Name: Transdermique mesurage du débit de Filtration glomérulaire chez la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Apprenez la mesure transdermique du débit de filtration glomérulaire chez la souris éveillée. Cette méthode précise évite l'anesthésie et permet des évaluations répétées de la fonction rénale.

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Ce travail a été soutenu par le centre de Vanderbilt pour la maladie de rein (VCKD) et a été en partie financé par les subventions suivantes : DOD PR161028 et R01DK112688 (Mark de Caestecker)
Nous reconnaissons l’appui à la LS, PM et BW par la MRC, EPSRC financé par BBSRC UK régénératrice médecine platforme et « Sécurité et efficacité, mettant l’accent sur le moyeu de Technologies d’imagerie » (MR/K026739/1).

Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément aux directives locales au Royaume-Uni et aux États-Unis. Expériences menées à l’Université de Liverpool ont été réalisés sous un permis accordé en vertu de la Loi de 1986 sur les animaux (procédures scientifiques) UK et ont été approuvés par le Comité d’éthique de l’Université de Liverpool. Toutes les expérimentations animales menées à Vanderbilt University Medical Center ont été approuvées par le Comité de l’emploi et de Vanderbilt institutionnels animalier.
1. préparer le FITC-sinistrin
<ol><li>Préparer le FITC-sinistrin de 40 mg/mL dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Remarque : Aliquotes peuvent être stockés à-20 ° C pendant plusieurs mois sans diminution notable de la qualité ; Toutefois, plusieurs cycles de gel-dégel doivent être évitées. FITC-sinistrin est sensible à la lumière - maintenir le tube à l’abri de la lumière.</li>
	<li>Calculer le volume de FITC-sinistrin requis pour chaque souris :<ol>
<li>Peser chaque souris sur chaque jour de la mesure.</li>
		<li>La dose recommandée est de 0,15 mg FITC-sinistrin par gramme de poids corporel.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. préparation souris
<ol><li>Préparer des cages séparées pour les souris tout en subissant des mesures GFR. Fournir des serviettes en papier absorbant et quelques boulettes de nourriture.</li>
</ol>3. enlever les poils de la souris (1-2 jours avant la mesure du DFG)
<ol><li>Anesthésier la souris à l’isoflurane 3 % et une fois que la souris est endormie, maintenir l’anesthésie à l’isoflurane de 1,5 à 2 %, selon le rythme de la respiration de la souris. Placez votre souris sujettes à une bouillote.</li>
	<li>Utiliser un rasoir électrique, va dans le sens inverse de la fourrure, pour enlever la plupart de la fourrure d’un coté du dos de la souris. Rasage du haut des pattes jusqu’au cou et à travers les côtes.</li>
	<li>Appliquer une fine couche de crème d’épilation à la zone rasée à l’aide d’un coton tige (Figure 1 a). Déplacez le coton-tige dans le sens inverse de la fourrure pour s’assurer que la crème est appliquée comme près du cuir chevelu que possible.</li>
	<li>Retirez la crème après 1 à 3 min par lavage au large avec les écouvillons en coton et l’eau chaude. N’effectuez pas la mesure si la peau semble très rouge et irritée après la mesure et ne répétez pas épilation moins de 72 h pour éviter d’endommager la peau.</li>
</ol>4. préparation du moniteur GFR transdermique
<ol><li>Utilisez l’une des deux tailles de correctifs qui sont disponibles. La première est de 2,5 x 3 cm2 en taille et peut être utilisée pour les mesures chez la souris directement. Les autres patchs sont 6 x 3 cm2 en taille et sont destinés à être utilisés chez les rats ou les plus grands animaux, mais peuvent être coupés à une taille plus petite pour une utilisation chez les souris.</li>
	<li>Enlever la pellicule un côté du patch et collez le dispositif GFR sur le côté adhésif, les LEDs de positionnement exactement au-dessus de la fenêtre transparente.</li>
	<li>Couper l’excès pastille adhésive pour s’adapter à la taille de la batterie et collez un côté du patch à la batterie.</li>
</ol>5. fixation du moniteur GFR transdermique
<ol><li>Anesthésier la souris à l’isoflurane comme indiqué au point 3.1 et placez la souris sujettes sur une bouillote. Anesthésier les souris que pour le placement du moniteur GFR transdermique et injection de FITC-sinistrin ; permettent de récupérer de l’anesthésie pour la mesure de la désintégration de la FITC.</li>
	<li>Nettoyer la peau préalablement rasée avec l’éthanol à 70 %. Placer environ 12 cm de hypoallergénique ruban soie sous la souris (Figure 1 b; la largeur de la bande devrait être ramenée à 1,5 à 2 cm pour qu’il ne soit pas trop large pour la souris).</li>
	<li>Positionner le ruban pour que seulement environ 2 cm est sur le côté droit de la souris, et le reste est sur la gauche. Replier sur un bord du côté droit du ruban pour placement facile et l’enlèvement après la mesure. Les instructions de gauche à droite pour obtenir la procédure 5.3 et 5.6 sont pour le placement du dispositif sur le côté droit de l’animal et peuvent être échangées pour le placement du dispositif sur le côté gauche de l’animal si nécessaire.</li>
	<li>Connecter la batterie à l’appareil, retirez le support de la batterie et placez-le fermement sur le dessus de l’appareil. L’appareil est prêt à l’emploi et d’acquisition de données commence quand les diodes électroluminescentes (LEDs) bleus commencent à clignoter.</li>
	<li>Retirez la pellicule de l’appareil et le placer sur la peau rasée. Placez l’appareil de telle sorte que la fenêtre exposant les LEDs est au dessus des côtes – ne l’ai pas trop près de la colonne vertébrale ou de vos membres (Figure 1).</li>
	<li>Fixer l’appareil avec le ruban blanc. Fixer le côté droit premier (Figure 1), il enroule étroitement autour de tous les bords de l’appareil, puis envelopper la gauche autour de la souris et le dispositif (Figure 1E). Idéalement, le côté gauche de la bande ne couvre que l’appareil, et le côté droit se termine sous le ventre de la souris.</li>
	<li>Fixez la bande en appuyant dessus, aux côtés de la circonférence du corps de la souris. Le ruban doit être fixé solidement, mais sans serrer. Si elle est trop lâche, puis l’appareil se déplace autour de trop et causer des artefacts de mouvement. Toutefois, il ne faut pas tellement serré qu’il restreint la respiration ou mouvement ou met trop de pression sur la peau.</li>
	<li>Laissez l’appareil intact pendant 3 minutes avant l’injection de FITC-sinistrin pour permettre à un fond constant lecture pour être pris. Pendant ce temps, chaud la queue avec un coussin chauffant ou un gant rempli d’eau chaude pour préparer pour injection dans la veine queue (si vous utilisez cet itinéraire).</li>
</ol>6. FITC-sinistrin Injection
<ol><li>Préparez une seringue à insuline avec le montant calculé du FITC-sinistrin requis pour injection (cela peut être arrondi le plus proche de 10 μL).</li>
	<li>Administrer FITC-sinistrin de la veine caudale ou injection rétro-orbitaire. FITC-sinistrin doit être administré en un seul bolus lisse mais rapid afin d’éviter plusieurs pics sur la courbe de dégagement. Il est préférable d’administrer une dose partielle qu’afin de faire plusieurs tentatives d’administrer la FITC-sinistrin.</li>
</ol>7. mesure du DFG
<ol><li>Placez votre souris dans une cage en soi pour récupérer de l’anesthésie isoflurane et pour la durée de la période de mesure.</li>
	<li>Observez la souris dans la cage pendant 1,5 h et puis supprimez le périphérique. Retirer l’appareil de la souris consciente est rapide, efficace et généralement bien toléré par la souris, mais les nouveaux utilisateurs peuvent préférer à anesthésier la souris pour cette étape.<ol>
<li>Comme option, anesthésier la souris à l’isoflurane.</li>
		<li>Comme l’autre option, placez votre souris sur la grille sur le dessus de la cage, ce qui permet de saisir les barres métalliques, tandis que le périphérique est supprimé de la souris.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retirer le ruban de plâtre blanc de dessous le ventre en un mouvement rapide, lisse et retirer le périphérique et le plâtre noir de la peau. Veillez à ce que la batterie ne débranche pas de l’appareil encore.</li>
	<li>Retourner la souris à sa cage maison.</li>
</ol>8. lire et évaluer les données
<ol><li>Soigneusement déconnecter la batterie de l’appareil</li>
	<li>Branchez l’appareil sur le câble USB et branchez le câble à l’ordinateur</li>
	<li>Ouvrez le logiciel de lecture (Sensor_ctrl_app.exe)</li>
	<li>Dans l’ordre, cliquez sur « se connecter », « lire », « renommer » et « enregistrer », puis fermez le programme</li>
	<li>Traiter et évaluer les données dans le logiciel d’analyse tel que décrit dans le manuel respectif</li>
</ol>

<ol><li>Schreiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcutaneous+measurement+of+renal+function+in+conscious+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transcutaneous measurement of renal function in conscious mice.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 303 (5), F783-F788 (2012).</li>
<li>MediBeacon. Related Publications. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.medibeacon.com/preclinical/publications/">http://www.medibeacon.com/preclinical/publications/</a> (2018).</li>
<li>Friedemann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+kinetic+model+for+the+transcutaneous+measurement+of+glomerular+filtration+rate+in+experimental+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Improved kinetic model for the transcutaneous measurement of glomerular filtration rate in experimental animals.</a> Kidney International. 90 (6), 1377-1385 (2016).</li>
<li>Schock-Kusch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+transcutaneous+measurement+of+renal+function+in+various+strains+of+conscious+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reliability of transcutaneous measurement of renal function in various strains of conscious mice.</a> PLoS One. 8 (8), e71519(2013).</li>
<li>Schock-Kusch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcutaneous+assessment+of+renal+function+in+conscious+rats+with+a+device+for+measuring+FITC-sinistrin+disappearance+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves.</a> Kidney International. 79 (11), 1254-1258 (2011).</li>
<li>Herrera Pérez, Z., Weinfurter, S., Gretz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcutaneous+Assessment+of+Renal+Function+in+Conscious+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), 53767(2016).</li>
<li>Cowley, A. W. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+glomerular+filtration+rate+reduction+determined+in+conscious+Dahl+salt-sensitive+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Progression of glomerular filtration rate reduction determined in conscious Dahl salt-sensitive hypertensive rats.</a> Hypertension. 62 (1), 85-90 (2013).</li>
<li>Scarfe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measures+of+kidney+function+by+minimally+invasive+techniques+correlate+with+histological+glomerular+damage+in+SCID+mice+with+adriamycin-induced+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Measures of kidney function by minimally invasive techniques correlate with histological glomerular damage in SCID mice with adriamycin-induced nephropathy.</a> Scientific Reports. 5, 13601(2015).</li>
<li>Lazzeri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocycle-related+tubular+cell+hypertrophy+and+progenitor+proliferation+recover+renal+function+after+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endocycle-related tubular cell hypertrophy and progenitor proliferation recover renal function after acute kidney injury.</a> Nature Communications. 9 (1), 1344(2018).</li>
<li>Street, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+adenosine+1a+receptor+signaling+on+GFR+early+after+the+induction+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">The role of adenosine 1a receptor signaling on GFR early after the induction of sepsis.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 314 (5), F788-F797 (2018).</li>
<li>Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+model+of+acute+kidney+injury+and+post+injury+fibrosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxemic+acute+renal+failure+is+attenuated+in+caspase-1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Endotoxemic acute renal failure is attenuated in caspase-1-deficient mice.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 288 (5), F997-F1004 (2005).</li>
<li>Eisner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).</li>
<li>Bankir, L., Yang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+urea+and+glucose+handling+by+the+kidney%2C+and+the+urine+concentrating+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">New insights into urea and glucose handling by the kidney, and the urine concentrating mechanism.</a> Kidney International. 81 (12), 1179-1198 (2012).</li>
<li>Qi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+determination+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice+using+FITC-inulin+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 286 (3), F590-F596 (2004).</li>
<li>Peters, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetic+basis+of+glomerular+filtration+rate+measurement+and+new+concepts+of+indexation+to+body+size%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Nuclear+Medicine+and+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">The kinetic basis of glomerular filtration rate measurement and new concepts of indexation to body size.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 31 (1), 137-149 (2004).</li>
<li>Chapman, M. E., Hu, L., Plato, C. F., Kohan, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioimpedance+spectroscopy+for+the+estimation+of+body+fluid+volumes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Bioimpedance spectroscopy for the estimation of body fluid volumes in mice.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 299 (1), F280-F283 (2010).</li>
</ol>

D S-K, JF et YS sont employés chez MediBeacon GmbH le fabricant et distributeur du moniteur GFR transdermique. D S-K et JF sont inventeurs sur les brevets et demandes de brevet pour la technologie présentée.

Ce manuscrit et la vidéo de formation qui l’accompagne fournissent des directives pratiques pour l’utilisation de transdermal moniteurs GFR chez la souris. Les étapes de la procédure la plus critiques sont la fixation correcte de l’appareil sur le dos de l’animal et bien enveloppant la bande autour de l’abdomen. La meilleure position est un peu gauche ou à droite de la ligne médiane, au-dessus de la cage thoracique. Le patch et l’appareil doivent être solidement fixées à la peau, mais ils ne doivent pas être si serrés qu’ils restreignent la respiration, mouvement, ou affectent la circulation sanguine de la peau sous l’appareil, car cela conduirait à des mesures inexactes/défectueux. En outre, puisque la surveillance se produit chez des souris conscientes après que qu’ils ont récupéré de l’anesthésie, corriger le placement de l’appareil de la part de l’organisme avec interférence le plus bas des résultats de mouvement dans les mesures transdermique peu artefacts de mouvement. Pour cette raison, il est important que l’appareil n’est pas placé trop près de la partie supérieure des membres afin que les souris peuvent bouger leurs épaules.
Il est important à épiler les souris un ou deux jours avant la mesure du DFG, comme épilation influe sur la mesure de la clairance de la FITC-sinistrin, avec des données préliminaires indiquant qu’épilation immédiatement avant la mesure de transdermal GFR augmente la demi-vie apparente du FITC-sinistrin. On ne connaît pas le mécanisme pour cela. Par conséquent, afin d’obtenir des mesures fiables sur plusieurs points dans le temps et entre les expériences, il est conseillé à épiler les souris à l’avance, pour permettre à la peau pour se remettre de ce processus avant de procéder à des mesures de GFR. Crème épilation appliquer pas sur la même zone de peau dans les 72 heures d’une demande préalable, pour ne pas endommager la peau chimique. Dans de nombreux cas, la fourrure repousse prend plusieurs jours, ou jusqu'à une semaine, et donc re-demande d’épilation crème en 72 h peut facilement être évitée.
Parce qu’à 50 % de sérum créatinine est excrété en profilé tubulaire en souris13, et parce qu’il y a réabsorption accrue d’urée de tubules rénaux lorsque les souris sont déshydratés14, créatininémie et BUN sont mauvais marqueurs de la fonction rénale. Toutefois, en raison de leur commodité, ces tests de continuent à servir comme la principale mesure de la fonction rénale dans les études précliniques de AKI et CKD chez la souris. Toutefois, conformément à la contribution importante de la sécrétion tubulaire à l’excrétion de créatinine chez la souris normale ou près d’une fonction rénale normale13, créatininémie a montré peu de corrélation avec le dégagement de la FITC-sinistrin au taux d’élimination élevé (faible Half-Life FITC-sinistrin), indiquant que la créatinine est une mesure indépendante de la fonction rénale chez les souris présentant une insuffisance rénale légère. En revanche, alors que BUN corrèle bien avec dégagement FITC-sinistrin chez les souris ayant une insuffisance rénale légère, il y a mauvaise corrélation entre la clairance BUN et FITC-sinistrin chez des souris ayant plus graves lésions rénales (haute FITC-sinistrin Half-Life). Ceci est probablement causé par les effets de la réabsorption de l’urée associée de déshydratation chez les animaux malades avec insuffisance rénale sévère.
Un avantage majeur de la mesure de GFR transdermique, comparée aux autres techniques de perfusion constante pour la mesure du DFG, ou dégagement de bolus, c’est qu’il ne nécessite pas de collections soigneusement minutées de sang ou d’urine. Ceux-ci peuvent être particulièrement difficiles chez les souris car elles ont un volume sanguin total faible et débit urinaire comparativement aux rats. En outre, souris doivent être gérées uniquement pour la fixation de l’appareil et l’injection, mais pas pour plusieurs ponctions veineuses, tel que requis pour bolus classique jeu expériences15. En outre, la durée de l’anesthésie est courte, et comme tel, il est possible d’effectuer des mesures répétées chez les souris individuels au fil du temps. La fréquence à laquelle les mesures peuvent être réalisées principalement sur l’état de santé des souris, l’aptitude du chercheur pour injections intraveineuses et règlements institutionnels locaux dépend séances répétées de l’anesthésie. Chez des souris saines, indemnes, des transdermique GFR mesures peuvent être réalisées de tous les jours, avec des effets minimes ou non préjudiciables sur la souris. Cependant, souris blessées, souffrant d’AKI ou CKD sont peu susceptibles de tolérer les séances répétées d’anesthésie ainsi que les souris saines, et donc la fréquence des mesures devrait être réduite.
La principale limite de mesure de GFR transdermique, comparativement aux méthodes de dégagement de bolus pour mesurer GFR chez la souris, c’est que la cinétique d’excrétion sont mesurés seulement comme changement dans l’intensité de la fluorescence relative au fil du temps et non comme des concentrations absolues de traceur. Pour cette raison, il est seulement possible de mesurer la constante de vitesse de la seule décroissance exponentielle de l’excrétion cinétique, qui est une estimation très proche de dfg normalisé le volume extracellulaire16. Pour exprimer GFR en mL/min, le volume extracellulaire de l’animal doit être estimée à l’aide d’un facteur de conversion établi dans des études antérieures dans lesquelles des mesures simultanées des concentrations plasmatiques de FITC-sinistrin ont été effectués1. Cependant, ce facteur de conversion ne peut pas correctement estimer les volumes de liquide extracellulaires tout aussi bien dans toutes les souris, étant donné que le volume de fluide peut être affecté par une variété de facteurs extérieurs, notamment l’âge, le sexe, l’état d’hydratation (ce qui peut être affectée par la chirurgie des interventions comme insuffisance rénale) et17de poids. Cependant, contrairement au bolus dosage méthode pour évaluer des GFR chez la souris, mesure transcutanée de GFR subit moins de variabilité opérateur-dépendant car il n’est pas affecté par des erreurs de dosage ou par des erreurs dans le calendrier des collections de sang.
Une autre limite de la technique de mesure transcutanée GFR est que les déplacements de signal de référence peuvent se produire au cours de la mesure en raison de blanchiment de la peau fluorophores et l’anesthésie requise pour injection de pièce jointe et traceur de dispositif. Cette limitation a été adressée par Friedemann et ses collègues en mettant en oeuvre un algorithme de correction3. L’implémentation de cet algorithme a conduit à une amélioration de la précision de la technique percutanée comparable à une technique de perfusion constante de l’évaluation du DFG.
Une question fréquemment posée est si pigmentation de la peau chez les souches de souris différente affecte le transdermique clairance FITC-sinistrin. Pigmentation de la peau réduit l’intensité du signal FITC-sinistrin comme pigments sombres absorbe l’excitation bleue et la verte emission signaux provenant de mesures FITC-sinistrin. Toutefois, le taux d’excrétion du FITC-sinistrin est indépendant de l’ensemble intensité du signal. En outre, alors que le signal mesuré est inférieur, le signal de fond est aussi plus faible chez les souris pigmentées. Parce que le signal de fond est un mélange d’autofluorescence des fluorophores de peau et de la réflexion de la lumière d’excitation, nous avons trouvé que le rapport de fond-à-maximum de signal est comparable, ou même améliorer, chez les animaux pigmentés. En outre, les artefacts de mouvement, qui sont causés par l’exposition de la peau environnante à lumière réfléchie, sont réduits chez les souris pigmentées, puisque la lumière réfléchie est aussi absorbée par la peau pigmentée.
En conclusion, la technique, nous avons présenté permet une mesure précise du TFG, conscients, se déplaçant librement les souris de tous les types de peau. La technique étant indépendante des prélèvements sanguins, il peut être utilisé à plusieurs reprises sur le même animal pour observations longitudinales dans les modèles CKD, ainsi que pour la mesure des changements rapides du TFG qui se produisent après l’induction de AKI.

L’utilisation de transcutanée GFR moniteurs chez la souris a été signalée par Schreiber et ses collègues en 2012 et a été validé en comparant les mesures GFR obtenues à l’aide de cette technique, avec les résultats obtenus par une mesure directe de dégagement de bolus FITC-sinistrin de les échantillons de sang série1. A ce jour, il y a eu 35 publications évaluées par des pairs dans lequel transcutanée GFR moniteurs ont été utilisés chez les rats et les souris (on trouvera une liste régulièrement mise à jour des articles de revues et de résumés de conférences qui utilise le moniteur GFR préclinique à la MediBeacon site Web2). Mesures GFR transdermique chez le rat et la souris a été décrit chez un certain nombre de publications1,3,4,5, et un tutoriel vidéo illustrant son utilisation chez les rats a été publié6. Cependant, mesure chez la souris présente des difficultés techniques supplémentaires. Ici, nous fournissons le premier guide pratique détaillé à l’usage des moniteurs GFR transdermique chez la souris.
Il y a plusieurs raisons pourquoi les enquêteurs commencent à favoriser l’utilisation de moniteurs GFR transdermique pour évaluer la fonction rénale chez les modèles de rongeurs. Mesure de transdermique d’habilitation de la FITC-sinistrin a été établi pour fournir une mesure plus sensible et plus précise de la fonction rénale, par rapport aux paramètres traditionnels de la fonction rénale comme sérum créatinine et sang urée d’azote (BUN)7, 8. En mettant en oeuvre un algorithme d’évaluation améliorée, Friedemann et ses collègues ont démontré que le système atteigne précision comparable à l’étalon-or, la technique d’infusion constante pour GFR mesure3. Des études récentes ont également montré que l’analyse séquentielle à l’aide de moniteurs GFR transcutanées peut servir pour étudier les changements précoces en fonction rénale ainsi que la récupération fonctionnelle après l’induction de lésion rénale aiguë (AKI) sans interférer avec le sang des animaux volume ou hémodynamique, puisque le test n’exige pas séquentielle de sang d’échantillonnage9,10. La capacité de mesurer GFR avec haute précision et une sensibilité à plusieurs reprises chez le même animal rend cette technique intéressante pour une variété de disciplines différentes. Transdermique GFR moniteurs ont été utilisés par les compagnies pharmaceutiques pour évaluer la toxicité de nouveaux composés, ainsi que dans les universités pour la recherche fondamentale et translationnelle.

<table><tbody><tr><td>Moniteur DFG transdermique (livré avec 1 appareil, 2 batteries et 1 chargeur)</td><td>MediBeacon GmbH</td><td>TDM-MH001</td><td>Logiciel de lecture : MPD Lab ; Logiciel d’analyse : MPD Studio</td></tr><tr><td>Batteries supplémentaires</td><td>MediBeacon GmBH</td><td>PWR-BT0001</td><td></td></tr><tr><td>Patchs de fixation</td><td>MediBeacon GmbH</td><td>petit : PTC-SM001 ; grand : PTC-LG001</td><td></td></tr><tr><td>FITC-sinistrin</td><td>MediBeacon GmbH</td><td>FTC-FS001</td><td></td></tr><tr><td>Ruban de soie hypoallergénique</td>, <td>par exemple Durapore (1538-2), ou Kendall (7138C), ou Leukosilk (01032-00)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chambre d’anesthésie, isoflurane, oxygène</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coussin</td><td></td><td></td><td></td>chauffant</tr><tr><td>Rasoir</td><td></td><td></td><td></td>électrique</tr><tr><td>Crème dépilatoire (épilation)</td> <td>par ex. Veet ou Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotons-tiges</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotons-tiges</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minuterie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balances</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 % lingettes</td><td></td><td></td><td></td> à l’éthanol</tr></tbody></table>

transdermique mesurage du débit de filtration glomérulaire chez la souris

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermique analyse de taux de filtration glomérulaire (GFR) est une technique établie qui est utilisée pour évaluer la fonction rénale chez des modèles souris et rat d’insuffisance rénale aiguë et d’insuffisance rénale chronique. Le système de mesure se compose d’un détecteur de fluorescence miniaturisés qui est fixé directement sur la peau sur le dos des animaux conscients et vibrant librement et mesure de la cinétique d’excrétion du traceur exogène GFR, isothiocyanate de fluorescéine (FITC) sinistrin conjugué (un analogue de l’inuline). Ce système a été décrit en détail chez les rats. Toutefois, en raison de leur petite taille, mesure du DFG transcutanée chez la souris présente des difficultés techniques supplémentaires. Dans cet article, nous fournissons donc le premier guide pratique détaillé à l’usage des moniteurs GFR transdermique chez les souris basées sur l’expérience combinée de trois différents chercheurs qui ont effectué ce test chez les souris pendant plusieurs années.

Dans cette section, nous présentons des résultats représentatifs de l’utilisation du moniteur de GFR transdermique. Le moniteur transdermique a été utilisé dans une variété de souches de souris et modèles de AKI et CKD2.
Figure 2 illustre représentant courbes de dégagement FITC-sinistrin chez les souris mâles BALB/c avant et après lésion de reperfusion de l’ischémie (IRI) avec néphrectomie controlatérale simultanée. FITC-sinistrin est rapidement éliminé de la circulation chez la souris (Figure 2 a), mais le jeu est considérablement retardée chez les souris avec AKI (Figure 2 b, C). Souris avec AKI très sévère, il y a peut-être pas n’importe quel changement de fluorescence de la FITC-sinistrin au cours de la période de mesure de 90 minutes, indiquant une absence complète de filtration glomérulaire (Figure 2).
Mesure de GFR transdermique est minimalement invasive et peut être utilisé pour surveiller les modifications de la fonction rénale chez les souris mêmes sur plusieurs points dans le temps. La figure 3 illustre les changements DFG déterminée par des mesures de dégagement de séquentiel transdermique FITC-sinistrin au départ et 1, 2 et 4 jours après induction IRI (ischémie unilatérale avec néphrectomie controlatérale simultanée). Données présentées comprennent Half-Life clairance de FITC-sinistrin (Figure 3 a) et GFR (Figure 3 b) calculée à partir de la demi-vie de clairance mesurée FITC-sinistrin, tel que décrit par Schreiber et al.1.
Dans la Figure 4, insuffisance rénale chronique (IRC) a été induite chez la souris BALB/c mâle en effectuant prolongée IRI unilatérale suivie par néphrectomie controlatérale retardée, comme décrit11. GFR a été évaluée par la clairance transdermique FITC-sinistrin lendemain 26 l’IRI initial. L’augmentation FITC-sinistrin Half-Life (Figure 4 a) et par conséquent la diminution de la DFG (Figure 4 b), indiquent la fonction rénale est altérée chez ces souris. Ces résultats démontrent que la mesure transcutanée de GFR peut être utilisé pour mesurer les changements dans la fonction rénale chez les souris d’IRC.
Figure 5 a montre que le FITC-sinistrin Half-Life est étroitement liée avec semi quantitative évaluation histologique des lésions tubulaires sur les cotes de la pleine gamme de GFR chez les souris indemnes et chez les souris présentant différentes sévérités d’AKI induite par l’IRI. En revanche, le sérum créatinine et sang urée (BUN) a montré un positif mais plus faible corrélation avec un dégagement FITC-sinistrin (Figure 5 b, C), ce qui indique que transcutanée GFR mesures fournissent une mesure plus fiable de rénal blessures (scores de lésions tubulaires) suite AKI induite par l’IRI que soit créatininémie ou BUN.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58520/58520fig1.jpg"> Figure 1 : relier le moniteur GFR transdermique. Photographies de l’épilation (A), mise en place de la bande sous la souris (B), le placement de l’appareil sur la peau (C) de la souris et le dispositif de sécurité en enroulant la bande autour de la souris et le dispositif (D-E), <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58520/58520fig1large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour obtenir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58520/58520fig2.jpg"> Figure 2 : courbes de dégagement exemple FITC-sinistrin chez les souris mâles BALB/c avant et après lésion de reperfusion de l’ischémie (IRI) avec néphrectomie controlatérale simultanée. Courbes de dégagement au départ (A) et un jour après que chirurgie IRI (B) chez la souris même, indiquant avec facultés affaiblies de la fonction rénale de cette souris. Clairance (C) la courbe d’une souris plus grièvement blessée un jour après la chirurgie de l’IRI. Il n’y avait pas de jeu de FITC-sinistrin au cours de la période de mesure, indiquant une insuffisance rénale. Les points noirs représentent les données brutes, lignes bleues représentent la fit 3 compartiments et lignes vertes représentent les intervalles de confiance de 95 %. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58520/58520fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58520/58520fig3.jpg"> Figure 3 : souris BALB/c Male, age 8-10 semaines a subi une ischémie unilatérale avec néphrectomie controlatérale simultanée (n = 5). GFR a été évaluée au départ, puis 1, 2 et 4 jours après la chirurgie et par rapport aux souris témoins opérés (n = 5). FITC-sinistrin Half-Life (A) a été utilisé, ainsi que le poids du corps des souris, pour calculer le GFR (B). Points de données représentent des animaux, et les barres d’erreur représentent la moyenne et l’écart-type. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58520/58520fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58520/58520fig4.jpg"> Figure 4 : âge de souris mâles BALB/c 8-10 semaines a subi une ischémie unilatérale avec retardée néphrectomie controlatérale au jour 8 (n = 5). GFR a été évalué par le jour 26 et a été comparée aux souris témoins du même âge en bonne santé (n = 5). FITC-sinistrin Half-Life (A) a été utilisé, ainsi que le poids du corps des souris, pour calculer le GFR (B). Points de données représentent des animaux, et les barres d’erreur représentent la moyenne et l’écart-type. Des lésions tubulaires a été marquée 0-50 selon le degré de nécrose et cast de formation par un observateur aveugle (L.R.) sur des sections de rein acide périodique-Schiff-colorées. Cette méthode est une adaptation de Wang et ses collègues12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58520/58520fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58520/58520fig5.jpg"> Figure 5 : corrélation entre les trois mesures de fonction/lésions rénales (évaluation histologique des lésions tubulaires (n = 39), créatininémie (n = 30) et l’azote de l’urée (BUN) de sang (n = 30)) avec un jeu FITC-sinistrin (demi-vie). Des souris BALB/c mâles ont subi diverses périodes du pédicule rénal unilatéral de serrage (25 à 45 min) ou la chirurgie de l’imposture, avec simultanée néphrectomie controlatérale pour induire la gravité différente de AKI, et histopathologie et paramètres de la fonction rénale ont été évaluées au jour 4 après IRI. Le score de lésions tubulaires ont montré une forte corrélation positive avec le dégagement de la FITC-sinistrin (A; R2 = 0,88), tandis que la créatinine sérique (B) et BUN (C) les deux positifs, mais plus faible corrélation avec un dégagement FITC-sinistrin (R2 = 0,64 et 0,52, respectivement). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58520/58520fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Nous décrivons ici un protocole permettant de mesurer le taux de filtration glomérulaire (GFR), conscients, se déplaçant librement de souris à l’aide d’un moniteur GFR transdermique.

Transdermique mesurage du débit de Filtration glomérulaire chez la souris

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Aujourd’hui, nous allons démontrer la technique de mesure transdermique de la filtration glomerular ou tGFR chez la souris. Il ya un certain nombre de caractéristiques de cette méthode que je pense sont dignes de mention. Tout d’abord, actuellement tGFR est le moyen le plus précis d’évaluer la fonction rénale chez la souris.Deuxièmement, tGFR est effectué chez les souris conscientes et librement mobiles de sorte qu’il évite les complications de l’anesthésie. Troisièmement, une fois que vous avez maîtrisé la technique, il est raisonnable d’être en mesure d’effectuer des mesures de 30 à 40 tGFR en une seule journée. Enfin, les mesures tGFR peuvent être effectuées à plusieurs reprises chez une souris in vitro.Ce que cela signifie, c’est que nous pouvons effectuer des mesures périodiques de la fonction rénale dans les milieux de maladies aiguës et chroniques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet aux chercheurs de mesurer le taux de filtration glomerulaire ou GFR chez des souris conscientes et librement mobiles avec une grande précision et sensibilité. Un à deux jours avant la mesure tGFR, après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des pieds, placez une souris anesthésiée en position couchée sur un coussin chauffant.À l’aide d’un rasoir électrique, couper contre la direction de la croissance pour enlever la majeure partie de la fourrure d’un côté du dos de la souris du haut des pattes arrière jusqu’au cou et à travers les côtes. Utilisez un coton-tige pour appliquer une fine couche de crème depilation sur la peau exposée contre la direction de la croissance pour s’assurer que la crème est appliquée aussi près de la peau que possible et retirer la crème après une à trois minutes avec des cotons-tiges propres et de l’eau chaude. Le jour de l’intervention, couper un patch adhésif de six par trois centimètres à la taille de l’appareil GFR avant d’décoller l’arrière du patch et de coller l’appareil sur le côté adhésif du patch avec les diodes électroluminescentes placées immédiatement au-dessus de la fenêtre claire.Ensuite, collez un petit morceau du patch à la batterie. Pour fixer le moniteur, avec la souris anesthésiée en position couchée, nettoyez la peau pré-rasée avec 70% d’éthanol et ajustez la largeur d’un morceau de ruban adhésif d’environ 12 centimètres en le déchirant dans le sens de la longueur. Placez le ruban sous la souris avec deux centimètres d’un côté de l’animal se pliant sur un bord du côté droit de la bande pour un placement facile et l’enlèvement après la mesure.Ensuite, connectez la batterie à l’appareil, en enlevant le support de la batterie et en plaçant la batterie en toute sécurité sur l’appareil. L’appareil est prêt à l’emploi et l’acquisition de données commence lorsque les LED bleues commencent à clignoter. Retirez le support du patch sur l’appareil et placez l’appareil sur la peau rasée de sorte que la fenêtre exposant les LED est au-dessus des nervures sécurisant le côté droit de l’appareil avec du ruban adhésif.Il est important d’assurer une fixation sécurisée de l’appareil sans restreindre la mobilité de la souris ou mettre trop de pression sur la peau. Ensuite, enroulez fermement le côté gauche de la bande autour de la souris et de l’appareil. Laissez l’appareil enregistrer une lecture de fond stable pendant trois minutes.Entre-temps, réchauffer la queue avec un coussin pour la tête et charger une seringue à insuline avec le volume expérimental approprié de FITC-sinistrin pour l’injection arrondie aux 10 microlitres les plus proches. Administrer la FITC-sinistrin par voie intraveineuse dans un bolus lisse mais rapide. Il est important que l’utilisateur est à l’aise avec les injections IV car il est nécessaire d’administrer avec succès le FITC-sinistrin en un bolus plutôt que sur plusieurs tentatives qui se traduira par de multiples pics dans la courbe de dégagement.Pour mesurer le tGFR, placez la souris dans sa propre cage avec surveillance jusqu’à la pleine récumbence et laissez le dégagement fitc-sinistrin être enregistré pendant 1,5 heure. À la fin de la période de mesure, placez la souris sur la grille sur le dessus de la cage et permettant à la souris de saisir les barres métalliques, tirez le ruban sous le ventre en un mouvement rapide et lisse. Retirez ensuite tout ruban de l’appareil et du patch de la peau en prenant soin que la batterie ne se déconnecte pas de l’appareil et ne retourne pas la souris dans sa cage.Pour évaluer les données, déconnectez soigneusement la batterie et utilisez un câble USB pour connecter l’appareil à l’ordinateur. Ouvrez le logiciel de lecture et cliquez sur Connect, Read, Rename and Save. Ensuite, fermez le programme et le processus et évaluez les données dans le logiciel d’analyse en fonction des instructions du fabricant.Tandis que fitc-sinistrin est rapidement dégagé de la circulation chez les souris en bonne santé, ce dégagement est considérablement retardé chez les souris avec des dommages rénaux aigus. Chez les souris ayant des lésions rénales aiguës très graves, il peut y avoir très peu ou pas de dégagement de la fluorescence FITC-sinistrin pendant toute la période de mesure de 90 minutes indiquant une absence complète de filtration glomerular. La mesure transdermique du GFR est peu invasive et peut donc être utilisée pour surveiller les changements de la fonction rénale chez les animaux individuels sur plusieurs points de temps.En effet, dans cette expérience représentative, les mesures séquentielles ont démontré des changements dans la fonction rénale à zéro, un, deux, et quatre jours après des dommages de reperfusion d’ischémie. Dans ce modèle chronique de maladie rénale de souris, la relation inverse de la demi-vie fitc-sinistrin au GFR peut être directement corrélée à la fonction rénale altérée observée chez ces animaux. En effet, la demi-vie de FITC-sinistrin est étroitement corrélée avec l’évaluation histologique semi-quantitative des dommages tubulaires au-dessus de la gamme complète des mesures de GFR chez les souris non blessées et chez les souris avec différentes séverités des dommages aigus aigus induits par des dommages de réperfusion d’ischémie.En revanche, la créatinine de sérum et l’azote d’urée de sang démontrent une corrélation positive mais plus faible avec le dégagement de FITC-sinistrin indiquant les mesures transcutanées de GFR fournissent une mesure plus fiable des dommages rénaux que la créatinine de sérum ou l’azote d’urée de sang. La mesure transdermique du GFR est une mesure plus sensible de la fonction rénale que les biomarqueurs traditionnels tels que la créatinine et le BUN. Ceci fournit une évaluation plus précise de l’efficacité des thérapies nouvelles pour la maladie rénale dans la recherche préclinique.Les étapes les plus critiques de cette méthode sont l’attachement approprié de l’appareil au dos de la souris et l’administration iv réussie de FITC-sinistrin. Ces étapes sont essentielles pour obtenir une évaluation précise du GFR chez la souris.

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