diapositives pendant au moins 2 min par immersion dans un commissionnaire histologique.</li>
	<li>Monter les diapositives à l’aide du milieu de montage et de lamelles.</li>
	<li>Acquisition d’images des diapositives avec un scanner de diapositives de microscope à un grossissement de X 40.</li>
</ol>6. acide périodique-Schiff (PAS) une coloration
<ol><li>Fixer les lames avec ≥99. 5 % acétone à température ambiante pendant 1 min. laver les lames dans l’eau courante pendant 1 min.</li>
	<li>Tacher les diapositives par immersion dans une solution acide périodique (1 g/dL) pendant 5 min. laver les diapositives de 3 changements d’eau distillée.</li>
	<li>Tacher les diapositives par immersion dans du réactif de Schiff pendant 15 min. laver les lames dans l’eau courante pendant 5 min.</li>
	<li>Tacher les diapositives par immersion dans l’hématoxyline Gill pour 5 min. laver les lames dans l’eau courante pendant 30 s.</li>
	<li>Déshydrater les diapositives par immersion dans 3 changements d’éthanol à 100 %. Plonger les lames pendant 15 s chaque fois.</li>
	<li>Désactivez les diapositives pendant au moins 2 min par immersion dans un commissionnaire histologique.</li>
	<li>Monter les diapositives à l’aide du milieu de montage et de lamelles.</li>
	<li>Acquisition d’images des diapositives avec un scanner de diapositives de microscope.</li>
</ol>7. l’échantillon prélèvement et la préparation pour l’Extraction de l’ARN
<ol><li>Euthanasier les souris selon les procédures institutionnelles. Enlever les échantillons de peau comme dans l’étape 3.2.</li>
	<li>Immerger les échantillons dans un tube à bouchon-pression 2 mL avec 1 mL de réactif pour l’extraction de thiocyanate-phénol-chloroforme guanidinium acide. Remarque : Le protocole peut être suspendu ici et les échantillons peuvent être conservés à-80 ° C.</li>
	<li>Couper l’échantillon en morceaux d’environ 0,2 cm2 à l’aide de pinces chirurgicales. Remarque : attention ! La plupart des réactifs pour les ARN sont mutagènes et toxiques. Les étapes 7.3 et 7.4 doit se faire sous une hotte aspirante.</li>
	<li>Briser l’échantillon avec un moulin à billes à une vitesse de 20 oscillations/s pendant 20 min. par ailleurs, un potier mécanique peut être utilisé.</li>
	<li>Vérifier l’homogénéisation efficace des échantillons en recherchant la présence de pièces intactes de la peau. Répétez cette étape si les échantillons ne sont pas complètement homogénéisées.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons à 16 000 x g pendant 1 min. Gardez les surnageants pour extraction de l’ARN et jeter le culot. Cette étape est effectuée pour éliminer les cheveux et les débris qui pourraient bloquer les colonnes d’extraction.</li>
	<li>Procéder à l’extraction de l’ARN à l’aide de RNA purification colonnes14.</li>
	<li>Un spectrophotomètre permet d’évaluer la concentration et la purification de la RNA. Si RNA extraits ne sont pas utilisés immédiatement pour la préparation de la cDNA, stocker les échantillons à-80 ° C.</li>
</ol>

<ol><li>Belkaid, Y., Segre, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dialogue+between+skin+microbiota+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dialogue between skin microbiota and immunity.</a> Science. 346 (6212), 954-959 (2014).</li>
<li>Kashem, S. W., Kaplan, D. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27178391">Skin Immunity to Candida albicans.</a> Trends Immunol. 37 (7), 440-450 (2016).</li>
<li>Havlickova, B., Czaika, V. A., Friedrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+trends+in+skin+mycoses+worldwide%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Epidemiological trends in skin mycoses worldwide.</a> Mycoses. 51, 2-15 (2008).</li>
<li>Wisplinghoff, H., Bischoff, T., Tallent, S. M., Seifert, H., Wenzel, R. P., Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+Bloodstream+Infections+in+US+Hospitals%3A+Analysis+of+24%2C179+Cases+from+a+Prospective+Nationwide+Surveillance+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Nosocomial Bloodstream Infections in US Hospitals: Analysis of 24,179 Cases from a Prospective Nationwide Surveillance Study.</a> Clin Infect Dis. 39 (3), 309-317 (2004).</li>
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<li>Gaspari, A. A., Burns, R., Nasir, A., Ramirez, D., Barth, R. K., Haidaris, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD86+%28B7-2%29%2C+but+not+CD80+%28B7-1%29%2C+expression+in+the+epidermis+of+transgenic+mice+enhances+the+immunogenicity+of+primary+cutaneous+Candida+albicans+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">CD86 (B7-2), but not CD80 (B7-1), expression in the epidermis of transgenic mice enhances the immunogenicity of primary cutaneous Candida albicans infections.</a> Infect Immun. 66 (9), 4440-4449 (1998).</li>
<li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+Candida+gastrointestinal+colonization+and+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Murine models of Candida gastrointestinal colonization and dissemination.</a> Eukaryot Cell. 12 (11), 1416-1422 (2013).</li>
<li>Mear, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+Airway+Exposure+Primes+the+Lung+Innate+Immune+Response+against+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+through+Innate+Lymphoid+Cell+Recruitment+and+Interleukin-22-Associated+Mucosal+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Candida albicans Airway Exposure Primes the Lung Innate Immune Response against Pseudomonas aeruginosa Infection through Innate Lymphoid Cell Recruitment and Interleukin-22-Associated Mucosal Response.</a> Infect Immun. 82 (1), 306-315 (2014).</li>
<li>Leoni, G., Neumann, P. -A., Sumagin, R., Denning, T. L., Nusrat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair%3A+role+of+immune-epithelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Wound repair: role of immune-epithelial interactions.</a> Mucosal Immunol. 8 (5), 959-968 (2015).</li>
<li>Fonzi, W. A., Irwin, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isogenic+strain+construction+and+gene+mapping+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans.</a> Genetics. 134 (3), 717-728 (1993).</li>
<li>Santus, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+infections+are+eliminated+by+cooperation+of+the+fibrinolytic+and+innate+immune+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skin infections are eliminated by cooperation of the fibrinolytic and innate immune systems.</a> Sci Immunol. 2 (15), (2017).</li>
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<li>Pradeu, T., Cooper, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+danger+theory%3A+20+years+later%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The danger theory: 20 years later.</a> Front Immunol. 3, 287(2012).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous avons décrit une méthode de l’infection à c. albicans pour étudier le processus inflammatoire qui est ouverte sur l’entrée fongique dans le derme profond.
Même si la formation d’abcès de peau est un événement relativement rare lors d’infection à c. albicans 15, injection du champignon directement dans le derme profond permet non seulement l’étude de la formation d’abcès axée sur les champignons, mais aussi l’analyse d’immunitaire spécifique c...

Le corps humain est recouvert d’un nombre extrêmement élevé de micro-organismes. La surface de la peau est l’habitat de presque 1 million de bactéries par centimètre carré1. Sur ce nombre, cependant, ne reflète pas la grande variété de micro-organismes qui colonise la peau. En plus des bactéries, le corps humain est colonisé par plusieurs espèces de champignons dont c. albicans, qui est capable de survivre à la muqueuse et la peau niveau2.
Ces dernières années, le pourcentage de personnes atteintes d’infections fongiques a énormément augmenté. Ceci est principalement dû au nombre plus élevé de personnes immunodéprimées, c'est-à-dire, chez les patients VIH-positifs et les patients qui sont passés par une chimiothérapie ou immunosuppresseurs après transplantation3. Dans une étude de surveillance réalisée aux États-Unis, Wisplinghoff et coll. ont montré que 9,5 % des infections nosocomiales circulation sanguine ont été causés par les espèces de Candida 4. En raison de la présence accrue d’infections fongiques et notamment en raison du pourcentage élevé des espèces de Candida trouvés au cours de septicémies, comprendre comment ce pathogène échappe au contrôle du système immunitaire est extrêmement important.
C. albicans est un champignon dimorphique qui se développe sous différentes formes morphologiques comme levure, blastospores, pseudohyphes et les hyphes selon les conditions environnementales5. Dans sa forme mycélienne, c. albicans montre sa plus grande capacité de pouvoir envahissant et a la capacité de pénétrer l' épithélium6.
C. albicans infections ont été étudiées à l’aide de plusieurs approches expérimentales. Le modèle le plus courant d’infection est l’injection intraveineuse de c. albicans levure7. Toutefois, ce modèle ne prend pas en considération tous les processus qui se produisent avant que le champignon parvient à se propager dans la circulation sanguine. Un autre modèle tire parti de la capacité de c. albicans à envahir l’épithélium. Cette méthode, également connu sous le nom le papier sablé modèle8, a été développée par Gaspari et al. , 1998,9et consiste à l’aide de papier sablé frotter sur la peau, ce qui élimine la couche cornée avant l’application de c. albicans. Cette procédure permet au champignon de pénétrer dans l’épithélium, permettant ainsi l’analyse des capacités invasives de cet agent pathogène. Enfin, les autres modèles des infections pour la gastro-intestinal10 et respiratoires,11 ont été utilisés dans différentes études.
La formation d’une plaie (comme dans le modèle de papier sablé) entraîne l’activation de plusieurs voies, y compris le recrutement de cellules immunitaires et d’activation, afin de favoriser la guérison des processus12. Cela peut altérer ou masquer la réponse immunitaire provoquée spécifiquement contre l’agent pathogène, ce qui conduit à la confusion des résultats.
Nous décrivons ici une méthode d’infection de la peau qui évite la formation de la blessure initiale et l’induction d’un environnement inflammatoire basale. Pour maintenir la structure épithéliale intacte, on injecte directement c. albicans dans sa forme mycélienne dans le derme profond. Même si une seule injection peut déclencher l’inflammation bénigne, le montant de l’inflammation est limité et restreinte par rapport à la formation d’une plaie ouverte, comme dans le modèle de papier sablé. L’approche que nous décrivons ici permet l’étude de la réponse immunitaire à l’infection fongique et propagation tout en évitant l’environnement inflammatoire excessive et préexistant, causée par des lésions mécaniques.

<table><tbody><tr><td><Réactifs fort>s</forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Euroclone</td><td>ECB4053L</td><td>chauds en 37 &deg ; C bain avant utilisation</td></tr><tr><td>Composé H-OCT</td><td>histo-line laboratories</td><td>R0030</td><td></td></tr><tr><td>Gill’s Hematoxilyn</td><td>histo-line laboratories</td><td>09-178-2</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y solution alcoolique</td><td>histo-line</td><td>laboratories 09-209-05</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol absolu</td><td>scharlau</td><td>ET00232500</td><td></td></tr><tr><td>Citro-HISTOCLEAR</td><td>histo-line laboratories</td><td>R0050</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt, support de montage</td><td>bio-optique</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>sigma-aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>système de coloration PAS</td><td>sigma-aldrich</td><td>395B-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Yeast Extract</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose anhydre pour la biologie</td> <td>moléculaireApplichem PanReac</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Merck Millipore</td><td>8451</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Applichem PanReac</td><td>A1070,0500</td><td></td></tr><tr><td>Tubes Safe-Lock 2 mL</td><td>eppendorf</td><td>30121597</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td>Toxique, corrosif et mutagène. Prenez toutes les précautions nécessaires</td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>azote</td><td></td><td></td> liquide <td>Porter une protection oculaire</td></tr><tr><td>Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coulter Counter-Particle Count</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5415 R</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MC 3000 Microtome Cryostat</td><td>histo-line laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TissueLiser</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Matériaux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,3 ml Seringue à insuline avec une aiguille 30G x 8mm&nbsp ;</td><td>BD</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td></td><td></td><td></td>chirurgicale</tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux Moule</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de base jetable</td><td>histo-line laboratoires</td><td>2781</td><td></td></tr><tr><td>Lames de biomicroscope à charge positive</td><td>bio-optica</td><td>09-2000</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles 24 x 50 mm</td><td>11911998</td><td></td> <td>thermo scientifique</td></tr></tbody></table>

profonde cutanée injection comme un modèle d’infection de la peau de candida albicans pour les analyses histologiques

Deep Dermal Injection As a Model of Candida albicans Skin Infection for Histological Analyses

La peau est un organe extrêmement étendu du corps et, en raison de cette grande surface, elle est exposée en permanence aux micro-organismes. Lésions cutanées peuvent facilement conduire à des infections dans le derme, ce qui peut, à son tour, entraîner la dissémination d’agents pathogènes dans la circulation sanguine. Comprendre comment le système immunitaire combat les infections au stade très précoce et comment l’hôte permet d’éliminer les agents pathogènes est une étape importante pour définir la base pour de futures interventions thérapeutiques. Nous décrivons ici un modèle d’infection de Candida albicans qui permet de visualiser les processus qui se produisent au début lors d’une infection, y compris lorsque l’agent pathogène a passé la barrière épithéliale, ainsi que la réponse immunitaire provoquée par le de c. albicans invasion. Nous avons utilisé ce modèle d’infection d’effectuer des analyses histologiques qui montrent les cellules immunitaires qui infiltrent la peau ainsi que la présence et la localisation de l’agent pathogène. Les échantillons prélevés après que l’infection peut être traitée pour l’extraction de l’ARN.

Grâce à l’injection de l’agent pathogène directement dans le derme profond, la morphologie structurale du tissu reste intacte (Figure 1 a).
Le maintien de l’intégrité structurale de la peau permet la détection des cellules immunitaires et leur localisation sur le site de l’infection. Le grossissement supérieur illustré à la Figure 1 b révèle que l’abcès se compose princ...

Nous décrivons ici un protocole qui permet l’analyse histologique et moléculaire des échantillons de peau après injection intradermique de Candida albicans . Ce protocole permet la localisation des cellules immunitaires tissulaires-résident ou nouvellement recrutés, mais aussi la distribution de l’agent pathogène et maintient l’intégrité structurale de la peau.

Profonde cutanée Injection comme un modèle d’Infection de la peau de Candida albicans pour les Analyses histologiques

The skin is an extremely extended organ of the body and, due to this large surface, it is continuously exposed to microorganisms. Skin damage can easily ...

L’objectif global de cette procédure est d’observer l’activation du système immunitaire lors d’infections cutanées en injectant du Candida albicans pour préserver l’architecture de la peau et la localisation de cellules immunitaires et non immunitaires spécifiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine immunologique telles que la nature et la localisation des cellules immunitaires recrutées lors des infections cutanées et les principaux médiateurs impliqués. Le principal avantage de cette technique est le maintien de l’architecture structurelle de la peau après injection fongique qui permet de comprendre la localisation de chaque type de cellules immunitaires.Giulia Stamerra, doctorante du laboratoire du professeur Marina Vai, fera la démonstration d’une partie de la procédure. Pour commencer, inoculez la souche CAF3-1 de C. Albicans dans des tubes contenant un milieu riche complété par 50 milligrammes par litre d’uridine et cultivez à 25 degrés Celsius. Dans ces conditions, C. albicans se développe comme une levure.Surveillez la culture à l’aide d’un analyseur de compteurs de cellules ou d’un spectrophotomètre pour mesurer la concentration cellulaire. Lorsque la culture atteint huit fois 10 à six cellules par millilitre, récoltez l’échantillon. Utilisez le milieu YEPD-uridine avec Hepes comme agent tampon pour remettre les cellules en suspension et les incuber à 37 degrés Celsius pour induire la formation d’hyphes.Après cinq heures de culture, lorsque les hyphes devraient être visibles, au microscope à un grossissement de 100X, vérifiez la formation des hyphes. Cultivez les cellules pendant un total de 16 heures, après quoi 95 % de la culture aura formé des hyphes. Pour enrichir davantage la concentration des hyphes, centrifugez les aliquotes de la culture à 3 300 fois g pendant cinq minutes.Jetez le surnageant et utilisez du PBS stérile pour remettre la pastille en suspension à une concentration de un fois 10 à la huitième hyphe par millilitre. Après avoir anesthésié une souris rasée selon le protocole textuel, vérifiez le réflexe de la patte pour vous assurer que l’animal est profondément sédatif. Pour injecter des hyphes de C. albicans dans le derme profond, utilisez deux doigts pour tendre la peau du flanc rasé, puis insérez une aiguille de calibre 30 de huit millimètres attachée à une seringue d’insuline de 0,3 millilitre à un angle de 10 à 15 degrés, avec le biseau de l’aiguille vers le haut, et injectez un volume final de 50 microlitres correspondant à cinq fois 10 à la sixième hyphe.Si l’angle d’injection est supérieur à 15 degrés, l’agent pathogène sera injecté trop profondément dans le derme, risquant d’endommager le péritoine et, surtout, de perdre la possibilité d’étudier les infections spécifiquement au niveau de la peau. À cet angle, l’agent pathogène sera injecté à une profondeur d’environ 300 à 500 microns. Pour vous assurer que l’injection est bien effectuée, vérifiez que le volume injecté forme une bosse qui est absorbée au bout de quelques minutes.Pour les points temporels de moins de 24 heures, utilisez un marqueur pour marquer la zone d’infection, car la bosse formée par l’injection persiste pendant quelques minutes. Pour les points temporels de 24 heures ou plus, cette étape n’est pas nécessaire, car un ulcère ou un kyste sera clairement visible. Après avoir euthanasié les souris selon les directives de l’établissement, à l’aide d’une pince chirurgicale, tirez la peau à la limite du site injecté préalablement marqué au marqueur, puis, à l’aide de ciseaux chirurgicaux, excisez le site infecté en coupant la peau le long de la ligne marquée.Immergez la peau avec la face interne vers le haut dans un moule de base jetable rempli de composé O.C.T. Congelez l’échantillon dans de l’azote liquide jusqu’à ce que le composé devienne blanc. Ne laissez pas l’azote liquide recouvrir l’échantillon avant qu’il ne soit complètement congelé, car cela endommagerait l’échantillon.Pour préparer les lames, en partant du centre de l’échantillon, coupez l’échantillon en deux pour préparer les coupes pour l’histologie, puis, à l’aide d’un cryostat, coupez des tranches de cinq microns d’épaisseur. Utilisez des lames de microscope chargées positivement pour recueillir les coupes. Pour effectuer une coloration H&E, immergez les lames dans l’hématoxyline de Gill pendant quatre minutes, puis lavez les lames à l’eau courante du robinet pendant cinq minutes.Immergez les lames dans une solution d’éosine-Y pendant une minute, lavez-les à l’eau courante du robinet pendant cinq minutes, puis utilisez de l’eau distillée pour rincer les lames. Ensuite, déshydratez les échantillons en les immergeant dans une série d’éthanol pendant 15 secondes chacun. Pour éliminer les lames, transférez-les dans un agent nettoyant histologique pendant au moins deux minutes, puis utilisez un milieu de montage et des lamelles pour monter les échantillons.Utilisez un scanner de lames de microscope à un grossissement de 40X pour imager les lames. Effectuez une coloration en solution acide menstruelle ou PAS en utilisant de l’acétone à température ambiante pour fixer les lames pendant une minute, puis utilisez l’eau courante du robinet pour laver les lames pendant une minute. Immergez les lames dans le PAS pendant cinq minutes, puis utilisez trois changements d’eau distillée pour laver les échantillons.Ensuite, plongez les lames dans le réactif de Schiff pendant 15 minutes, puis utilisez l’eau courante du robinet pour laver les lames pendant cinq minutes. Immergez l’échantillon dans l’hématoxyline de Gill pendant cinq minutes pour les colorer, puis lavez les lames à l’eau courante du robinet pendant 30 secondes. Déshydrater les échantillons par immersion dans trois changements de 100 % d’éthanol pendant 15 secondes chacun, puis immerger les lames dans un agent de clarification histologique.À l’aide d’un support de montage et de lamelles, montez les échantillons clairs, puis utilisez un scanner de lames de microscope pour imager les échantillons. Après avoir euthanasié les souris et retiré des échantillons de peau, comme démontré précédemment dans cette vidéo, immergez les échantillons dans un tube à pression de deux millilitres avec un millilitre de réactif pour l’extraction acide du thiocyanate de chlorhydrate de guanidinium. Utilisez une pince chirurgicale pour couper le tissu en morceaux de 0,2 centimètre carré.À l’aide d’un moulin à billes, écrasez les échantillons à 20 oscillations par seconde pendant 20 minutes. S’il reste des morceaux de peau intacts, répétez l’écrasement jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement homogénéisé. Centrifuger les échantillons à 16 000 fois g pendant une minute.Conservez les surnageants pour l’extraction de l’ARN et jetez la pastille. Cette étape est effectuée pour éliminer les cheveux et les débris qui pourraient interférer avec le processus d’extraction. Après avoir extrait l’ARN à l’aide d’une colonne de purification, utilisez un spectrophotomètre pour mesurer la concentration et la pureté de l’ARN.Le maintien de l’intégrité structurelle de la peau permet la détection des cellules immunitaires et leur localisation sur le site de l’infection. Ce fort grossissement révèle que l’abcès est principalement composé de PMC qui contiennent la propagation de l’agent pathogène par son confinement au site de l’infection. Les zones environnantes de l’abcès sont également enrichies en PMC.Sur cette figure, la coloration PAS, qui donne au champignon une couleur violet-magenta, montre clairement que l’agent pathogène est confiné à l’intérieur de l’abcès formé par le recrutement des granulocytes. C. albicans est clairement visible à une grossissement plus élevée et il semble être entouré de cellules nécrotiques et immunitaires. Au début du processus d’infection, le recrutement des cellules immunitaires conduit à la formation de l’abcès.48 à 72 heures après l’infection, la perturbation des structures cutanées et la formation d’une cicatrice ont été visualisées en raison de la phase de cicatrisation suite à l’expulsion de l’agent pathogène. Comme le montre ici, les souris de type sauvage présentent un processus ulcératif qui augmente avec le temps. Lors de traitements spécifiques ou de déficiences génétiques, la formation de l’ulcère peut être réduite et/ou abrogée.Dans certains cas, au lieu d’un ulcère, un kyste se formera comme on le voit ici. Suite à cette procédure d’infection, d’autres méthodes telles que l’extraction de protéines peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que l’activation de voies intracellulaires spécifiques. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer l’injection de C.Albicans dans la peau pour étudier l’implication du système immunitaire lors d’une infection microbienne sans perturber l’architecture de l’épithélium.N’oubliez pas que travailler avec des réactifs pour l’extraction d’ARN peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’utilisation d’une hotte doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo démontre le développement d’un modèle murin in vivo pour étudier la formation du biofilm de Candida albicans dans le tissu sous-cutané. L'expérience consiste à implanter des dispositifs infectés par Candida dans la région arrière de l'animal pour le développement d'un biofilm.

Candida albicans Formation d’un biofilm dans un modèle murin in vivo

Les interactions spatio-temporelles in vivo des défenses pathogènes et immunitaires au niveau de la muqueuse ne sont pas facilement imagées chez les hôtes vertébrés existants. La méthode présentée ici décrit une plate-forme polyvalente pour étudier la candidose muqueuse chez les vertébrés vivants en utilisant la vessie natatoire du poisson-zèbre juvénile comme site d’infection.

Modélisation des muqueuses candidose larves de poisson zèbre par injection vessie natatoire

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Candida albicans biofilm développement sur ​​les organismes étrangères médicalement pertinents dans une souris modèle sous-cutanée Suivi par bioluminescence Imaging

Galleria mellonella sert d’un modèle d’invertébrés pour la candidose disséminée. Ici, nous détaillons l’infection du protocole et de prévoir l’efficacité du modèle de données à l’appui.

Le modèle d’Infection de teigne Galleria mellonella pour candidose disséminée

Le but de ce protocole est de visualiser la forme et la localisation des cellules de Candida albicans dans le tractus gastro-intestinal des mammifères.

Visualisation de Candida albicans dans le tractus gastro-intestinal murine utilisant l'hybridation fluorescente in Situ

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Utilisation de l’imagerie in vivo pour dépister les phénotypes de morphogenèse chez les souches mutantes de Candida albicans au cours d’une infection active chez un mammifère hôte

L’infection de l’articulation périprothétique (PJI) causée par des agents pathogènes dangereux est fréquente en orthopédie clinique. Les modèles animaux existants ne peuvent pas simuler avec précision la situation réelle de PJI. Ici, nous avons établi un modèle murin de PJI associé au biofilm de Candida albicans pour la recherche et le développement de nouvelles thérapies pour la PJI.

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Un modèle d’infection à Candida albicans lié à un cathéter chez la souris

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THÉRAPIE PHOTODYNAMIQUE ANTIMICROBIENNE MÉDIÉE PAR LES CURCUMINOÏDES SUR UN MODÈLE MURIN DE CANDIDOSE BUCCALE

Le présent protocole décrit un modèle murin utilisant l’implantation dorsale sous-cutanée pour étudier les infections associées aux implants, permettant une investigation complète des mécanismes physiopathologiques et soutenant le développement de critères de diagnostic avec des stratégies thérapeutiques ciblées.

Modèle animal d’infections associées à des implants chez la souris

Apprenez une injection cutanée profonde avec Candida albicans pour analyser l'activation immunitaire et la localisation cellulaire dans la peau infectée. Cette méthode préserve l'architecture tissulaire.

Profonde cutanée Injection comme un modèle d’Infection de la peau de Candida albicans pour les Analyses histologiques

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