Essai de dépistage basé sur sA-MD-Galactosidase pour l'identification des médicaments sérothérapeutiques

Nous décrivons ici pour la première fois une méthode qui permet le criblage de drogue à haut débit pour des composés senotherapeutic qui se sont avérés salutaires dans les maladies aging-connexes. En fait, plusieurs essais cliniques avec des médicaments testés dans cette essence sont actuellement en cours. Le principal avantage de cette technique est de distinguer deux types de médicaments sénothérapeutiques, sénolytiques et sénomorphes, en utilisant la détection bien établie de SA-beta-Galactosidase dans les cellules sénescentes.

Cette technique est un outil de dépistage important pour les nouveaux composés sénothérapeutiques. En fait, plusieurs composés qui ont été identifiés à l’aide de cet écran sont présentés dans diverses publications de haut niveau, et sont actuellement en essai clinique. Cette technique est extrêmement polyvalente et peut être adaptée à plusieurs écrans à haut débit.

En fait, il est possible de multiplexer les écrans, et l’écran pour les composés qui suppriment la sénescence par l’activation ou l’inhibition de l’une des plusieurs voies. Hacher chaque embryon en morceaux d’un millimètre et le faire monter et descendre plusieurs fois. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de milieu de croissance aux tissus de chaque embryon.

Assiettez-les dans un plat de culture de 10 centimètres, et incubez à 37 degrés Celsius en oxygène de 3% et 5% de dioxyde de carbone pendant deux à trois jours. Et incuber le reste de chaque embryon avec 0,25% trypsine EDTA mélange pendant 10 minutes. Pour trypsiniser les cellules, d’abord, retirez soigneusement le milieu de croissance et lavez les cellules avec 10 millilitres de 1X PBS deux fois.

Ensuite, ajoutez deux millilitres d’une solution EDTA de trypsine 025 aux cellules, et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant deux à trois minutes. Ensuite, inspectez les cellules au microscope pour vous assurer que les cellules sont détachées de la surface. Ajouter la même quantité de milieu de croissance pour mettre fin à la digestion de la trypsine, et transférer les cellules dans un tube conique.

Ensuite, centrifuger les cellules à 200 fois G pendant trois minutes. Jetez le supernatant et ajoutez un milieu de croissance frais pour suspendre à nouveau les cellules. Ensuite, comptez les cellules et ensemencez-les dans de nouvelles plaques à la densité cellulaire projetée.

Pour la subcultivation non sénescente, d’abord, diviser les cellules confluentes à un rapport d’un à quatre. Puis incuber les cellules à 37 degrés Celsius en 3% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone à prolonger pour un autre passage. Ensuite, pour induire la sénescence cellulaire, les graines séparent les cellules confluentes du passage un à un rapport de un à quatre et les incuber à 37 degrés Celsius dans 20% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone environnement pendant trois jours.

Pour surveiller la sénescence cellulaire, avec un système avancé de compteur cellulaire Coulter, mesurez l’augmentation progressive du diamètre cellulaire et du volume cellulaire à chaque étape de trypsinisation. Pour commencer l’analyse de dépistage bêta-gal, graine 5000 cellules sénescentes ou 3000 cellules non sénescentes par puits dans 96 plaques de puits. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de milieu de croissance à chaque puits et incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 20% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone pendant six heures.

Ensuite, ajoutez des dilutions médicamenteuses aux cellules MEF et incubez les cellules à 37 degrés Celsius en oxygène à 20 % et 5 % en dioxyde de carbone pendant 24 à 48 heures. Après l’incubation, retirer la solution médicamenteuses et laver les cellules avec 100 microlitres de 1X PBS. Pour induire l’alcalinisation lysosomale, pré-traiter les cellules avec 90 microlitres de solution bafilomycine A1, diluées dans le milieu de culture cellulaire fraîche à une concentration finale de 100 nanomolaires.

Ensuite, incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans 20% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone environnement pendant une heure. Pour l’analyse de fluorescence de l’activité SA-beta-Gal, faire une nouvelle solution de travail de C12FDG dilué dans le milieu de croissance, à une concentration finale de 100 micromolaires. Ensuite, ajouter 10 microlitres de la solution de travail au milieu de culture à une concentration finale de 10 micromolaires, et incuber les cellules à 37 degrés Celsius en 20% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone pendant deux heures.

Laver les cellules avec 100 microlitres de 1X PBS. Ensuite, ajoutez deux microlitres d’un colorant Hoechst 33342 de 100 microgrammes par millilitre à une concentration finale de deux microgrammes par millilitre. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius, 20% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone pendant 20 minutes.

Après l’incubation, retirer le milieu, ajouter 100 microlitres de milieu de croissance frais et passer à l’imagerie. Dans cette étude, une plate-forme d’acquisition et d’analyse d’images fluorescentes à haute teneur a permis d’identifier des médicaments sénolytiques, tels que 17-DMAG, qui ont réduit les activités globales de SA-beta-Gal dans les cultures cellulaires embryonnaires murines contenant des cellules sénescentes au passage cinq. Les analyses quantitatives générées par logiciel des mélanges de cellules sénescentes et non sénescentes permettent la démonstration claire des effets spécifiques aux cellules sénescentes, et l’élimination de l’activité bêta-galactosidase de fond par bafilomycine A.Assurez-vous que tous les contrôles cellulaires nécessaires sont inclus, en particulier les cellules sénescentes non traitées et les cellules sénescentes traitées avec un contrôle positif.

Cet essai inclut le travail avec les cellules primaires sous le stress oxydant, qui peut mener à la variation qui doivent être surveillées. Cette procédure est la première étape dans la détection des médicaments sénothérapeutiques. D’autres essais de viabilité cellulaire et de sénescence cellulaire doivent être exécutés pour confirmer les résultats du dépistage.

Plusieurs nouveaux médicaments sénolytiques ont été détectés à l’aide de cet essai, y compris la première combinaison de médicaments sénolytiques dasatinib quercetin, inhibiteurs de la protéine de choc thermique 90, inhibiteurs de la famille Bcl-2, et la fisetin polyphénol.