Name: Exempt de calibration In Vitro la Quantification des protéines Homo-oligomérisation à l’aide d’instruments commerciaux et Open Source gratuit, logiciel d’analyse de luminosité (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T15:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Découvrez une méthode sans calibration pour quantifier l'homo-oligomérisation des protéines in vitro par spectroscopie de fluctuations de fluorescence. Cette technique accessible facilite le criblage de médicaments et l'étude des interactions protéiques à faibles concentrations.

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Ce travail a été soutenu par le Wellcome Trust accorder 105278/Z/14/2 de R.N. Le Wellcome Trust Centre for Human Genetics est financé par Wellcome Trust Core prix 203852/Z/16/2. Travaux du groupe C.S. est pris en charge par Cancer Research UK (C20724/A14414) et le Conseil européen de la recherche au titre de l’Union européenne Horizon 2020 recherche et Innovation Programme Grant 647278.

1. FKBP12 F36V mVenus - Purification
<ol><li>Transformer des cellules pLysS (DE3) avec le vecteur pET22b contenant les monomerized de le FKBP12F36V humaine12 et balises d’His6 et de mVenus N-terminal (vector disponible sur demande). Cellules de la plaque sur une gélose LB additionné de 50 µg/mL d’ampicilline et 34 µg/mL de chloramphénicol.</li>
	<li>Transfert des colonies transformées en culture starter 100 mL LB et croître pendant 16 à 20 heures à 37 ° C sous agitation.</li>
	<li>Diluer la culture starter dense (DO600 > 1/100 1) dans le milieu LB (lot de 2 x 500 mL) et de grandir pendant 2-3 heures pour DO600 = 0,6 - 0,8 (37 ° C, 200 tr/min).</li>
	<li>Cultures cool sur la glace. Induire à 250 µM IPTG et croître pendant 16 à 20 heures à 21 ° C, 200 tr/min.</li>
	<li>Récolter les cellules par centrifugation à 2 000 x g pendant 20 minutes.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans 40 mL de tampon d’IMAC (20 mM sodium phosphate pH 7,5, 500 mM NaCl, imidazole de 3 mM, 1 mM β-mercaptoéthanol) complété avec des inhibiteurs de protéase sans EDTA (1 comprimé par culot cellulaire).</li>
	<li>Soniquer cellules (amplitude de 500 Watts, 20 kHz, 40 %, 9 s, 11 s éteint pendant 15 min) sur la glace et la récolte des matières solubles par centrifugation à 20 000 x g.</li>
	<li>Transfert soluble lysat dans une fiole conique et ajouter 2 mL de résine (voir Table des matières). Incuber pendant 1 heure avec rotation 105 tr/min NOTE : Nickel Sépharose peut également être utilisé pour cette étape de l’IMAC.</li>
	<li>Récolter la résine et laver avec 250 mL de tampon de l’IMAC A suivi de 500 mL de tampon de IMAC B (20 millimètres sodium phosphate pH 7,5, 500 mM NaCl, imidazole de 7 mM, 1 mM β-mercaptoéthanol). NOTE : Augmenter à imidazole de 50 mM, si à l’aide de résine de Sépharose Nickel.</li>
	<li>Éluer les protéines His6-tag à l’aide de tampons IMAC C (20 mM sodium phosphate pH 7,5, 500 mM NaCl, imidazole de 300 mM, 1 mM β-mercaptoéthanol).</li>
	<li>Injecter sur une exclusion de taille colonne (voir Table des matières) équilibrées dans 10 millimètres HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 millimètre DTT. FKBP12F36V a son élution de pic à 87,71 mL sur la colonne, nous avons utilisé.</li>
	<li>Évaluer la pureté par SDS-PAGE et de la piscine et se concentrent au besoin.</li>
</ol>2. préparation du tableau plaque multipuits
<ol><li>Décongeler le FKBP12F36V purifié (ou protéine d’intérêt marquée) de-80 ° C.</li>
	<li>Préparer une solution de 100 nM purifiée FKBP12F36V (moyennes, 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 millimètre DTT). Soniquer et centrifuger (essorage rapide de 13 000 tr/min) pour éviter la formation d’agrégats.</li>
	<li>Pipetter 100-200 µL dans une chambre d’observation bien 8 à fond de verre.</li>
	<li>Ajouter le dimerizer de BB à la concentration finale de 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 et 500 nM12,13.</li>
	<li>Comme référence, préparer une solution de 100 nM de mVenus seul pour évaluer les effets potentiels de l’agrégation et la précipitation et de récupérer une valeur de luminosité pour le monomère avec les mêmes paramètres d’acquisition.</li>
</ol>3. étalonnage exempt Confocal Acquisition
<ol><li>Démarrez le système confocal (Figure 1). N’importe quelle lumière microscope système confocal à balayage équipé de détecteurs numériques ou bien caractérisés détecteurs analogiques8et capable de garder une temporisation constante pour chaque pixel de l’acquis fonctionnera.</li>
	<li>Définissez le chemin de faisceau d’excitation :<ol>
<li>Allumez, 514 nm laser et ensemble il au nW de 20 à 100 de puissance à la sortie de l’objectif (pour FKBP12F36V-mVenus).</li>
		<li>Sélectionner l’objectif 63X1.4NA ou un objectif à immersion d’eau collier correction conçu pour FCS.</li>
		<li>Allumez un HyD, APD ou détecteur de PMT calibré. Détecteurs de mesure de comptage de photons sont préférables, comme en l’espèce, le calcul de S, offset et σ02 ne sont pas nécessaires.</li>
		<li>Sélectionnez la fenêtre d’émission de 520-560 nm</li>
		<li>Définissez le trou d’épingle à 1 unité aérée pour l’émission ~ 545 nm correspondant.</li>
		<li>Définir le mode d’acquisition à 16 x 16 pixels</li>
		<li>Réglez le temps de s’attarder de pixel thabiter qu’il répond tcadre >> TD >> thabiter, où D est le temps de résidence de la diffusion t de protéine et cadre est la cadence. Cela correspond au réglage de l’heure de s’attarder à ~ 13 µs. Remarque : Certains fabricants commerciaux avaient scanners qui ne conservaient pas le temps d’arrêt par pixel constante. Cette constance est cruciale pour la méthode fonctionne.</li>
		<li>Définir la taille de pixel à ~ 120 nm.</li>
		<li>Sélectionnez le mode d’acquisition de xyt , puis sélectionnez le nombre d’images à acquérir par achat et bien (par exemple 5 000).</li>
		<li>Si le système est équipé d’un mode haut débit, introduire les coordonnées de chaque puits et le nombre d’acquisitions / puits pour automatiser le processus. Remarque : Veillez à assurer la présence d’un distributeur d’eau pour si vous utilisez un objectif à immersion.</li>
		<li>Si le système est équipé d’un système de perfusion, chargez la solution BB et programmer la perfusion pour démarrer droit-après le 5000ème cadre pour évaluer la cinétique de dimérisation tout en acquérant par exemple, 10 000 images.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter une goutte d’huile dans l’objectif à immersion d’huile / eau si utilisant un objectif à immersion d’eau collier correction conçu pour FCS.</li>
	<li>La chambre 8 observation bien monter la scène.</li>
	<li>Sélectionnez le bon puits et se concentrer sur la solution. Note : IMPORTANT : éviter de se concentrer à proximité de la vitre de fond pour éviter la réflexion et diffusion. Lorsque nous nous concentrons plus profondément dans la solution, déconnecter l’option de mise au point automatique.</li>
	<li>Démarrer l’acquisition et économiser la pile résultante d’images au format TIFF.</li>
</ol>4. detrend et analyse de luminosité à l’aide du progiciel R nandb
<ol><li>Prétraitement contrôle qualité, utilisez ImageJ14 pour regarder les images et récupérer le profil d’intensité, comme illustré à la Figure 2a. Ceci est utile pour déterminer si oui ou non trop photoblanchiment est survenue. S’il y a trop de blanchiment, les données ne convient pas pour une analyse ultérieure. Note : ImageJ peut également être utile pour convertir des images au format TIFF depuis les formats commerciaux. Le logiciel nandb décrit ci-dessous ne peut fonctionner avec des fichiers TIFF.</li>
	<li>Téléchargez et installez R et RStudio15,16. Il est préférable de télécharger et d’installer R d’abord, puis RStudio. NOTE : Ce qui suit est une description de la façon d’utiliser le paquet de nandb R. Connaissance de la langue R n’est pas tenue d’utiliser nandb, mais il rendra la vie plus facile.</li>
	<li>Installez le paquet nandb.<ol>
<li>Ouvrez RStudio et dans la console, tapez install.packages("nandb") et attendez que l’installation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Faire connaissance avec nandb<ol>
<li>Consulter le manuel17.</li>
		<li>Consultez l’aide intégrée de RStudio pour diverses fonctions. La fonction plus susceptible d’être utilisé sera à l’aide de sera brightness(). Consulter le fichier d’aide de cette fonction en tapant ? Brightness() à la console.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calculer la luminosité<ol>
<li>Dire qu’on a un fichier image sur le bureau appelé img001.tif (Notez que « nandb » ne fonctionne qu’avec des fichiers TIFF). On peut calculer la luminosité de cette image : b <-luminosité ("~/Desktop/img001.tif", tau = "auto")<ol>
<li>Ceci affecte la luminosité de l’image à la variable b dans R. Le tau = « auto » fait en sorte que l’image est correctement redressée avant calcul de la luminosité. La chose plus commune à faire d’ici est de calculer la moyenne ou la médiane luminosité de l’image. On peut faire cela en tapant mean(b) ou median(b). On peut aussi écrire l’image de la luminosité à l’aide de fonds ijtiff::write_tif (b, "~/Desktop/whatever_img_name")</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dire un a dossier rempli d’images images_folder sur le bureau et il faut calculer la luminosité de ces images et écrire les images de luminosité sous forme de fichiers TIFF. Ensuite, voir ? brightness_folder(). Cette fonction traite un dossier entier à la fois : brightness_folder ("~/Desktop/images_folder", tau = "auto") C’est particulièrement bon pour ceux qui ont un logiciel qu’ils préfèrent à R, parce que tous les fichiers sont traités en une seule commande, et puis on peut continuer à travailler avec les images TIFF luminosité dans leur logiciel choisi, que ce soit ImageJ14 , Python ou autre chose.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Voith von Voithenberg, L., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+pair+forster+resonance+energy+transfer%3A+A+versatile+tool+to+investigate+protein+conformational+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Single pair forster resonance energy transfer: A versatile tool to investigate protein conformational dynamics.</a> BioEssays. 40, (2018).</li>
<li>Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+analysis+by+fast+acquisition+time+domain+FLIM+at+high+spatial+resolution+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells.</a> Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).</li>
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<li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageJ+ecosystem%3A+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82, 518-529 (2015).</li>
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<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Butkevich, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxylated+fluorescent+dyes+for+live-cell+labeling%3A+synthesis%2C+spectra+and+super-resolution+STED%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%3A+A+European+Journal%22%5BJournal%5D)">Hydroxylated fluorescent dyes for live-cell labeling: synthesis, spectra and super-resolution STED.</a> Chemistry: A European Journal. 23, 12114-12119 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

N & B sont une technique pour détecter les multimerization à l’aide de lumière commercial balayage confocal microscopes équipés de détecteurs numériques. Cette approche est assez attrayante par rapport à point unique FCS, SCCC et smFRET parce qu’il est libre d’étalonnage et le calcul de la luminosité est simple et concentration indépendant6. Il est important, cependant, afin de corriger les fluctuations d’intensité de blanchiment et à long terme avant d’effectuer les calculs de luminosité<sup clas...

Protein-protein Interactions j’ai n Vitro
Traditionnellement, la cristallographie et expériences de résonance magnétique nucléaire combinés avec cryo microscopie électronique (cryoEM) sont les technologies choisies pour décrire avec précision l’architecture tridimensionnelle des protéines et d’en déduire leur fonction par scrutant leurs détails structurels de haute résolution. Protéines, cependant, ne sont pas des structures statiques et peuvent subir une variété de changements de conformation et de vibrations dans le temps et l’espace. C’est pourquoi structurels informations cristallographiques ou CryoEM de données doit être complétée avec d’autres techniques (par exemple, les simulations de dynamique moléculaire et techniques de la molécule unique) : la fonction d’une protéine est liée à sa conformation changements et interactions et cette information n’est pas présent dans une structure statique. Afin de sonder dynamique intra-moléculaire, techniques basées sur la seule molécule Forster Resonance Energy Transfer (smFRET) sont très efficaces1. Ces approches sont en mesure d’évaluer différentes sous-populations de molécules dans des milieux complexes. C’est très important, car ces changements sont rapides et se produisent lors de l’acquisition des données (c.-à-d. la nanoseconde à la seconde plage).
Deux approches principales sont couramment employées pour détecter et quantifier ces changements : les protéines en solution et surface-immobilisation. Pour la détection de leurs interactions et en particulier, le processus de dimérisation induite par les ligands, smFRET n’est pas toujours le meilleur outil. En effet, frette dépend non seulement de la distance (≈10 nm), mais aussi sur l’orientation des deux dipôles (donneur et accepteur, χ2) et le chevauchement de l’émission du donneur avec les spectres d’absorption de l’accepteur2, mais peut-être cette dernière condition est inférieur important pourvu que l’expérimentateur peut a choisi le bon couple de frette. Un désavantage particulier de smFRET pour sonder les homo-dimérisation vient de l’étiquetage de la protéine d’intérêt : pour smFRET Hétéro, dimérisation ne peut être détectée jusqu'à 50 % (c.-à-d., hétéro-FRET ne sera capable de détecter le donneur-accepteur et donneur-accepteur homo-dimères mais pas donneur donneur ou accepteur d’accepteur, qui est l’autre 50 % des dimères). L’utilisation de la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) et dérivés (SCCC, etc.3) afin de déterminer les constantes de diffusion de protéine et liaison constantes in vitro est une autre alternative. Ces approches ne sont pas en mesure de quantifier pleinement les homo-dimérisation soit, comme le coefficient de concentration et diffusion et le rayon et la diffusion de mesures FCS celui d’une particule de diffusion dépendent très mal le poids moléculaire ; par exemple une augmentation de 10 fois le poids moléculaire impliquera seulement un changement de 2,15 pli dans le coefficient de diffusion4. Dans le cas de deux couleurs FCS ou HCFC, seulement 50 % des homo-dimères verra pour la même raison que ci-dessus. Approche la plus pragmatique et quantitatives pour détecter les homo-dimérisation in vitro et in vivo est homo-FRET5 , nombre et luminosité (N &amp; B)6. Compte tenu du fait que homo-FRET exige une instrumentation spécifique récupération de la valeur de l’anisotropie (c.-à-d., optique éléments/analyseurs de récupérer la polarisation parallèle et perpendiculaire), N &amp; B sont présentée ici comme une technique favorable à détecter la protéine homo-dimérisation et agrégation. Il peut être employé aussi bien in vitro et in vivo avec une installation commerciale.
Nombre et la luminosité
N &amp; B a été récemment révisé7. Cet examen a porté sur l’application de la technique dans des cellules vivantes. Il est utile de reproduire le formalisme mathématique ici comme ces équations s’appliqueront aux données collectées in vitro. Tout d’abord, il est nécessaire de définir certains termes et quantités mathématiques :
<ul><li>Une entité est un ensemble de molécules qui sont liés entre eux.</li>
	<li>La ε de luminosité d’une entité est le nombre de photons, qu'il émet par unité de temps (par image).</li>
	<li>
n est le nombre d’entités présentes.</li>
	<li>D’un pixel donné au cours d’une série d’image, &lt; i &gt; est que sa moyenne intensité et σ2 est la variance dans son intensité.</li>
</ul>Puis, avec détecteurs de comptage de photons et en supposant que les entités mobiles et pas de fond,
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq2.jpg">
où N est le nombre apparent et B est la luminosité apparente. Cela se traduit par
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq4.jpg">
Dali et al. 8 a montré qu’avec un équipement analogique, il faut trois termes de correction : le facteur S, l' arrière-plan offsetet le bruit de lecture σ02. Puis, à nouveau en supposant que les entités mobiles,
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq6.jpg">
ce qui donne
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58157/58157eq8.jpg">
Noter que l’équation ci-dessus pour est différente de celle donnée dans Dali et al. 8 et une révision ultérieure. 7 à Dali et coll. le S dans le dénominateur a été omis en raison d’une faute de frappe, et cette erreur a été reproduite dans la revue. L’équation ci-dessus est la bonne. Instructions pour la mesure de S, offset et σ02 - ainsi qu’une explication de leur sens - sont donnés par Dali et al. 8
La ε de luminosité est proportionnelle à l’État oligomère des entités diffusants : ε sera deux fois plus gros pour les dimères comme c’est pour les monomères, trois fois plus gros pour trimères comme c’est pour les monomères, deux fois aussi grands pour hexamères comme c’est des trimères et ainsi de suite. De cette façon, en mesurant la luminosité ε, on peut quantifier tout type de multimerization.
S’il y a un mélange d’oligomères Etats présents, nombre et la luminosité n’est pas capable de récupérer les différents États d’oligomères présents. Il s’agit d’une limitation de la technique.
Detrend logiciel d’algorithme et nandb
L’importance de la correction pour le photoblanchiment a été souligné précédemment9. Photoblanchiment se produit inévitablement au cours d’expériences de microscopie photonique en mode Time-lapse ; aussi bien dans des cellules vivantes et in vitro. Plusieurs approches ont été décrits dans la littérature pour corriger pour la décoloration des7. La technique de filtrage exponentielle avec choix automatique de paramètre de la méthode T est le meilleur actuel. Elle est intégrée dans le nandb du logiciel open source gratuit,9. En effet, un logiciel qui oblige l’utilisateur à choisir manuellement leur paramètre de méthode peut conduire à des résultats incorrects parce que ce choix de paramètre sera probablement arbitraire et erronée. L’algorithme automatique vérifie les données et détermine le paramètre approprié pour elle, sans la nécessité d’une intervention de l’utilisateur9. Même avec le meilleur choix du paramètre de lissage, dissociation a ses limites et ne fonctionne bien qu’avec photoblanchiment pourcentages inférieurs à 25 %, comme le montre avec des simulations9. Fait intéressant, lorsque vous utilisez la méthode de routine automatique, sa précision est telle que l'on peut travailler avec des valeurs de luminosité faible (même B &lt; 1,01), d'où de faibles intensités et encore être assez précis pour quantifier les homo-dimérisation.
Photoblanchiment provoque aussi un autre problème : la présence de fluorophores photobleached dans un polymère complexe. Ce qui rend par exemple, un trimère apparaissent comme un dimère lorsque l’une des trois unités dans le trimère est non fluorescent. Hur et Mueller10 a montré comment faire pour corriger cela et cette correction a également été soulignée dans une révision ultérieure7. Le logiciel de nandb comprend cette correction9.
La FKBP12 F36V système
FKBP12F36V est une protéine qui ne pas naturellement oligomerize, mais sait se dimériser lors de l’addition des drogues (familièrement appelé le BB dimérisation ligand)11,AP2018712. Cela en fait un cas de test idéal pour le nombre et l’éclat : avec FKBP12F36V marqués, un doublement des oligomère État doit être observé lors de l’addition de BB.

<table><tbody><tr><td>RosettaTM (DE3) Cellules pLysS</td><td>Novagen</td><td>70956-3</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PubChem ID de la substance 329824407</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphénicol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PubChem ID de la substance : 24892250</td><td></td></tr><tr><td>LB culture de démarrage</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB medium</td><td>QIAGEN</td><td></td><td></td>https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif</tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PubChem ID de substance 329815691</td><td></td></tr><tr><td>tampon IMAC</td><td>Medicago</td><td>09-1010-10</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteurs de protéase sans EDTA&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>TALON résine</td><td>Clonetech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nickel sépharose</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S200 16/60 colonne</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fond de verre 8 puits</td><td>plat d’observation Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr></tbody></table>

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Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Nombre et l’éclat est une technique de spectroscopie (FFS) de fluctuation de fluorescence exempte d’étalonnage pour la détection des protéines homo-oligomérisation. Il peut être utilisé à l’aide d’un microscope confocal classique muni de détecteurs numériques. Un protocole pour l’utilisation de la technique in vitro est indiqué au moyen d’un cas d’utilisation où le nombre et la luminosité peuvent être vu à quantifier avec précision l’État oligomère de FKBP12F36V marqué au mVenus avant et après l’ajout de la dimérisation drogue AP20187. Les auteurs discutent l’importance d’utiliser les paramètres d’acquisition microscope correcte et les méthodes de prétraitement et l’analyse des données correctes. En particulier, l’importance du choix de la correction de photoblanchiment est soulignée. Cette méthode peu coûteuse peut être employée pour étudier les interactions protéine-protéine dans de nombreux contextes biologiques.

Luminosité de redressement et de monomère
Une fois que les données ont été acquises, on peut commencer les calculs de luminosité pour déterminer l’État oligomère de la protéine d’intérêt dans la solution. Même si l’effet de blanchiment en solution n’est peut-être pas aussi drastique qu’elle peut être in vivo, la trace d’intensité probablement pas auront toujours stationnaire moyenne, probablement à caus...

Ce protocole décrit une approche sans étalonnage pour quantifier les protéines homo-oligomérisation in vitro basée sur la spectroscopie de fluorescence fluctuation en utilisant la lumière commerciale au microscope à balayage. Les paramètres d’acquisition correcte et les méthodes d’analyse sont affichés.

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Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du criblage de médicaments, telles que l’élucidation de l’effet des inhibiteurs à petites molécules sur de très faibles concentrations pour les interactions protéine-protéine. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ne nécessite aucun étalonnage, qu’elle peut être mise en œuvre dans n’importe quel microscope confocal et qu’elle utilise de très petites quantités de protéines marquées. Les implications de cette technique s’étendent au développement de médicaments anticancéreux, d’inhibiteurs à petites molécules et de divers inhibiteurs de fusion, car elle fournit des informations quantitatives sur les interactions protéine-protéine.Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des interactions et des agrégations de protéines in vitro, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que la dynamique des protéines de cellules vivantes et les interactions cellule-cellule. Pour commencer, transformez les cellules pLysS avec un vecteur pET-22b contenant des marqueurs humains monomérisés FKBP12 et N-terminal His6 et mVenus. Une fois que les cellules se sont remises de l’incubation et du choc thermique, placez-les sur de la gélose LB complétée par des antibiotiques.Transférez les colonies transformées dans une culture de démarrage de 100 millilitres de LB et cultivez pendant 16 à 20 heures à 37 degrés Celsius en secouant. Après l’incubation, diluez la culture de démarrage dense d’un à 100 dans un milieu de 100 LB en deux lots de 500 millilitres. Ensuite, cultivez pendant deux à trois heures jusqu’à une densité optique à 600 nanomètres de 0,6 à 0,8.Après avoir refroidi les cultures sur de la glace, induire la production de protéines avec l’IPTG de 250 micromolaires. Cultivez les cultures pendant 16 à 20 heures à 21 degrés Celsius et 200 tr/min. Ensuite, récoltez les cellules par centrifugation à 2 000 g pendant 20 minutes.Retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 40 millilitres de tampon A IMAC complété par des inhibiteurs de protéase sans EDTA. Maintenant, sonifiez les cellules à 500 watts, 20 kilohertz et 40 % d’amplitude à neuf secondes de marche, 11 secondes de décalage pendant 15 minutes sur glace. Après la sonication, récolter la matière soluble par centrifugation à 20 000 g pendant une heure à quatre degrés Celsius.Transférez le lysat soluble dans une fiole conique et ajoutez deux millilitres de résine TALON. Laissez la suspension incuber pendant une heure avec une rotation de 105 tr/min. Maintenant, récoltez la résine et lavez-la avec 250 millilitres de tampon IMAC A suivi de 500 millilitres de tampon IMAC B.Éluez la protéine marquée His6 à l’aide du tampon IMAC C.Injectez l’éluat dans une colonne d’exclusion de taille pré-équilibrée et collectez le pic FKBP12, qui élue à environ 87,7 millilitres.Évaluez la pureté de la protéine à l’aide de la carte SDS-PAGE, puis regroupez et concentrez au besoin. Pour mettre en place le réseau de plaques multipuits, préparez d’abord une solution de FKBP12 purifié de 100 nanomolaires dans le même tampon que celui utilisé pour la chromatographie d’exclusion stérique. Sonicate et centrifugeuse avec un essorage rapide de 13 000 tr/min pour éviter la formation d’agrégats.Maintenant, pipetez 100 à 200 microlitres de protéine diluée dans une chambre d’observation à huit puits avec un fond en verre. Ajoutez le dimériseur BB à des concentrations finales de 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 et 500 nanomolaires. À titre de référence, préparez une solution de 100 nanomolaires mVénus seule pour évaluer les effets potentiels d’agrégation et de précipitation et pour récupérer une valeur de luminosité pour le monomère avec les mêmes paramètres d’acquisition.Tout microscope à balayage optique, système confocal équipé de détecteurs numériques ou de détecteurs analogiques bien caractérisés et capable de maintenir un temps de séjour constant pour chaque pixel acquis peut être utilisé. Sélectionnez l’objectif de correction à immersion dans l’eau conçu pour la spectroscopie de corrélation de fluorescence. Maintenant, ajoutez une goutte d’eau à l’objectif d’immersion dans l’eau de correction du collier.Montez la chambre d’observation à huit puits dans la scène. Réglez la trajectoire du faisceau d’excitation en allumant le laser de 514 nanomètres et en le réglant sur une puissance de 20 à 100 nanowatts à la sortie de l’objectif. Allumez un détecteur HyD.Les détecteurs capables de compter les photons sont préférables. Sélectionnez la fenêtre d’émission de 520 à 560 nanomètres. Pour le mode d’acquisition, utilisez 16 x 16 pixels.Réglez le temps de séjour des pixels de sorte que le temps d’image soit plus long que la diffusion des protéines et que le temps de séjour des pixels soit beaucoup plus court. Cela correspondait au réglage du temps d’arrêt à environ 13 microsecondes pour le système utilisé dans cette démonstration. Réglez le sténopé sur une unité Airy pour l’émission correspondante d’environ 545 nanomètres.Sélectionnez le mode d’acquisition en temps xy, puis sélectionnez le nombre d’images à acquérir par acquisition et bien. Maintenant, réglez la taille du pixel à environ 120 nanomètres. Si le système est équipé d’un mode haut débit, introduisez les coordonnées de chaque puits et le nombre d’acquisitions par puits pour automatiser le processus.Si le système est équipé d’un système de perfusion, chargez la solution BB et programmez la perfusion pour qu’elle commence juste après la 5 000e image afin d’évaluer la cinétique de dimérisation tout en acquérant 10 000 images. Sélectionnez le puits approprié et concentrez-vous sur la solution. Ensuite, lancez l’acquisition et enregistrez la pile d’images résultante au format TIFF.Des séquences de 20 000 images de FKBP12 mVenus purifiée dans une solution de 100 nanomètres ont été acquises comme spécifié dans la section protocole. L’intensité de la première image est indiquée en même temps que le profil d’intensité moyen de l’image décolorée. La luminosité sans et avec filtrage lisse est également indiquée.Après l’acquisition de 10 000 cadres, le médicament homodimériseur BB a été ajouté à la solution lors de l’acquisition. Chaque série consécutive de 5 000 images a été analysée. La luminosité moyenne cinq minutes après l’ajout de BB était de 1,010, ce qui représente une augmentation de deux fois, indiquant un dimère FKBP12.La cinétique du processus montre un délai d’environ deux minutes entre l’addition de BB et la dimérisation complète de FKBP12. Un aspect clé pour évaluer les interactions protéine-protéine in vitro est la production et la purification de votre protéine marquée. Assurez-vous d’avoir de petites quantités de la protéine d’intérêt étiquetée et que votre protéine ne s’agrège pas selon votre analyse.Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme la résonance plasmonique de surface ou la spectroscopie de corrélation de fluorescence peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme les constantes de dissociation ou les coefficients de diffusion. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biophysique pour explorer en détail les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes. N’oubliez pas que travailler avec des réactifs pour la purification des protéines peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que des lunettes de sécurité, des gants, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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Cette vidéo montre des expériences avec l'analyse subséquente des interactions protéine-protéine par l'utilisation de micro-surfaces texturées. L'approche offre la possibilité de détecter les interactions entre protéines dans les cellules vivantes et combine haute capacité de débit avec la possibilité d'extraire des informations quantitatives.

In vivo de détection des interactions protéine-protéine sur la micro-surfaces texturées

En employant une résolution spectrale à deux photons système d'imagerie microscopique, au niveau des pixels des cartes de transfert de Förster Resonance Energy (FRET) efficacités sont obtenues pour des cellules exprimant des récepteurs membranaires hypothèse de former des homo-oligomères complexes. Depuis le FRET cartes d'efficacité, nous sommes en mesure d'estimer l'information sur le complexe stoechiométrique oligomère à l'étude.

Dans la quantification in vivo des interactions des protéines G récepteurs couplés utilisant résolution spectrale microscopie à deux photons

Cette vidéo présente la technique de spectroscopie de fluctuation de fluorescence (FFS) pour étudier l’homo-oligomérisation des protéines. Les protéines marquées par fluorescence dans un échantillon sont dimérisées à l’aide d’un agent lors de l’étude de l’oligomérisation des protéines à l’aide de la FFS. À l’aide d’un microscope confocal, au fur et à mesure que les protéines entrent et sortent du petit volume d’observation, l’analyse des fluctuations de la luminosité des molécules fluorescentes...

Spectroscopie de fluctuation de fluorescence pour étudier l’homo-oligomérisation des protéines

Ici, nous rapportons des protocoles pour détecter les protéines centromères-kinétochores endogènes et exogènes dans les cellules humaines et quantifions ces niveaux de protéines au niveau des centromères-kinétochores par coloration immunofluorescente indirecte par l’utilisation de la fixation (fixation du paraformaldéhyde, de l’acétone ou du méthanol).

Protéines immunofluorescence Analyse des endogènes et exogènes Centromere-kinétochoriens

Nous présentons ici un protocole afin d’obtenir des données de trois couleurs smFRET et son analyse avec un ensemble 3D modèle de Markov caché. Avec cette approche, les scientifiques peuvent extraire informations cinétiques systèmes complexe des protéines, y compris coopérativité ou interactions corrélées.

À l’aide de trois couleurs frette de molécules simples pour étudier la corrélation des Interactions de protéine

Ce protocole décrit une approche d’axée sur la spectroscopie de fluorescence fluctuation pour étudier les interactions entre protéines médiant les interactions cellule-cellule, c'est-à-dire des protéines localisées dans les jonctions cellulaires, directement dans les cellules vivantes. Nous fournissons des lignes directrices détaillées sur l’étalonnage de l’instrument, d’acquisition de données et l’analyse, y compris les corrections apportées aux sources de l’artefact possible.

Un dosage de spectroscopie par Fluorescence Fluctuation d’Interactions protéine-protéine à Contacts cellule-cellule

Nous présentons ici un protocole pour évaluer l’homogénéité étiquetage pour chaque espèce de protéine dans un échantillon complexe des protéines à l’échelle de la molécule.

Échelle du protéome Quantification d’homogénéité à l’échelle de la molécule unique d’étiquetage

Nous décrivons une approche de formation image pour la détermination de l'état oligomeric moyen des oligomères mEGFP-marqué-récepteurs induits par la liaison de ligand dans la membrane de plasma des cellules vivantes. Le protocole est basé sur la microscopie de la fluorescence de la réflexion interne totale (TIRF) combinée à l'analyse du nombre et de la luminosité (N-B).

Dynamique d'oligomerisation des récepteurs de surface cellulaire dans les cellules vivantes par microscopie de fluorescence interne totale combinée à l'analyse du nombre et de la luminosité

Le CENP-Une ubiquitylation est une exigence importante pour le dépôt de CENP-A au centromère, hérité par dimerisation entre la division cellulaire, et indispensable à la viabilité cellulaire. Ici nous décrivons l’analyse de spectrométrie de masse pour identifier l’ubiquité de la protéine CENP-A (EYFP-CENP-A) marquée par EYFP.

Analyse de spectrométrie de masse pour identifier l’ubiquité de cenp-A marqué par EYFP (EYFP-CENP-A)

Nous décrivons ici des protocoles pour la caractérisation biophysique de la formation de complexes ternaires induite par protéolyse ciblant les chimères (PROTACS) qui impliquent les ubiquitine ligases Von Hippel-Lindau, E3 ligase (VHL) et Cereblon (CRBN).  Les méthodes biophysiques illustrées ici comprennent la résonance plasmonique de surface (SPR), l’interférométrie de biocouche (BLI) et la calorimétrie de titrage isotherme (ITC).

le développement et l’application de tests biophysiques pour l’évaluation de la formation de complexes ternaires induite par la protéolyse ciblant les chimères (PROTACS)

Ce protocole combine la photométrie de masse avec un nouveau système microfluidique pour étudier les interactions protéine-protéine de faible affinité. Cette approche est basée sur la dilution rapide de complexes hautement concentrés en solution, ce qui permet des mesures de faible affinité et élargit l’applicabilité de la photométrie de masse.

Analyse de la formation de complexes protéiques à des concentrations micromolaires par couplage de la microfluidique avec la photométrie de masse

Découvrez une méthode sans calibration pour quantifier l'homo-oligomérisation des protéines in vitro par spectroscopie de fluctuations de fluorescence. Cette technique accessible facilite le criblage de médicaments et l'étude des interactions protéiques à faibles concentrations.

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