Fixation pulmonaire sous pression constante pour l'évaluation de l'emphysème chez les souris
26 septembre 2019
Présenté ici est un protocole utile pour la fixation pulmonaire qui crée une condition stable pour l'évaluation histologique des spécimens de poumon à partir d'un modèle de souris de l'emphysème. Le principal avantage de ce modèle est qu'il peut fixer de nombreux poumons avec la même pression constante sans effondrement pulmonaire ou déflation.
La pression constante à l’intérieur du dispositif de fixation maintient les poumons dans un état raisonnablement gonflé générant un spécimen histologique de poumon approprié pour évaluer l’emphysème induit par la fumée douce de cigarette. Le principal avantage de ce modèle est qu’il peut fixer de nombreux poumons en même temps en utilisant la même pression constante sans effondrement pulmonaire ou déflation. Naoko Arano, étudiante diplômée de mon laboratoire, démontrera la procédure.
Après avoir confirmé un manque de réponse au mouvement réflexe faire une incision dans la peau et le tissu musculaire le long de la ligne médiale de la souris, visant la région céphalique, et couper latéralement pour créer un espace de travail plus large. Après avoir exposé la ponction de la couche de diaphragme le tissu avec des forceps et ouvrir l’espace thoracique. Couper la zone sternale permettant de visualiser les poumons et le cœur.
Et couper l’oreillette gauche et le ventricule droit. Insérez une canule de calibre 24 reliée à une pompe de perfusion dans la zone ventricule droite et dirigez la canule vers la zone céphalique jusqu’à ce qu’elle atteigne l’artère pulmonaire. Ensuite, allumez la pompe et perfusez le tissu avec environ 200 millilitres de PBS pendant une heure jusqu’à ce que tout le tissu pulmonaire ait changé pour une couleur blanche.
À la fin de la perfusion couper le tissu conjonctif entourant la trachée, les poumons et le cœur, et utiliser une suture pour attacher les bronches principales droites. Ensuite, récoltez tous les lobes individuels du poumon droit et placez le cœur et les lobes du poumon gauche dans des seringues individuelles de 10 millilitres contenant un fixatif approprié. Rétractez le piston créant un vide dans la seringue pour gonfler les poumons et enlever le poumon de la seringue.
Insérez une canule de calibre 20 dans la trachée et utilisez une suture pour fixer la canule en place. Connectez une seringue d’un millilitre remplie de fixatif à la canule et remplissez le poumon d’un fixatif supplémentaire pour vérifier les fuites. Assurez-vous que le site d’insertion a été fixé pour empêcher le spécimen pulmonaire de se détacher de la planche pulmonaire pendant la fixation.
Ensuite, transférez le tissu à l’équipement de pression de fixation pulmonaire, en enlevant l’échantillon et en collant la trachée avec un noeud à la fin de la période de fixation. Le composant inférieur de l’équipement de pression de fixation pulmonaire dans lequel l’échantillon pulmonaire est inséré est relié par canule de calibre 20 à l’extrémité du flux de formaline avec un robinet d’arrêt à trois sens. La pression est générée à partir des différents niveaux de surface du fixatif entre les compartiments inférieurs et supérieurs.
La différence de pression est de 25 centimètres d’eau, mais le bouton de réglage de la hauteur peut être utilisé pour ajuster la pression à entre 25 et 30 centimètres d’eau. Une pompe relie les récipients inférieurs et supérieurs, préservant une différence de 25 centimètres dans la hauteur de surface fixative, et dirige le flux de l’agent. Après 48 heures de fixation, les poumons des souris KO SMP30 exposées à l’air ambiant ne présentent pas d’élargissement marqué de l’espace aérien.
Toutefois, l’élargissement important de l’espace aérien et la destruction des paroi alvéolaire sont observés chez les souris KO SMP30 exposées à la fumée chronique de cigarette. En outre, l’interception linéaire moyenne et l’indice destructeur des spécimens pulmonaires sont significativement plus élevés chez les souris SMP30 knockout exposées à la fumée que chez les animaux exposés à l’air. Notre laboratoire utilise 10% de formaline, mais les chercheurs peuvent utiliser d’autres agents de fixation en fonction de leurs besoins expérimentaux.
Comme nous l’avons signalé en utilisant le système de fixation démontré échantillons pulmonaires peuvent être récoltés à partir de divers modèles d’emphysème de souris pour leur évaluation morphométrique. Comme les agents de fixation peuvent être dangereux, portez toujours l’équipement de protection du personnel approprié et travaillez dans une pièce bien ventilée.
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Aperçu
Ce protocole décrit une méthode de fixation pulmonaire qui assure des conditions stables pour l'évaluation histologique d'échantillons pulmonaires provenant d'un modèle murin d'emphysème. La technique permet la fixation simultanée de plusieurs poumons sans effondrement ni dégonflement.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie
- Histologie
Contexte
- L'emphysème est une affection pulmonaire souvent provoquée par la fumée de cigarette.
- L'évaluation histologique est essentielle pour comprendre la pathologie pulmonaire.
- Le maintien de l'insufflation pulmonaire pendant la fixation est indispensable pour une évaluation précise.
- Ce protocole aborde les difficultés liées aux techniques de fixation pulmonaire.
Objectif de l'étude
- Présenter une méthode fiable de fixation pulmonaire.
- Faciliter l'évaluation des prélèvements pulmonaires en recherche.
- Améliorer la reproductibilité de l'analyse histologique des modèles d'emphysème.
Méthodes utilisées
- Utilisation d'un dispositif de fixation qui maintient une pression constante.
- Incision le long de la ligne médiane de la souris pour accéder à la cavité thoracique.
- Perforation du diaphragme afin d'ouvrir l'espace thoracique.
- Visualisation des poumons et du cœur en vue du prélèvement d'échantillons.
Résultats principaux
- Une inflation pulmonaire réussie maintenue durant la fixation.
- Capacité à fixer plusieurs poumons simultanément.
- Des échantillons histologiques stables, adaptés à l'évaluation.
- Démonstration de la procédure par un étudiant diplômé.
Conclusions
- Le protocole fournit une méthode fiable de fixation du poumon.
- Il améliore la qualité des évaluations histologiques en recherche.
- Cette technique peut être appliquée à diverses études impliquant des pathologies pulmonaires.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La fixation pulmonaire constante sous pression contrôlée répond à un défi critique dans les modèles précliniques de maladies respiratoires en permettant une évaluation histologique reproductible de l’emphysème chez la souris. Cette méthode facilite une analyse morphométrique fiable, réduit la variabilité et améliore la confiance prédictive lors de la validation précoce des cibles dans la recherche sur la BPCO. La possibilité de traiter plusieurs échantillons simultanément accélère les études comparatives et soutient des décisions solides de tri des portefeuilles.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Permet une évaluation morphométrique standardisée de la gravité de l’emphysème dans les modèles murins.
- Prend en charge la validation fonctionnelle des cibles candidates en fournissant une architecture tissulaire reproductible.
- Facilite la détection biologique des risques en minimisant les artefacts induits par la fixation.
- Améliore la confiance prédictive dans l’association entre les critères histologiques et les hypothèses mécanistiques.
Développement de tests et de criblages
- Prépare des échantillons pulmonaires validés pour des dosages histologiques quantitatifs en aval.
- Garantit la reproductibilité et la comparabilité entre les cohortes expérimentales.
- Permet un traitement évolutif de plusieurs échantillons dans des conditions identiques.
- Permet une évaluation fiable des effets des composés sur la structure pulmonaire lors de campagnes de criblage.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les modèles précliniques de pathologie pulmonaire avec des critères d'évaluation pertinents pour les études translationnelles.
- Assure une continuité entre la découverte et la validation préclinique en standardisant la préparation des tissus.
- Réduit le risque de résultats artéfactuels pouvant fausser l'évaluation des biomarqueurs ou de l'efficacité.
- Permet de prendre des décisions d'avancement ajustées au risque sur la base de données histologiques solides.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode de fixation à pression constante s'intègre à la continuité de la découverte précoce et de la validation préclinique, soutenant à la fois la validation de cibles et l'identification de composés candidats dans les modèles de maladies respiratoires.
- Biologie de la découverte : Fournit une architecture tissulaire fiable pour la validation d'hypothèses et l'analyse de voies dans les modèles d'emphysème.
- Depistage : Produit des résultats histologiques reproductibles et quantitatifs pour l'évaluation de composés.
- Analytique : Permet des mesures morphométriques telles que l'interception linéaire moyenne et l'indice de destruction pour des analyses comparatives.
- Recherche translationnelle : Facilite la corrélation entre les résultats précliniques et la pathologie clinique de l'emphysème, le cas échéant.
- Réutilisation en entreprise : Offre une capacité de fixation standardisée, adaptable à divers modèles murins de maladies pulmonaires.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance prédictive et la validation des cibles en réduisant la variabilité de la fixation.
- Valeur opérationnelle : Accroît le débit et la standardisation en permettant la fixation simultanée de plusieurs échantillons.
- Valeur stratégique : Améliore la qualité des décisions d'orientation (go/no-go) et l'efficacité du capital en soutenant des critères histologiques robustes.
- Impact sur le portefeuille : Facilite la priorisation ajustée au risque des programmes sur les maladies respiratoires, fondée sur des données tissulaires fiables.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en chirurgie murine et en manipulation des tissus pulmonaires.
- Requiert un équipement de fixation spécialisé, capable de maintenir une pression constante.
- Exige une standardisation interéquipes des paramètres de fixation pour assurer la reproductibilité.
- Peut être adapté à différents fixateurs selon les exigences expérimentales.
- Doit prendre en compte les protocoles de sécurité pour la manipulation d'agents de fixation dangereux.
