Correction d’épreuves et de test de réparation d’ADN en utilisant l’analyse de spectrométrie de masse MALDI-TOF et de nucléotide simple Extension

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la fidélité des polymères d’ADN et de la réparation de l’ADN, telles que les méthodes de relecture et d’analyse, et dans la définition du patch de réparation de l’ADN. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est très spécifique, simple, rapide et facile à réaliser. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés parce qu’elles ne sont toujours pas familiarisées avec la réplication de l’ADN et le domaine de la réparation et ne sont peut-être pas familières avec l’instrumentation de spectrométrie de masse et l’interprétation des données.

Je pense que le plus important est que la démonstration visuelle est très critique, car nous pouvons montrer comment notre spectrométrie de masse développée commercialement pour des applications cliniques telles que la mutation et la délégation peut être facilement adaptée à la relecture de l’ADN et à l’étude de réparation. Des étudiants diplômés de mon laboratoire feront la démonstration de la procédure. Commencez cette procédure par la préparation de l’amorce et du modèle comme décrit dans le protocole de texte.

À titre d’exemple, utilisez un décalage TG du substrat P21 avec T28 pour la relecture. Diluez l’amorce P21 et le modèle T28 à 12,5 picomoles par microlitre avec de l’eau. Ensuite, transférez 12 microlitres de l’amorce diluée et 12 microlitres de la matrice diluée dans un microtube à centrifuger stérilisé de 1,5 millilitre.

Après avoir bien fermé le tube, incubez le tube pendant 30 minutes dans un bain-marie couvert à 65 degrés Celsius. Ensuite, incubez pendant 30 minutes dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Et, enfin, placez le tube sur de la glace pour assurer un bon recuit.

À un microtube à centrifuger stérilisé de 1,5 millilitre, ajoutez huit microlitres d’amorce et de matricelle, deux microlitres de tampon de réaction de relecture 10x, quatre microlitres de mélange 4ddNTPs et de l’eau jusqu’à 18 microlitres. Agitez le tube pour mélanger. Diluez l’ADN polymérase dans un tampon de réaction de relecture 1x glacé à la concentration souhaitée.

Conservez l’enzyme diluée sur de la glace en tout temps. Préchauffez le tube de micro-centrifugeuse avec le mélange de substrat à la température de réaction souhaitée. Ensuite, transférez deux microlitres d’ADN polymérase diluée dans le mélange de substrat préchauffé et agissez le tube pour mélanger son contenu.

Centrifugez les tubes avec l’enzyme et le substrat pendant quelques secondes à 3200 fois la gravité à température ambiante pour faire tourner les composants des réactions. Transférez immédiatement la réaction dans un bloc chauffant ou un bain-marie à la température d’incubation souhaitée. Pour mettre fin à la réaction, ajoutez un volume égal de phénol tamponné et mélangez la réaction en tourbillonnant pendant quelques secondes.

Ensuite, centrifugez la réaction dans une micro-centrifugeuse à 3200 fois la gravité à température ambiante pendant cinq minutes. Transférez la phase aqueuse dans un micro-tube à centrifuger propre et ajoutez un volume égal de chloroforme. Après l’avoir mélangé par vortex pendant quelques secondes, centrifugez l’échantillon dans une microcentrifugeuse à 3200 fois la gravité à température ambiante pendant trois minutes.

Transférez la phase aqueuse dans un tube de micro-centrifugation propre. Après avoir incubé la réaction à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, placez le tube sur de la glace. Ensuite, effectuez l’ajout de résine pour éliminer la contamination par le sel dans une plaque à 384 puits, comme détaillé dans le protocole de texte.

Placez les plaques d’échantillon dans le distributeur de nanolitres. Placez la puce matricielle et la plaque à 384 puits préparée dans le plateau correspondant. Actionnez le nano-distributeur pour repérer les produits de réaction à la puce.

Appuyez sur le bouton de course sur l’écran tactile du nano-distributeur pour démarrer. Vérifiez l’image capturée automatiquement des points d’échantillonnage contenant des informations de saturation à l’écran pour vous assurer que le volume global repéré sur la puce est d’environ cinq à 10 nanolitres. Répétez le repérage de l’échantillon si le volume est insuffisant.

Préparez un fichier au format Excel contenant les informations de signal prévues pour l’importation. Créez et définissez un nouveau test dans le programme d’application en cliquant avec le bouton droit de la souris sur Importer le groupe de tests au format concepteur et en sélectionnant le fichier Excel. Établissez la plaque de dosage cible à l’aide de l’arborescence d’options de plaque de projet du client sur le côté gauche de l’écran en cliquant avec le bouton droit de la souris en haut de l’arbre et en lui attribuant un nom de fichier.

Sélectionnez le type de plaque à 384 puits et appuyez sur OK. Une plaque vierge apparaîtra. Sélectionnez le test approprié sur le côté gauche de l’écran. Attribuez le test sélectionné à chaque position d’échantillon repéré sur la puce en mettant en surbrillance le puits et en cliquant avec le bouton droit de la souris pour sélectionner ajouter un plex.

Ensuite, préparez une liste de travail de tous les tests sur la puce au format Excel sans en-tête. Importez la liste de travail via l’option Ajouter un nouvel exemple de projet. Attribuez le test et la liste de travail à chaque position du test P21T28 et choisissez en cliquant avec le bouton droit de la souris.

Reliez le spectromètre de masse à la puce à l’aide du programme d’application. Sélectionnez le paramètre par défaut sur le côté droit de l’écran. Remplissez le nom du test et l’ID de la puce dans le coin de la puce.

Enregistrez les paramètres et démarrez le programme de contrôle MS. Appuyez sur le bouton d’entrée/sortie et retirez la plaque de repérage. Placez la puce repérée sur la plaque de reconnaissance et appuyez sur le bouton d’entrée/sortie pour que la puce repérée entre dans le spectromètre de masse.

Cliquez sur le bouton d’acquisition du programme d’application pour démarrer la spectrométrie de masse et acquérir les données. Ouvrez le programme d’analyse des données. Parcourez l’arborescence de la base de données dans le coin supérieur gauche et sélectionnez l’ID de la puce.Ouvrez le fichier de données sur le côté droit de l’écran.

Cliquez sur l’icône du spectre pour afficher le spectre de masse. Pour recadrer une plage spécifique de surcharge de masse, cliquez avec le bouton droit de la souris pour sélectionner la boîte de dialogue de personnalisation. Dans la nouvelle fenêtre, cliquez sur l’axe des x et définissez la limite supérieure et inférieure souhaitée et appuyez sur OK pour afficher la plage spécifiée du spectre.

Exportez le spectre pour la tenue des enregistrements en cliquant avec le bouton droit de la souris sur Exporter. Sélectionnez le type de fichier JPEG, cliquez sur la destination, sélectionnez Parcourir le disque, tapez le nom du fichier, puis cliquez sur Exporter. Pour la quantification des données, utilisez le curseur et cliquez sur le pic pour afficher la hauteur du pic dans le coin supérieur gauche.

Dans la MS MALDI-TOF, il existe une relation inverse entre l’intensité maximale et la masse oligonucléotidique. Des oligonucléotides de 17 à 24 nucléotides ont été soumis à une analyse MS. Les intensités relatives du signal ont été calculées et ont pu être utilisées pour la quantification de la relecture ou du test de réparation.

Les signaux de matrice et d’amorce pouvaient être trouvés dans le spectre de masse. En raison des différences de taille, les signaux des modèles et de leurs produits de dégradation partielle non spécifiques étaient bien séparés des amorces et des produits de relecture non appariés. Voici une relecture d’un terminal à trois premiers TG.At cinq minutes, le produit corrigé était de 23 % contre 17 % pour le produit d’excision.

Cette différence a continué d’augmenter pour atteindre 69 % contre 14 % à 20 minutes. Notez la haute résolution de MS séparant clairement les signaux sub-droits et de produit avec une différence de surcharge de masse de seulement 32. Deux formes de produits d’excision pour la relecture d’un stylo TG étaient également facilement résolus.

L’intermédiaire d’excision d’un nucléotide et les deux produits d’excision de nucléotides. La relecture des incohérences internes a montré une nette tendance à l’efficacité de la relecture. Comme en témoigne un grand langage de produit relu, une efficacité accrue a été observée lorsque les sous-droites présentaient des déséquilibres au dernier, à l’avant-dernier, au troisième et au quatrième nucléotides des trois extrémités premières, par rapport aux désadaptations à d’autres positions.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est exécutée correctement. Suite à cette procédure, d’autres applications telles que la relecture polymère peuvent être réalisées pour découvrir et inventer de nouveaux médicaments pour la recherche pharmaceutique. Cette technique ouvre également la voie aux chercheurs dans le domaine de la réplication et de la réparation de l’ADN pour mieux comprendre la médecine du gnome et sa réplication fidèle pour tous les organismes vivants.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la relecture de l’ADN et le test de réparation à l’aide de l’analyse par spectrométrie de masse MADI-TOF. N’oubliez pas que travailler avec du sphéno-chloroforme peut être dangereux et que les précautions, telles que le port d’un équipement de protection individuelle, doivent toujours être prises lors de l’exécution de la procédure. Le protocole alternatif figurant dans le texte pourrait être considéré comme un substitut plus sûr.