Exempt de calibration In Vitro la Quantification des protéines Homo-oligomérisation à l’aide d’instruments commerciaux et Open Source gratuit, logiciel d’analyse de luminosité

Ce protocole décrit une approche sans étalonnage pour quantifier les protéines homo-oligomérisation in vitro basée sur la spectroscopie de fluorescence fluctuation en utilisant la lumière commerciale au microscope à balayage. Les paramètres d’acquisition correcte et les méthodes d’analyse sont affichés.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du criblage de médicaments, telles que l’élucidation de l’effet des inhibiteurs à petites molécules sur de très faibles concentrations pour les interactions protéine-protéine. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite aucun étalonnage, qu’elle peut être mise en œuvre dans n’importe quel microscope confocal et qu’elle utilise de très petites quantités de protéines marquées. Les implications de cette technique s’étendent au développement de médicaments anticancéreux, d’inhibiteurs à petites molécules et de divers inhibiteurs de fusion, car elle fournit des informations quantitatives sur les interactions protéine-protéine.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des interactions et des agrégations de protéines in vitro, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que la dynamique des protéines de cellules vivantes et les interactions cellule-cellule. Pour commencer, transformez les cellules pLysS avec un vecteur pET-22b contenant des marqueurs humains monomérisés FKBP12 et N-terminal His6 et mVenus. Une fois que les cellules se sont remises de l’incubation et du choc thermique, placez-les sur de la gélose LB complétée par des antibiotiques.

Transférez les colonies transformées dans une culture de démarrage de 100 millilitres de LB et cultivez pendant 16 à 20 heures à 37 degrés Celsius en secouant. Après l’incubation, diluez la culture de démarrage dense d’un à 100 dans un milieu de 100 LB en deux lots de 500 millilitres. Ensuite, cultivez pendant deux à trois heures jusqu’à une densité optique à 600 nanomètres de 0,6 à 0,8.

Après avoir refroidi les cultures sur de la glace, induire la production de protéines avec l’IPTG de 250 micromolaires. Cultivez les cultures pendant 16 à 20 heures à 21 degrés Celsius et 200 tr/min. Ensuite, récoltez les cellules par centrifugation à 2 000 g pendant 20 minutes.

Retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 40 millilitres de tampon A IMAC complété par des inhibiteurs de protéase sans EDTA. Maintenant, sonifiez les cellules à 500 watts, 20 kilohertz et 40 % d’amplitude à neuf secondes de marche, 11 secondes de décalage pendant 15 minutes sur glace. Après la sonication, récolter la matière soluble par centrifugation à 20 000 g pendant une heure à quatre degrés Celsius.

Transférez le lysat soluble dans une fiole conique et ajoutez deux millilitres de résine TALON. Laissez la suspension incuber pendant une heure avec une rotation de 105 tr/min. Maintenant, récoltez la résine et lavez-la avec 250 millilitres de tampon IMAC A suivi de 500 millilitres de tampon IMAC B.Éluez la protéine marquée His6 à l’aide du tampon IMAC C.Injectez l’éluat dans une colonne d’exclusion de taille pré-équilibrée et collectez le pic FKBP12, qui élue à environ 87,7 millilitres.

Évaluez la pureté de la protéine à l’aide de la carte SDS-PAGE, puis regroupez et concentrez au besoin. Pour mettre en place le réseau de plaques multipuits, préparez d’abord une solution de FKBP12 purifié de 100 nanomolaires dans le même tampon que celui utilisé pour la chromatographie d’exclusion stérique. Sonicate et centrifugeuse avec un essorage rapide de 13 000 tr/min pour éviter la formation d’agrégats.

Maintenant, pipetez 100 à 200 microlitres de protéine diluée dans une chambre d’observation à huit puits avec un fond en verre. Ajoutez le dimériseur BB à des concentrations finales de 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 et 500 nanomolaires. À titre de référence, préparez une solution de 100 nanomolaires mVénus seule pour évaluer les effets potentiels d’agrégation et de précipitation et pour récupérer une valeur de luminosité pour le monomère avec les mêmes paramètres d’acquisition.

Tout microscope à balayage optique, système confocal équipé de détecteurs numériques ou de détecteurs analogiques bien caractérisés et capable de maintenir un temps de séjour constant pour chaque pixel acquis peut être utilisé. Sélectionnez l’objectif de correction à immersion dans l’eau conçu pour la spectroscopie de corrélation de fluorescence. Maintenant, ajoutez une goutte d’eau à l’objectif d’immersion dans l’eau de correction du collier.

Montez la chambre d’observation à huit puits dans la scène. Réglez la trajectoire du faisceau d’excitation en allumant le laser de 514 nanomètres et en le réglant sur une puissance de 20 à 100 nanowatts à la sortie de l’objectif. Allumez un détecteur HyD.

Les détecteurs capables de compter les photons sont préférables. Sélectionnez la fenêtre d’émission de 520 à 560 nanomètres. Pour le mode d’acquisition, utilisez 16 x 16 pixels.

Réglez le temps de séjour des pixels de sorte que le temps d’image soit plus long que la diffusion des protéines et que le temps de séjour des pixels soit beaucoup plus court. Cela correspondait au réglage du temps d’arrêt à environ 13 microsecondes pour le système utilisé dans cette démonstration. Réglez le sténopé sur une unité Airy pour l’émission correspondante d’environ 545 nanomètres.

Sélectionnez le mode d’acquisition en temps xy, puis sélectionnez le nombre d’images à acquérir par acquisition et bien. Maintenant, réglez la taille du pixel à environ 120 nanomètres. Si le système est équipé d’un mode haut débit, introduisez les coordonnées de chaque puits et le nombre d’acquisitions par puits pour automatiser le processus.

Si le système est équipé d’un système de perfusion, chargez la solution BB et programmez la perfusion pour qu’elle commence juste après la 5 000e image afin d’évaluer la cinétique de dimérisation tout en acquérant 10 000 images. Sélectionnez le puits approprié et concentrez-vous sur la solution. Ensuite, lancez l’acquisition et enregistrez la pile d’images résultante au format TIFF.

Des séquences de 20 000 images de FKBP12 mVenus purifiée dans une solution de 100 nanomètres ont été acquises comme spécifié dans la section protocole. L’intensité de la première image est indiquée en même temps que le profil d’intensité moyen de l’image décolorée. La luminosité sans et avec filtrage lisse est également indiquée.

Après l’acquisition de 10 000 cadres, le médicament homodimériseur BB a été ajouté à la solution lors de l’acquisition. Chaque série consécutive de 5 000 images a été analysée. La luminosité moyenne cinq minutes après l’ajout de BB était de 1,010, ce qui représente une augmentation de deux fois, indiquant un dimère FKBP12.

La cinétique du processus montre un délai d’environ deux minutes entre l’addition de BB et la dimérisation complète de FKBP12. Un aspect clé pour évaluer les interactions protéine-protéine in vitro est la production et la purification de votre protéine marquée. Assurez-vous d’avoir de petites quantités de la protéine d’intérêt étiquetée et que votre protéine ne s’agrège pas selon votre analyse.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme la résonance plasmonique de surface ou la spectroscopie de corrélation de fluorescence peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme les constantes de dissociation ou les coefficients de diffusion. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biophysique pour explorer en détail les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes. N’oubliez pas que travailler avec des réactifs pour la purification des protéines peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que des lunettes de sécurité, des gants, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.