Name: Stéréotaxique transfert adoptif de cellules immunitaires cytotoxiques dans des modèles murins de xénogreffes de glioblastome Multiforme Orthotopic homme (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Découvrez le transfert adoptif stéréotaxique de lymphocytes cytotoxiques humains dans des modèles murins de glioblastome orthotopique. Cette méthode démontre l'efficacité antitumorale des immunothérapies cellulaires administrées directement au site tumoral.

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Les auteurs remercient le personnel de l’hôpital universitaire animalerie (UTE) de Nantes pour l’élevage et soins, cellulaire et tissulaire d’imagerie de laboratoire central de l’Université de Nantes (MicroPICell) pour l’imagerie et la facilité de la cytométrie en flux (Cytocell) de Nantes pour leur assistance technique d’experts. Ce travail a été financé par l’INSERM, CNRS, Université de Nantes, Institut National du Cancer (INCa #PLBio2014-155), Ligue Nationale contre le Cancer (AO interrégional 2017) et le consortium européen ERA-Net Transcan2 (Immunoglio). L’équipe est financé par la Fondation pour la Recherche Medicale (DEQ20170839118). Ce travail a été réalisé dans le contexte de la LabEX IGO et les programmes de IHU-Cesti, soutenu par le National Research Agency Investissements d’avenir via les programmes ANR-11-LABX-0016-01 et ANR-10-IBHU-005, respectivement. Le projet IHU-Cesti est également pris en charge par Nantes Métropole et la région Pays de la Loire. Les auteurs remercient Chirine Rafia pour aider à corriger le manuscrit.

Les sujets impliquant animaux suivants de procédure s’est déroulée conformément aux directives institutionnelles (accord #00186.02 ; Comité d’éthique régional des Pays de la Loire [France]). PBMC humaines ont été isolées du sang provenant des donneurs sains informés (Etablissement Français du Sang de Nantes, France). Toutes les mesures sont effectuées dans des conditions stériles.
1. Expansion de non spécifique des Lymphocytes effecteurs cytotoxiques T
<ol><li>Préparer et irradier les cellules nourricières à 35 Gy. Pour la stimulation de 2 x 105 - cellules effectrices de 4 x 10,5 , préparer les PBMC6 10 x 10 et 1 x 106 BLCLs de trois donateurs distincts, en bonne santés.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules nourricières et cellules effectrices dans 15 mL de RPMI additionné de FCS inactivés par la chaleur de 10 %, 2 mM de L-glutamine, pénicilline (100 UI/mL) et streptomycine (0,1 µg/mL) et 300 UI/mL IL-2 recombinante.</li>
	<li>Ajouter PHA-L à une concentration finale de 1 µg/mL, mélanger soigneusement et distribuer 150 µL de la suspension de cellules par puits dans les plaques à 96 puits à fond U.</li>
	<li>Incuber à 37 ° C et avec 5 % de CO2 dans une atmosphère humidifiée.</li>
	<li>Vérifier quotidiennement la plaque jusqu'à ce que des touffes de grandes cellules forme dans les puits de culture (~ jour 7).</li>
	<li>Transférer les cellules dans un flacon de culture à 1 x 106 cellules/mL dans le milieu de culture fraîche.</li>
	<li>Déterminer le nombre total de cellules de comptage (2 x par semaine) et de les entretenir à 1 x 106 cellules/mL dans le milieu de culture fraîche. Remarque : Les cellules immunes effectrices devraient être prêts pour l’administration thérapeutique à un état de repos (généralement 3 semaines après l’impulsion initiale de l’amplification). La pureté et la réactivité de ces cellules effectrices doivent être vérifiés avant in vivo les injections (par exemple, avec des analyses in vitro ).</li>
</ol>2. préparation de cellules effectrices préopératoire
<ol><li>Après avoir vérifié le nombre de cellules effectrices, recueillir les cellules effectrices dans un tube de 50 mL par centrifugation (300 x g pendant 5 min). Remarque : Pour compenser toute perte, préparer un excès de cellules (par exemple, 50 x 10,6).</li>
	<li>Avec précaution, retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 15 mL de PBS et de Centrifuger pendant 5 min à 300 x g stérile pour effectuer le lavage.</li>
	<li>Soigneusement et complètement éliminer le surnageant et puis Resuspendre le culot dans 1 mL de PBS stérile.</li>
	<li>Transférer les cellules remises en suspension dans un microtube de 1,5 mL pour la centrifugation à 300 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Soigneusement et complètement supprimer le surnageant par pipetage lentement.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 8 µL de PBS stérile par souris. NOTE : Ceci est une étape cruciale.</li>
	<li>Mesurer le volume de la suspension cellulaire à l’aide d’une micropipette. Si nécessaire, ajouter une solution PBS stérile (20 x 106 cellules 15 µL de PBS par dose) et mélanger soigneusement.</li>
	<li>Vérifier, à l’aide d’une micropipette, que le volume final par souris se situe entre 15 et 20 μL (impérativement < 20 µL).</li>
	<li>Conserver les cellules sur la glace jusqu'à injection stéréotaxique. NOTE : plus de 3 h h n’ont pas été testés.</li>
</ol>3. stéréotaxique Injection
<ol><li>
Installation de l’équipement
	<ol>
<li>Monter et étalonner un petit cadre stéréotaxique animaux selon les instructions du fabricant pour s’assurer de l’exactitude des injections intracrâniennes (p. ex., taille de la seringue, volume désiré et vitesse d’injection). Remarque : Une vitesse de perfusion lente est recommandé (p. ex., 2-3 µL/min).</li>
		<li>Installer le matériel sous une armoire de sécurité microbienne (MSC) de maintenir la stérilité des instruments et de protéger les souris contre les infections. NOTE : Place » blocs isothermes » dans un bain d’eau à 37 ° C. Ce système limite l’hypothermie des souris pendant la chirurgie. Chauffage des plaquettes, qui sont nécessaires pour les soins post-procédure, doit être utilisé au cours de la surveillance continue de la température.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation préopératoire animale
	<ol>
<li>Anesthésier une souris avec une injection intrapéritonéale de kétamine (10 mg/mL) et de xylazine (0,1 mg/mL) à 10 µL/g de poids de la souris.</li>
		<li>Effectuer un test du pincement orteil pour assurer la complète anesthésie et analgésie de l’animal. Remarque : N’importe quel mouvement témoigne d’une analgésie profonde non et, dans ce cas, quelques minutes sont nécessaires avant de répéter l’opération.</li>
		<li>Une fois que la souris est correctement anesthésiée, utiliser des ciseaux pour enlever la fourrure du site chirurgical (entre les deux oreilles, jusqu'à le nez).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation préopératoire cellulaire
	<ol>
<li>Soigneusement Resuspendre les cellules avec une pipette (plusieurs fois) avant chaque injection, afin d’empêcher toute cellule agglomérante.</li>
		<li>Tracer soigneusement le volume de suspension cellulaire requis (15-20 µL) dans la microseringue 22-G pour éviter l’aspiration des bulles. Remarque : Cette étape de la cellule de chargement dans la microseringue est importante afin de minimiser les écarts dans les volumes injectés. Recharger les cellules pour chaque injection individuelle entre les procédures pour empêcher n’importe quelle cellule agglomérante tout en assurant un nombre pair d’administration de cellules effectrices de la cohorte.</li>
		<li>Ensuite, placez la seringue dans le pousse-seringue adaptée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Soins de la procédure
	<ol>
<li>Désinfecter le site chirurgical avec tampons trempés dans la solution de povidone-iode 5 % au moins de 3 x.</li>
		<li>Placer une pommade ophtalmique lubrifiante dans les yeux de la souris afin d’éviter tout dessèchement de la cornée.</li>
		<li>Position de la souris anesthésiée sur le cadre stéréotaxique, sur un bloc isotherme chaud recouvert d’une pellicule de plastique stérile pour maintenir la température de la souris pendant la chirurgie et de limiter la mortalité. NOTE : Nez et les dents de la souris doivent être convenablement positionnés au-dessus de la barre de la dent, afin d’assurer un débit respiratoire adéquat au cours de la procédure.</li>
		<li>Une fois que la souris est positionnée au-dessus de la barre de la dent, serrer les barres d’oreilles fermement sous les oreilles de la souris pour immobiliser la tête. Remarque : Veillez à ne pas endommager les tympans ou compromettre la respiration.</li>
		<li>Faire une incision de la peau sagittale médiane 1 ou 2 cm avec des ciseaux stériles le long de la partie supérieure du crâne d’antérieur postérieur pour exposer le crâne.</li>
		<li>Identifier l’intersection de la suture sagittale et coronale (Bregma) pour servir de points de repère pour la localisation stéréotaxique avant l’injection (illustrée à la Figure 1).</li>
		<li>Placez la microseringue au-dessus de ce point.</li>
		<li>Déplacer la microseringue latérale droite 2 mm et 0,5 mm partie antérieure de la Bregma.</li>
		<li>En utilisant un microforages, faire un petit trou dans le crâne avec une mèche stérile au point de coordonnées prédéterminé. Veillez à rester superficielle afin d’éviter toute lésion traumatique du cerveau. Remarque : Dans ce protocole, les cellules immunitaires ont été injectés au sein d’une tumeur établie (une semaine après l’injection de cellules tumorales). La peau devrait être réouvert (cicatrice) et l’injection est effectuée par les mêmes coordonnées utilisées pour l’implantation de cellules de tumeur (le trou est généralement toujours présent jusqu'à 2 semaines après l’injection). Coordonnées ont été sélectionnées pour l’injection des cellules tumorales et effecteurs dans le cerveau parenchyme13,14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Injection de cellules effectrices immunitaire
	<ol>
<li>Avec précaution, insérer la microseringue dans le trou percé et, se déplaçant lentement, transmettre l’aiguille 3 mm vers le bas dans la dure-mère et vers l’arrière puis 0,5 mm à une profondeur finale de 2,5 mm avant l’injection des cellules effectrices.</li>
		<li>Exécutez l’injection de cellules effectrices à 2-3 µL/min et surveiller les souris tout au long du temps d’injection.</li>
		<li>Une fois l’injection terminée, retirer l’aiguille pour seulement 1 mm et garder la microseringue en place pendant une minute supplémentaire avant de lentement se retirer complètement la microseringue, pour éviter toute fuite provenant du site de perfusion. Remarque : Après le retrait de l’animal de l’appareil stéréotaxique, nettoyer immédiatement le matériel d’injection pour des expériences à venir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Les soins post-opératoires et le suivi de la souris
	<ol>
<li>Retirez l’animal le cadre stéréotaxique et immédiatement appliquer la povidone-iode 5 % solution sur le site de l’incision puis fermez la peau avec une suture chirurgicale appropriée.</li>
		<li>Appliquez le gel de lidocaïne 2 % directement sur la plaie et administrer 0,15 µg/g de buprénorphine par une injection sous-cutanée d’analgésie post procédurale.</li>
		<li>Lieu de retour la souris anesthésiée à sa cage au-dessus d’un coussin chauffant mis à 37 ° C pour maintenir une température corporelle de souris approprié et d’éviter une hypothermie. Remarque : Un logement distinct n’est pas nécessaire.</li>
		<li>Contrôler la souris jusqu'à ce qu’il est complètement remis de l’anesthésie et le transférer dans une chambre de logement. Remarque : A ce jour, ce protocole est bien pris en charge que peu de complications imprévues ont eu lieu (5 < % des souris injectées).</li>
		<li>Tous les jours surveiller les souris et les euthanasier quand on observe des signes de santé en déclin (p. ex., posture voûtée, mobilité réduite, prostration ou perte de poids significative [≥ 15 %]).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Un transfert adoptif de sélectionné natif ou cellules effectrices immunitaire machiné représente une approche prometteuse pour traiter efficacement les tumeurs, comme les cancers du cerveau infiltrante, en prenant soin de limiter la réactivité contre les cellules non transformées15, 16,17,18. Toutefois, le système nerveux central, qui comprend le cerveau, a un statut particulier de système imm...

GBM (qui grade astrocytome IV), est le cancer de cerveau primitif plus fréquentes et les plus agressifs chez les adultes. En dépit de traitements agressifs qui associent chirurgie et la radio-chimiothérapie, GBM reste associé à un très mauvais pronostic (survie médiane de 14,6 mois et un an-2-mortalité > 73 %)1. Cela prouve que quelques avancées thérapeutiques efficaces ont été validées au cours de la dernière décennie2. Parmi les candidats pour la conception du plus efficace des stratégies thérapeutiques3,4,5, immunothérapies6 sont actuellement explorées afin de suivre et d’éliminer très tumeur invasive et radio/chimio-résistant cellules, soupçonnés pour leur contribution essentielle à rapide et fatale de tumeur rechute7. Diverses cibles immunologiques potentielles ont été immunothérapies identifiés et proposés pour, comportant naturels ou modifié αβ lymphocytes T ϒδ tels que les antigènes de tumeur GBM spécifiques ou le stress induit par les molécules8,9, 10. La possibilité d’administrer des effecteurs de cellules immunitaires GBM-réactive sélectionnées représente une occasion unique d’offrir des quantités élevées de lymphocytes effecteurs directement dans le site de la tumeur maligne résiduelle. Pour soutenir cette stratégie, nous avons récemment démontré que les modèles basés sur des souris immunodéficientes transportant orthotopique primaires xénogreffes humaines de GBM fidèlement récapitulent le développement de tumeurs cérébrales dans GBM patients9,11. En outre, ces modèles ont servi à démontrer l’efficacité antitumorale forte de Moutschen transférés lymphocytes allogéniques des Vϒ9Vδ2T humains.
Ce protocole décrit les étapes expérimentales critiques pour la réalisation des immunothérapies stéréotaxiques des tumeurs cérébrales, telles que GBM, basée sur le transfert adoptif des lymphocytes de T allogéniques. L’article indique : (i) l’amplification des lymphocytes effecteur immunitaire allogénique thérapeutiques T, telles que les lymphocytes humains de Vϒ9Vδ2T ; (ii) la préparation de ces lymphocytes effecteurs T pour injection ; (iii) la procédure d’administration stéréotaxique dans le cerveau, près de la tumeur. Cet article donne également une idée sur le comportement de ces effecteurs cellulaires après injection stéréotaxique.
L’approche thérapeutique présentée ici est basée sur l’injection de 20 x 106 cellules effectrices par dose pour chaque souris immunodéficientes avec tumeur de cerveau. Une étape d’expansion initiale in vitro est nécessaire pour produire de grandes quantités de cellules immunitaires. Par conséquent, les expansions de cellules non spécifiques sont effectuées à l’aide de la phytohémagglutinine (PHA-L) et irradié des cellules nourricières allogéniques : cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) provenant de donneurs sains et cellule B-lymphoblastoïdes transformées par Epstein Barr Virus EBV lignes (BLCLs), dérivés de PBMC par in vitro l’infection par EBV contenant la culture surnageante de la lignée cellulaire Ouistiti B95-8, en présence de 1 µg/mL de cyclosporine-A.
Les cellules immunes effectrices GBM-réactive sont comparées et choisies dans in vitro tests9. Ces cellules effectrices sont activés et amplifié à l’aide de protocoles standard, selon leur nature (par exemple, de lymphocytes humains Vγ9Vδ2 T9 ou virus anti-herpès humain αβ T lymphocytes12) d’une pureté minimale de > 80 %, comme d’habitude vérifiée par l’analyse par cytométrie en flux. La procédure d’extension cellulaire détaillée ci-dessous s’applique à divers sous-ensembles de lymphocytes humains.

<table><tbody><tr><td>PBMC</td><td></td><td></td><td>de 3 donneurs sains différents</td></tr><tr><td>BLCL</td><td></td><td></td><td>de 3 donneurs différents</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI)</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Dutscher</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>pénicilline/streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Novartis</td><td>proleukin</td><td></td></tr><tr><td>PHA-L</td><td>Sigma</td><td>L4144</td><td></td></tr><tr><td>Châssis stéréotaxique</td><td>Stoelting Co.</td><td>51600</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur de souris pour cadre stéréotaxique&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Comté de Stoelting</td><td>51624</td><td></td></tr><tr><td>Injecteur-pompe à microseringue&nbsp ;</td><td>WPI</td><td>UMP3-4</td><td></td></tr><tr><td>Seringue NanoFil</td><td>WPI</td><td>NF34BV-2</td><td></td></tr><tr><td>Souris NSG</td><td>Charles River</td><td>NSGSSFE07S</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Merial</td><td>Imalg&egrave ; ne 1000</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer</td><td>Rompur 2 %</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>WPI</td><td>201758</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td>WPI</td><td>501215</td><td></td></tr><tr><td>OmniDrill 115/230V</td><td>WPI</td><td>503598</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 4-0</td><td>Ethicon</td><td>VCP397H</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaïne</td><td>Astrazeneca</td><td>3634461</td><td></td></tr></tbody></table>

stéréotaxique transfert adoptif de cellules immunitaires cytotoxiques dans des modèles murins de xénogreffes de glioblastome multiforme orthotopic homme

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastome multiforme (GBM), le cancers du cerveau primaire plus fréquentes et les plus agressifs chez les adultes, est généralement associé à un mauvais pronostic, et rares thérapies efficaces ont été proposés au cours de la dernière décennie. Parmi les candidats prometteurs pour la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques, des immunothérapies cellulaires ont été ciblés pour éliminer très envahissante et chimio-radiorésistant des cellules tumorales, probables impliqué dans une rechute rapide et fatale de ce cancer. Ainsi, administrations de GBM-réactive allogéniques effecteurs de cellule immunitaire, telles que les lymphocytes T Vϒ9Vδ2 humains, dans le voisinage de la tumeur serait représente une occasion unique d’offrir efficace et hautement concentré des agents thérapeutiques directement dans la site des tumeurs malignes de cerveau. Ici, nous présentons un protocole pour la préparation et l’administration stéréotaxique de lymphocytes humains allogéniques dans des souris immunodéficientes transportant des tumeurs primaires du cerveau humain orthotopique. Cette étude fournit une preuve de concept préclinique pour la faisabilité et l’efficacité antitumorale de ces immunothérapies cellulaires qui s’appuient sur des injections stéréotaxiques de lymphocytes humains allogéniques dans lits tumeur intrabrain.

Cette étude décrit la stratégie des transferts adoptifs des cellules effectrices immunitaires cellulaires dans le cerveau des souris porteurs de tumeur, basé sur des injections stéréotaxiques réalisées directement dans le lit de la tumeur.
Pour minimiser le risque de lésion cérébrale associée à un volume d’injection grande, la suspension de cellules effectrices doit être concentré (20 x 106 cellules en 15-20 µL de PBS...

Ici, nous présentons un protocole pour la préparation et l’administration stéréotaxique de lymphocytes humains allogéniques dans des souris immunodéficientes transportant des tumeurs primaires du cerveau humain orthotopique. Cette étude fournit une preuve de concept pour la faisabilité et l’efficacité antitumorale des immunothérapies cellulaires intrabrain-livré.

Stéréotaxique transfert adoptif de cellules immunitaires cytotoxiques dans des modèles murins de xénogreffes de glioblastome Multiforme Orthotopic homme

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

Le glioblastome multiforme reste la tumeur cérébrale primitive la plus fréquente et la plus agressive chez l’adulte. Malgré des traitements agressifs basés sur une chirurgie suivie d’une radio et d’une chimiothérapie, le GBM est associé à un pronostic extrêmement sombre et à une survie médiane inférieure à 15 mois. Étant donné que peu d’avancées thérapeutiques ont été réalisées au cours de la dernière décennie, les immunothérapies cellulaires sont actuellement explorées pour éliminer les cellules GBM hautement invasives et résistantes susceptibles d’être impliquées dans la rechute rapide des tumeurs.L’administration de facteurs immunotoxiques cytotoxiques réactifs au GBM sélectionnés à proximité de la tumeur pourrait représenter une occasion unique d’administrer une immunothérapie cellulaire concentrée, directement sur le site de la malignité résiduelle. Notre groupe a récemment montré que les souris immunodéficientes NSG porteuses d’une xénogreffe primaire orthotopique de GBM humain récapitulent le GBM pour plus de développement chez les patients. Ces modèles de GBM ont été utilisés pour évaluer l’efficacité des effecteurs immunitaires cytotoxiques sur les injections intratumorales.Ce protocole décrit notre processus thérapeutique basé d’abord sur l’isolement et l’amplification de cellules immunitaires effectrices réactives au GBM. Deuxièmement, la propagation de ces cellules effectrices pour l’injection intercrânienne. Et troisièmement, leur injection stéréotaxique sur le site de la tumeur dans le cerveau de la souris.Le comportement de l’effecteur immunitaire après injection orthotopique a également été étudié. Trois semaines après la stimulation du fœtus PHA, les cellules effectrices, qui forment un amas de cellules au fond du flacon, devraient être revenues à l’état de repos et être prêtes à être utilisées. Après avoir vérifié le nombre de cellules effectrices, réintroduisez et collectez les cellules dans un tube de 115 millilitres et centrifugez-les.Retirez soigneusement et complètement un surnageant. Et remettre les cellules en suspension dans du PBS stérile et une centrifugeuse pour les laver. Retirez soigneusement et complètement le surnageant.Et puis remettre en suspension les cellules dans un millilitre de PBS stérile. Cellules de transfert dans un microtube pour la centrifugation. Encore une fois, retirez soigneusement et complètement le surnageant en pipetant lentement.L’étape suivante est critique : remettre les cellules en suspension dans la moitié du volume final de PBS stérile et homogénéiser doucement et soigneusement. Vérifiez le volume final avec une micropipette, le volume final par souris doit être compris entre 15 et 20 microlitres pour 20 millions de cellules. Assurez-vous qu’il ne dépassera pas 20 microlitres par souris.Garder les cellules sur de la glace jusqu’à l’injection. Assurez-vous que l’animal est correctement anesthésié par un pincement des orteils, puis retirez la fourrure du site chirurgical, entre les deux oreilles et jusqu’au nez. Remettez lentement les cellules en suspension pour éviter l’agglutination des cellules et chargez la suspension des cellules dans la seringue avec le plus grand soin pour éviter la présence de bulles.Ensuite, placez la seringue dans le pousse-seringue adapté. Désinfectez le site chirurgical avec une solution de sel et de povidone iodée à 5 % et placez une pommade ophtalmique lubrifiante dans les yeux de la souris pour éviter le dessèchement de la cornée. Ensuite, positionnez la souris anesthésiée sur le cadre stéréotaxique sur un bloc chaud.Positionnez correctement le nez et les dents de la souris au-dessus de la barre dentaire. Serrez fermement les barres d’oreille dans les oreilles de la souris pour immobiliser la tête. Veillez à ne pas endommager les tympans, à ne pas compromettre la respiration et à vous assurer que la tête est bien immobilisée.Faites une incision cutanée sagittale médiane avec des ciseaux stériles le long de la partie supérieure du crâne pour exposer le crâne. Identifiez l’intersection des structures sagittale et coronale pour servir de repères pour la localisation stéréotaxique, et placez la seringue au-dessus de ce point. Déplacez la seringue à des coordonnées prédéterminées.À l’aide d’une microperceuse, faites un petit trou dans le crâne avec un foret stérile. Veillez à rester superficiel afin d’éviter les lésions cérébrales. Insérez soigneusement la seringue dans le trou percé.Avancez lentement l’aiguille de trois millimètres vers le bas dans la dure-mère, puis reculez de 0,5 millimètre jusqu’à une profondeur finale d’injection de cellules de 2,5 millimètres. Exécutez l’injection cellulaire à deux ou trois microlitres par minute et surveillez les souris tout au long du temps d’injection. Une fois l’injection terminée, retirez l’aiguille d’un millimètre seulement et maintenez la seringue en place pendant une minute supplémentaire avant de retirer lentement et complètement la seringue pour éviter toute fuite du site de perfusion.Retirez soigneusement l’animal du cadre stéréotaxique. Fermez la peau avec une suture chirurgicale appropriée et appliquez du gel de lidocaïne à 2 % directement sur la plaie. Transférez la souris anesthésiée dans sa cage respective au-dessus du coussin chauffant réglé à 37 degrés Celsius pour maintenir la température corporelle appropriée de la souris jusqu’à ce qu’elle se remette complètement de l’anesthésie.Comme la suspension est très concentrée, la viabilité et la réactivité des cellules ont été vérifiées. Des cellules effectrices ont été chargées dans une seringue afin d’imiter l’injection in vivo. Les cellules ont été prélevées immédiatement ou 10 minutes plus tard et ont été analysées par cytométrie en flux pour détecter la coloration à l’iodure de propidium.Comme vous pouvez le constater, la préparation et la mise en charge n’ont pas affecté la viabilité des cellules effectrices à 24 heures. La réactivité contre les cellules tumorales du glioblastome a également été vérifiée à l’aide de cellules non préparées ou d’effecteurs préparés et est restée trois heures sur les yeux. La réactivité est surveillée par une coloration positive du marqueur d’activation CD107A.Ces résultats démontrent que la réactivité des cellules effectrices n’a pas été affectée par la préparation. Sept jours après l’injection de cellules effectrices, des cerveaux de souris ont été collectés, sectionnés et colorés pour une coloration hématique afin de permettre l’identification de la structure tumorale. Ensuite, la coloration anti-CD3 humaine a permis de localiser les cellules effectrices.Il est intéressant de noter que des cellules effectrices ont été trouvées autour de la tumeur et dans le noyau tumoral, mais aussi dans l’hémisphère controlatéral. Les lymphocytes T effecteurs humains isolés du cerveau de souris 48 heures après l’injection représentent 2 % des cellules cérébrales. Ils étaient toujours capables de proliférer en présence de PHA, de mangeoires et de stimulation IL2, avec une pureté de 99 % après amplification.Grâce à ce protocole, les cellules effectrices humaines au repos peuvent survivre et patrouiller avec un parenchyme cérébral de souris pendant plusieurs jours après l’injection stéréotaxique. En conclusion, le transfert adoptif de cellules effectrices humaines par injections stéréotaxiques représente des approches prometteuses pour traiter efficacement les tumeurs cérébrales malignes infiltrantes avec des effets délétères limités sur les cellules saines. Cette voie d’administration tire parti du fait que les cellules humaines sont délivrées à proximité du site tumoral, limitant ainsi leur dilution dans les tissus et l’organisme.Ici, nous avons décrit la procédure suivant l’administration d’une grande quantité de cellules immunitaires dans la tumeur cérébrale sans effets nocifs sur les cellules effectrices et, surtout, sans aucun effet délétère visible sur les souris. De plus, les cellules immunitaires injectées localement dans le cerveau de la souris sont non seulement capables de survivre et de conserver leur capacité à être activées et amplifiées ex vivo, mais aussi à éliminer les cellules tumorales disséminées dans le tissu cérébral environnant. Collectivement, ces caractéristiques sont essentielles pour permettre l’élimination des cellules tumorales fortement infiltrantes qui caractérisent les tumeurs GBM.Ce protocole ouvre de nouvelles opportunités pour la mise en place d’une procédure de transfert adoptif chez le modèle murin de tumeur cérébrale. Étape essentielle avant d’envisager une MC clinique.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous décrivons une méthode intégrée pour la précision, l'implantation stéréotaxique de cellules humaines de glioblastome multiforme dans le cerveau des souris nude et de série...

Implantation stéréotaxique intracrânienne et<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie bioluminescente de xénogreffes tumorales dans un système de modèle de souris de glioblastome multiforme

Cette vidéo présente une technique d’injection stéréotaxique pour l’administration de lymphocytes T effecteurs humains dans un modèle murin porteur d’une tumeur cérébrale humaine. En positionnant une souris anesthésiée porteuse d’une tumeur sur un cadre stéréotaxique et en créant un trou de bavure au point d’injection sur le crâne, des lymphocytes T effecteurs sont injectés sur le site de la tumeur.

Administration de lymphocytes T effecteurs dans des souris porteuses de tumeurs cérébrales humaines

Les gliomas malins constituent un groupe hétérogène de néoplasmes glial fortement infiltrative avec les configurations cliniques et moléculaires distinctes. Les xénogreffes orthotopic primaires récapitulent les dispositifs histopathologiques et moléculaires des sous-types malins de glioma dans les modèles animaux précliniques.

Les xénogreffes orthotopiques primaires de gliome récapitulent la croissance infiltrante et la mutation de l’isocitrate déshydrogénase I

Les astrocytes phénotypiquement sauvages et les cellules souches neurales récoltées sur des souris modifiées avec des allèles oncogéniques conditionnels floxés et transformés par recombinaison virale médiée par Cre peuvent être utilisés pour modéliser la pathogenèse de l’astrocytome in vitro et in vivo par injection orthotopique de cellules transformées dans le cerveau de compagnons de portée syngéniques et immunocompétents.

Modélisation astrocytome pathogenèse In Vitro Et In Vivo Utilisation corticale astrocytes ou cellules souches neurales à partir de, souris génétiquement modifiées conditionnelle

Le cerveau est un site unique avec des qualités qui ne sont pas bien représentés par des analyses in vitro ou extra-utérines. Des modèles de souris orthotopique avec l'emplacement et les caractéristiques de croissance et reproductibles peuvent être créés de manière fiable avec des injections intracrâniennes en utilisant un instrument stéréotaxique de fixation et d'une pompe à seringue à basse pression.

Création anatomique précise et reproductible intracrânienne xénogreffes de tumeurs cérébrales humaines

Les effets lymphodéplétifs et immunomodulateurs de la chimiothérapie et de la radiothérapie standard peuvent être exploités pour améliorer l’efficacité antitumorale de l’immunothérapie par lymphocytes T. Nous décrivons une méthode pour générer des lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) spécifiques de l’EGFRvIII et les administrer dans le contexte de la norme de soins du glioblastome.

Génération de la RCA cellules T pour la thérapie adoptive dans le contexte de glioblastome norme de diligence

Recherche de tumeur thérapeutiques cellules souches mésenchymateuses (CSM) semblent prometteuses comme traitement pour le glioblastome envahissante. Optimale transplantation implique livraison de MSCs dans la cavité de résection de tumeur sur les échafaudages. Ici, précliniques techniques d’étude MSC traitement du glioblastome figurent notamment : la résection de tumeur guidée par l’image ; implantation de graines MSC échafaudages ; et suivi un traitement postopératoire.

Guidée par l’image de la résection du glioblastome et Implantation intracrânienne d’échafaudages de graines cellules souches thérapeutiques

Ici, nous décrivons un modèle murin orthotopique préclinique pour le GBM, établi par injection intracrânienne de cellules dérivées de tumeurs modèles de souris génétiquement modifiées. Ce modèle présente les caractéristiques de la maladie du GBM humain. Pour les études translationnelles, la tumeur cérébrale de souris est suivie par IRM in vivo et histopathologie.

Modèles orthotopiques translationnels de glioblastome multiforme

Le développement de modèles orthotopiques de tumeurs cérébrales pédiatriques nécessite une précision méticuleuse, en utilisant un dispositif stéréotaxique pour implanter les cellules cancéreuses avec précision. La méthodologie présentée ici décrit les étapes de la préparation des cellules tumorales cérébrales, de la réalisation d’injections intracrâniennes et de la mise en œuvre d’un système de surveillance postopératoire pour évaluer la greffe de tumeur cérébrale.

Etablissement de modèles de xénogreffes orthotopiques dérivées de patients pour des tumeurs cérébrales à l’aide d’un dispositif stéréotaxique

Le glioblastome est une forme dévastatrice de cancer primitif du cerveau, et la thérapie thermique interstitielle au laser apparaît comme une alternative prometteuse à la résection chirurgicale conventionnelle pour le glioblastome inopérable. Ce protocole décrit un modèle murin préclinique optimisé qui peut être utilisé pour étudier les effets du traitement ou les traitements adjuvants et combinatoires.

Un modèle murin immunocompétent pour la thérapie thermique interstitielle au laser du glioblastome

L’objectif de ce protocole est de fournir aux chercheurs une technique hautement reproductible pour les implantations intracrâniennes.

Implantation intracrânienne stéréotactique de lignées cellulaires de xénogreffes dérivées d’un patient chez des souris

Découvrez le transfert adoptif stéréotaxique de lymphocytes cytotoxiques humains dans des modèles murins de glioblastome orthotopique. Cette méthode démontre l'efficacité antitumorale des immunothérapies cellulaires administrées directement au site tumoral.

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Stéréotaxique transfert adoptif de cellules immunitaires cytotoxiques dans des modèles murins de xénogreffes de glioblastome Multiforme Orthotopic homme

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