Synthèse, caractérisation et application de nanosons à oxyde de fer superparamagnetic pour la détection de la tuberculose extrapulmonaire

Globalement, le diagnostic extrapulmonaire de tuberculose est souvent retardé, car il exige une intervention chirurgicale pour confirmation due à la présentation clinique non spécifique et à une mauvaise exécution sur des essais diagnostiques. Afin d’améliorer les tests diagnostiques sérologiques des antigènes Mycobacterium tuberculosis, nous avons mis au point des nanoprobes d’oxyde de fer super-paramagnetic pour détecter la tuberculose extrapulmonaire. Les nanoprobes TB-SPIO peuvent fournir des images précises de résonance magnétique à de faibles concentrations en raison de leurs propriétés paramagnetiques sans induire de réponse auto-immune.

Les nanoprobes TB-SPIO permettent de cibler et de détecter l’infection à Mycobacterium tuberculosis. Ils peuvent également être appliqués en tant qu’agent de contraste de MRI pour la détection d’autres maladies. Assurez-vous d’étudier attentivement le protocole avant de tenter le protocole, car chaque partie de l’expérience utilise une technologie de base spécifique.

La démonstration visuelle de la méthode peut aider les élèves à comprendre comment mettre en œuvre le processus, en particulier pour certaines des expériences les plus compliquées. Pour préparer des nanoparticules magnétiques d’oxyde de fer recouvertes de dextran, combinez vigoureusement cinq millilitres de dextran T40 avec 45 milligrammes d’hexahydrate de chlorure ferrique aqueux et 32 milligrammes de solutions de tétrahydrate de chlorure ferreux à température ambiante. Ajouter rapidement 10 millilitres d’hydroxyde d’ammonium et utiliser une barre de remue-remuer pour remuer la suspension noire qui en résulte pendant une heure à température ambiante.

À la fin de l’incubation en remuant, centrifugez la solution et enlevez les agrégats. Pour séparer les produits SPIO finaux du dextran T40 non lié, chargez l’ensemble du mélange de réaction de cinq millilitres dans une colonne de chromatographie de filtration de gel de 2,5 par 33 centimètres et élitez le dextran avec 0,1 molaire d’acétate de sodium et 0,15 molaire de solution tampon de chlorure de sodium. Ensuite, recueillir les nanoparticules magnétiques purifiées d’oxyde de fer enduit de dextran dans le volume vide et d’apaiser la colonne allonge pour le fer et le dextran à 330 et 490 nanomètres selon les protocoles standard.

Pour créer des anticorps de surface Mycobacterium tuberculosis conjugués au SPIO, synthétisez d’abord l’anhydride spio-EDBE-succinique en mélangeant 10 millilitres d’une solution alcaline de SPIO-EBDE avec un gramme d’anhydride succinique pendant 24 heures à température ambiante. Le lendemain, utilisez 12 000 à 4 000 tubes à membrane poreuse moléculaire pour dialyser la solution avec des changements de 26 heures de deux litres d’eau distillée par changement. Après le dernier changement, ajouter 100 microlitres de la solution résultante à 400 microlitres de 4,5 milligrammes par millilitre anticorps de surface tb, suivie de l’ajout de 1-hydroxybenzotriazole et benzotriazol-1-yloxy tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate comme catalyseurs à température ambiante pendant 24 heures avec agitation.

Séparez les solutions de l’anticorps non lié par chromatographie de filtration de gel utilisant PBS comme tampon. Pour déterminer la taille moyenne des particules, la morphologie et la répartition de la taille, déposez la dispersion composite sur une grille de cuivre de 200 mailles et séchez l’échantillon à température ambiante avant de le charger sur un microscope électronique de transmission pour l’imagerie à 100 kilovolts. Pour mesurer les valeurs de temps de relaxation des nanoprobes, utilisez un défrisant à résonance magnétique nucléaire à 20 mégahertz et 37 degrés Celsius plus ou moins un degré.

Pour l’imagerie cellulaire pulsée nanoprobe, cultivez d’abord les monocytes THP-1 humains selon les protocoles standard de culture cellulaire. Lorsque les cellules ont atteint le stade approprié de l’activation, préincuber une fois 10 aux sept monocytes avec une fois 10 à la sixième colonie formant des unités de Mycobacterium bovis BCG pendant une heure. À la fin de l’incubation, transférer les cellules dans des tubes de microcentrifugeuse d’un millilitre et ajouter deux millimolaires de nanoprobes conjugués aux anticorps de surface SPIO Mycobacterium tuberculosis à chaque tube pendant une incubation d’une heure à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

À la fin de l’incubation, recueillir les cellules par centrifugation et résuspendre les granulés dans 200 microlitres de milieu frais. Ensuite, numérisez les échantillons à l’aide d’une séquence d’impulsions d’écho à gradient rapide par imagerie par résonance magnétique de 3,0 T pour déterminer la spécificité et la sensibilité des nanoprobes. Pour inoculer les animaux expérimentaux avec M.bovis BCG, reconstituez d’abord le vaccin lyophilisé ou le stock bactérien dans le milieu de Sauton et diluez la solution de stock reconstituée avec la solution saline.

Ensuite, chargez 100 microlitres de la solution dans une seringue d’un millilitre par animal et injectez tout le volume de bactéries de façon intradermally dans la peau dorsale dorsale gauche ou droite de chaque souris. Pour l’imagerie par résonance magnétique in vivo d’animaux vivants injectés par nanoprobe, acquérir des images d’écho spin rapide pondérées t2 de chaque animal expérimental anesthésié avant d’injecter deux nanomolaires de sondes anticorps SPIO-TB suspendues en 200 microlitres de solution saline dans la veine arrière de chaque souris. Ensuite, imagez les animaux à nouveau immédiatement après l’injection et toutes les cinq minutes pendant les 30 prochaines minutes.

À la fin de la séance d’imagerie, analyser quantitativement toutes les images de résonance magnétique à l’aide de l’intensité du signal comme mesure des régions définies d’intérêt dans des emplacements comparables d’un centre de granulome de M.tuberculosis et du muscle arrière adjacent à une zone granulomatis. Ensuite, utilisez la formule pour calculer les améliorations relatives du signal à l’aide de la mesure de l’intensité du signal avant et de zéro à trois heures après l’injection des agents de contraste. Un mois après l’inoculation, recueillir les tissus du site d’inoculation intradermique de chaque animal et tacher les échantillons de tissus épais de cinq à 10 micromètres incorporés par la paraffine fixée à la formaline avec de l’hématoxyline et de l’éosine, des taches Ziehl-Neelsen pour les bactéries acidulées et du bleu berlinois pour le fer ferrique.

L’imagerie par microscopie électronique de transmission des nanoprobes d’anticorps de surface SPIO-TB révèle que les nanoprobes présentent une apparence bien dispersée avec une taille moyenne de 3,8 plus ou moins 0,4 nanomètre par noyau. Le BCG de M.bovis et la souche bactérienne acide-rapide peuvent être détectés par la coloration de Ziehl-Neelsen. Après l’isolement et la culture avec des sondes contenant du fer ferron, les bactéries peuvent être identifiées par coloration bleue de Berlin.

Le degré de ciblage de la tuberculose des nanoprobes d’anticorps de surface SPIO-TB peut être déterminé par imagerie par résonance magnétique pondérée par T2, comme l’indique une diminution de l’intensité du signal en présence des nanoprobes qui se produit d’une manière dépendante de la concentration. Chez les animaux injectés par nanoprobe, l’amélioration pondérée en T2 de la réduction du signal dans les régions de M.tuberculosis granulomatis est environ 14 fois plus élevée que celle des sites de contrôle. Un mois après l’infection, un granulome sous-cutané organisé peut être observé chez les souris noires C57 à injection de nanoprobe 6 avec une nouvelle vascularisation sanguine et des agrégats de macrophages lymphocytes et épithélioïdes notés dans ces lésions.

L’expression positive de M.tuberculosis est également observée dans les secteurs granulomatous avec les bacilles acide-rapides souillissant positif au site de lésion. Le bleu de Berlin, une tache positive au fer ferronique, peut également être utilisé pour déterminer la sensibilité des sondes à la tuberculose. Pour l’image in vivo par résonance magnétique de la vie, les animaux injectés par nanoprobe acquièrent l’image d’écho rapide pondérée T2 de chaque animal expérimental anesthésié avant d’injecter les sondes d’anticorps SPIO-TB. Maintenant que nous avons mis en place la technique SOP pour détecter la tuberculose extrapulmonaire, ces anticorps peuvent être utilisés pour diagnostiquer spécifiquement la tuberculose extrapulmonaire.