Corrélatives microscopie électronique léger (CLEM) de suivi et d’imagerie protéine virale associés Structures des cellules immobilisées Cryo
7 septembre 2018
Une méthode de microscopie corrélative électron (CLEM) est appliquée aux structures intracellulaires Viro-induite d’image par microscopie électronique (EM) dans les cellules qui sont préalablement sélectionnés par microscopie photonique (LM). LM et EM sont combinés en une approche d’imagerie hybride pour obtenir une vision intégrée des interactions virus-hôte.
Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie sur la façon dont les bioprotéines qui se trouvent dans les membranes cellulaires créent des environnements qui favorisent la bioréplication et l’assemblage. Les deux pierres angulaires techniques qui sont combinées ici sont, d’une part, la corrélation entre l’imagerie de cellules vivantes et la microscopie électronique, et d’autre part, la congélation à haute pression. Bien que cette méthode ait été conçue et utilisée avec succès pour lutter contre les interactions entre les sources virales, elle peut être facilement généralisée à une gamme d’applications en biologie cellulaire. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car il existe de nombreuses étapes qui nécessitent une expérience pratique réussie, en particulier la cryo-immobilisation par congélation à haute pression et les étapes ultérieures. Commencez par placer des disques de saphir à motifs avec un motif alphanumérique gravé sur l’une de leurs surfaces dans un tube de centrifugation conique de 15 millilitres, et lavez soigneusement les disques avec de l’éthanol. Placez les disques de saphir lavés dans une boîte de Pétri recouverte de papier filtre pour le séchage et utilisez une pince à épiler longue et fine pour transférer les disques de saphir séchés sur des lames de verre. À l’aide d’un microscope inversé à un grossissement de 4x, vérifiez que le motif des coordonnées sur chaque disque de saphir est lisible. Ensuite, stérilisez les disques avec un réticulant ultraviolet pendant cinq minutes. Dans une enceinte de biosécurité, ajoutez la moitié du milieu de culture cellulaire dans une boîte de culture cellulaire et utilisez une longue pince à épiler pour transférer soigneusement les disques de saphir dans la boîte. Ensuite, grainez 1x10
Aperçu
Cet article présente une méthode de microscopie électronique en corrélation avec la microscopie optique (CLEM) permettant de visualiser les structures intracellulaires induites par les virus. En combinant la microscopie optique (LM) et la microscopie électronique (EM), les chercheurs peuvent obtenir des informations sur les interactions entre les virus et leurs hôtes.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Techniques de microscopie
- Interactions virus-hôte
Contexte
- La méthode combine l'imagerie de cellules vivantes avec la microscopie électronique.
- La congélation sous haute pression est un élément essentiel de la technique.
- Elle a été appliquée avec succès à l'étude des interactions virales.
- La méthode peut être généralisée à diverses applications en biologie cellulaire.
Objectif de l'étude
- Visualiser les structures induites par les virus dans les cellules.
- Approfondir la compréhension des interactions entre biomolécules protéiques dans les membranes cellulaires.
- Fournir un guide pratique aux chercheurs utilisant cette méthode.
Méthodes utilisées
- Préparation de disques de saphir structurés pour l'imagerie.
- Utilisation de la microscopie inversée pour la confirmation du motif.
- Stérilisation des disques par réticulation ultraviolette.
- Techniques de culture cellulaire pour l'ensemencement des cellules sur les disques de saphir.
Résultats principaux
- Visualisation réussie des structures intracellulaires induites par les virus.
- Démonstration de l'efficacité de la microscopie correlative (CLEM) dans l'étude des interactions virus-hôte.
- Étapes pratiques décrites pour la mise en œuvre de la méthode.
- Applications potentielles dans des contextes plus larges de biologie cellulaire.
Conclusions
- La méthode CLEM fournit des aperçus précieux sur la biologie des virus.
- Elle comble l'écart entre la microscopie optique et la microscopie électronique.
- Des applications supplémentaires en biologie cellulaire sont encouragées.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La microscopie correlative en lumière et en électrons (CLEM) répond à un goulot d'étranglement critique dans la recherche en virologie en permettant l'analyse ciblée de populations cellulaires rares transfectées ou infectées. En combinant l'imagerie en cellules vivantes basée sur la fluorescence avec une préservation ultrastructurale de haute résolution par congélation sous haute pression, cette méthode améliore la confiance prédictive dans les études mécanistiques des interactions virus-hôte. Elle facilite la validation précoce de cibles et le développement de tests en fournissant des données corrélées qui relient les phénotypes fonctionnels à l'architecture subcellulaire, éclairant ainsi les décisions « go/no-go » dans les voies de découverte d'antiviraux.
Applications stratégiques en R&D biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en associant l'expression de protéines virales marquées au niveau fluorescent aux modifications ultrastructurales dans des cellules immobilisées par cryo-fixation.
- Valeur opérationnelle : Accroît l'efficacité de l'étude des événements de transfection ou d'infection à faible rendement grâce à un pré-dépistage par microscopie optique.
- Valeur prédictive : Facilite la réduction des risques mécanistiques en visualisant les altérations membranaires induites par le virus et les sites d'assemblage liés aux complexes de réplication.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des signaux corrélés de fluorescence et de densité électronique permettant une évaluation quantitative de la localisation des protéines virales et des perturbations structurales.
- Valeur opérationnelle : Normalise la préparation des échantillons à l’aide de disques de saphir structurés, facilitant une corrélation reproductible entre les expériences et les utilisateurs.
- Préparation du test : Produit des échantillons présentant une préservation ultrastructurale adéquate, adaptés à l’imagerie en aval et à l’analyse morphométrique dans le cadre de campagnes de criblage.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Préserve la fidélité structurelle entre l'imagerie en cellules vivantes et la microscopie électronique, soutenant le criblage phénotypique aligné sur des biomarqueurs dans des systèmes pertinents pour la maladie.
- Modélisation préclinique : Permet une caractérisation détaillée des effets cytopathogènes induits par les virus dans des états proches de l'état natif, renforçant la fiabilité des extrapolations translationnelles.
- Avancement ajusté au risque : Fournit des preuves ultrastructurales permettant de confirmer ou d'infirmer les mécanismes d'action des candidats antiviraux.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La microscopie correlative électronique et à fluorescence s'inscrit dans le continuum de la découverte, de la génération d'hypothèses en virologie fondamentale jusqu'à la validation mécanistique en optimisation de composés candidats, notamment lorsque des corrélats structuraux de la fonction protéique sont nécessaires.
- Découverte en biologie : Soutient la vérification d'hypothèses en permettant la visualisation directe des structures associées aux protéines virales au sein de sous-populations cellulaires définies.
- Essais de dépistage : Améliore la fiabilité des tests grâce à une localisation cellulaire standardisée et à une cryo-conservation, réduisant ainsi la variabilité des données structurales.
- Analytique : Fournit des jeux de données corrélés de microscopie optique et électronique permettant une comparaison quantitative des conditions fondée sur l'intensité de fluorescence et les caractéristiques ultrastructurales.
- Recherche translationnelle : Associe l'imagerie fonctionnelle aux données structurales à haute résolution, assurant une continuité entre les tests cellulaires et la validation mécanistique.
- Réutilisation à l'échelle organisationnelle : Met en place une plateforme réutilisable pour l'étude des interactions virus-hôte, applicable à plusieurs cibles et familles virales.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en fournissant une preuve corrélative directe de la localisation des protéines virales et des modifications structurales induites.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité grâce à l'utilisation standardisée de substrats structurés et au congélation à haute pression, minimisant ainsi les artefacts liés à la fixation chimique.
- Valeur stratégique : Permet de prendre de meilleures décisions « aller/ne pas aller » en validant l'interaction avec la cible au niveau ultrastructural, réduisant ainsi le risque d'échec en phase avancée.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats antiviraux en se basant sur les effets confirmés sur les compartiments de réplication virale ou les sites d'assemblage.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en imagerie de fluorescence sur cellules vivantes, congélation à haute pression, substitution congelée et microscopie électronique en transmission.
- Dépend de l'accès à des congélateurs à haute pression, des ultramicrotomes et des systèmes d'imagerie corrélative lumière-électron.
- Exige une standardisation des marqueurs fiduciaux (par exemple, disques de saphir structurés) et des protocoles de cartographie des coordonnées entre les équipes.
- L'adaptation à différents types cellulaires ou systèmes viraux peut nécessiter une optimisation de l'efficacité de transfection, du marquage fluorescent et des paramètres de congélation.
- Les limitations pratiques incluent un débit faible dû à l'utilisation d'équipements spécialisés et la nécessité d'un alignement logiciel corrélatif, comme indiqué dans la documentation de référence.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
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Title
0:51
Patterned Sapphire Disc Preparation, Cell Culture, and Imaging
3:16
Cryo-immobilization and Freeze Substitution (FS)
5:24
Resin Embedding and Patterned Sapphire Disc Removal from the Polymerized Resin Block
6:43
Ultrathin Section Preparation and Imaging via Transmission Electron Microscopy (TEM)
8:06
Results: Tracking and Imaging of Viral Protein-associated Structures via Correlative Light Electron Microscopy (CLEM)
8:47
Conclusion
