Name: Préparation de champignons et de matières végétales pour l’élucidation de la structure dynamique de polarisation nucléaire RMN à l’état solide (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Découvrez la préparation d'échantillons fongiques et végétaux pour la RMN à l'état solide et la polarisation nucléaire dynamique. Cette méthode permet d'étudier les biomatériaux à résolution atomique dans leur environnement natif.

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Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation, par le biais de NSF OIA-1833040. Le laboratoire National de champ magnétique élevé (NHMFL) est pris en charge par la National Science Foundation, par le biais de DMR-1157490 et l’état de Floride. Le système MAS-DNP au NHMFL est financé en partie par les NIH S10 OD018519 et NSF CHE-1229170.

1. croissance de 13C, 15N-étiqueté Aspergillus fumigatus milieu liquide
<ol><li>Préparation sans étiquette et 13C, milieu de croissance marquée N 15 NOTE : Les moyen de levure Extract Peptone Dextrose (DPJ) et l’amélioration moyenne minime43 ont été utilisés pour l’entretien des cultures fongiques. Toutes les étapes après la stérilisation sont effectuées dans une hotte à flux laminaire pour minimiser la contamination.<ol>
<li>Préparation du milieu liquide sans étiquette : dissoudre 6,5 g de poudre de la DPJ dans 100 mL d’eau distillée, puis stériliser pendant 25 minutes à 134 ° C.</li>
		<li>Préparation du milieu solide sans étiquette<ol>
<li>Ajouter 1,5 g d’agar et 6,5 g de poudre de la DPJ dans 100 mL d’eau distillée.</li>
			<li>Stériliser le milieu pendant 25 min à 121 ° C, puis laissez refroidir à 50 ° c environ.</li>
			<li>Transférer les 13-15 mL de milieu dans chaque pré stérile plastique pétri et couvrir le plat à l’aide d’un couvercle immédiatement.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Préparation de 13C, 15N marqué un milieu liquide Remarque : Pour préparer la solution de croissance isotope labeling, un milieu minimal contenant 13C-glucose et 15N-sodium nitrate et une solution d’oligo-éléments sont préparés séparément et ensuite mélangés avant utilisation.<ol>
<li>Préparer 100 mL de milieu minimal contenant des isotopes comme indiqué au tableau 1. Ajuster le pH à 6,6 à l’aide de NaOH (1 M) ou une solution de HCl (1M).</li>
			<li>Stériliser le milieu minimal pendant 25 min à 121 ° C.</li>
			<li>Préparation de 100 mL (1, 000 x) de solution d’oligo-éléments, dissoudre les sels énumérés au tableau 2 de l’eau distillée. Autoclave la solution pendant 25 min à 134 ° C. Refroidir et conserver la solution à 4 ° C pour une utilisation à court terme. Le pH sera environ 6,5 et peut être vérifié à l’aide d’un pH-mètre.</li>
			<li>Ajouter 0,1 mL de solution d’oligo-éléments pour 100 mL de 13C, un milieu minimal marqué N 15figurant au tableau 2 avant utilisation.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Croissance des matériaux fongiques<ol>
<li>Transférer une petite quantité de champignons du stockage sur une plaque de la DPJ en utilisant une boucle inoculer dans une hotte à flux laminaire. Conserver la culture à 30 ° C pendant 2 jours dans un incubateur.</li>
		<li>Une boucle d’inoculation permet de transférer un actif bord fongique croissant aux 13C, solution de marquage N15sous une hotte à flux laminaire. Conserver la culture à 30 ° C pendant 3 à 5 jours à 220 tr/min dans un incubateur à agitation.</li>
		<li>Centrifuger à 4 000 x g pendant 20 min. Retirez le surnageant et recueillir le culot.</li>
		<li>Utiliser une pince pour collecter ~0.5 g de granulés bien hydratée (> 50 % d’hydratation wt) pour les études de RMN. Perte d’hydratation à n’importe quel point s’aggravera considérablement la résolution spectrale. Remarque : Si nécessaire, une petite quantité (0,1 g) des mycéliums hydratés peut être séparée et complètement desséchée sous flux de gaz N2 dans une hotte ou un lyophilisateur pour estimer le niveau d’hydratation et de calculer le pourcentage en masse sèche. Généralement, un culot contenant ~0.3 g masse sèche peut être obtenue après 3 jours. Si l’expérience de NMR à effectuer est long (> 7 jours) ou si l’état des champignons doit être fixée, le matériel fongique peut être profondément figé en liquide N2 pour 10-20 min avant traitement ultérieur. Si l’expérience sera courte (3 à 6 jours), le gel peut être ignoré alors que l’échantillon peut rester fraîche.</li>
		<li>Mélanger le matériau excédentaire avec 20 % (v/v) de glycérol dans un tube à centrifuger et gardez-le dans un congélateur à-80 ᵒC pour le stockage à long terme.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Elaboration d’a. fumigatus pour Solid-State NMR et études de DNP
<ol><li>Préparation d’a. fumigatus pour des expériences RMN à l’état solide<ol>
<li>Dialyser le 13C, 15N-étiqueté fongiques échantillon (étape 1.2.4.) contre 1 L de tampon de phosphate de 10 mM (pH 7,0) à 4 ° C à l’aide d’un sac de dialyse dont le poids moléculaire kDa 3.5 coupure pour enlever les petites molécules depuis le milieu de culture pour une durée totale de 3 jours. Changer le tampon deux fois par jour. Remarque : Par ailleurs, l’échantillon pourrait être lavé pour 6 à 10 fois à l’aide de l’eau déionisée pour enlever les résidus petites molécules.</li>
		<li>Transférer l’échantillon dans un tube de 15 mL et centrifuger pendant 5 min (10 000 x g) à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse. Retirer le surnageant et récupérer le matériel fongique restant.</li>
		<li>Pack de 70-80 mg de l’uniforme 13échantillon C marqué et bien hydratée collez dans un ZrO2 rotor de 4 mm ou 30-50 mg à rotors de 3,2 mm pour des expériences RMN. Répétitivement squeeze l’échantillon délicatement à l’aide d’une tige de métal et absorber l’excès d’eau à l’aide de papier.</li>
		<li>Fermement, cap rotor et introduire l’échantillon dans le spectromètre pour la caractérisation de NMR à l’état solide. Remarque : Les rotors flambant neufs sont suggérées pour réduire les risques d’écrasement de rotor et les exemples de déversement dans le spectromètre RMN. Si nécessaire, un insert jetable de Kel-F avec vis d’étanchéité peut être utilisé pour servir de conteneur secondaire à l’intérieur du rotor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation des échantillons d’a. fumigatus pour expériences DNP<ol>
<li>Préparer 100 µL de DNP solvants29,44 (également connu sous le nom la matrice DNP) dans un tube de microtubes de 1,5 mL pour 13C,15N marquée des échantillons fongiques. Cette matrice DNP contient un mélange de d8-glycérol/D2O/H2O (30/60/10 % en volume). NOTE : Si non étiquetées échantillons doivent être analysés, puis préparer la matrice DNP utilisant 13appauvris en C d8-glycérol (12C3, 99,95 % ; D8, 98 %) et D2O et H2O pour éviter 13C signal contribution de solvants.</li>
		<li>Dissoudre 0,7 mg de AMUPol de45 à 100 µL de solvants DNP de solution-mère radical forme 10 mM. Vortex pour 2-3 min pour s’assurer que les radicaux sont entièrement dissous dans la solution.</li>
		<li>Faire tremper 10 mg des dialysés 13C, 15N-étiqueté fongiques matériaux tel que décrit dans les étapes antérieures (points 2.1.1 et 2.1.2) dans 50 µL de solution de AMUPol et légèrement hachez le mélange à l’aide d’un pilon et un mortier pour assurer une pénétration des radicaux dans les parois poreuses. Remarque : Pour réduire le taux de perte d’hydratation, le broyage peut également avoir lieu dans un tube de microcentrifuge à l’aide d’un micropestle.</li>
		<li>Ajouter un autre 30 µL de la solution radicale au culot broyé à l’hydrate davantage l’échantillon fongique.</li>
		<li>Emballer le culot dans un rotor de saphir de 3,2 mm, presser légèrement et retirer l’excès de solvant DNP. Ajouter une fiche de 3,2 mm silicone pour empêcher la perte d’hydratation. En général, 5 à 30 mg d’échantillon peuvent être transporté vers le rotor. La quantité exacte doit être déterminée par l’exigence de la sensibilité de l’expériences de RMN à effectuer.</li>
		<li>Insérer et lancer l’échantillon dans un spectromètre de DNP, mesurer un spectre DNP améliorée sous irradiation hyperfréquence et comparez-le avec le spectre micro-ondes-off. Cela conduira à une amélioration facteur εmarche/arrêt, qui devrait être de 20 à 40 pour ces matériaux complexes. Exécuter les expériences conçues pour déterminer la structure de la paroi cellulaire.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. préparation de la biomasse végétale pour la RMN et des études DNP
<ol><li>Préparation des matières végétales pour NMR à semi-conducteurs<ol>
<li>Produire uniformément 13plantes marquées C internes à l’aide de 13CO2 fournitures dans une chambre ou 13C-glucose milieu de croissance comme décrit plus haut46,47 ou acheter directement des matériaux marqués de sociétés de marquage isotopique. NOTE : 13C-glucose utilisable uniquement en croissance sombre pour éviter l’introduction de 12C de la photosynthèse.</li>
		<li>Couper l’uniformément 13C marqué matériel végétal en petits morceaux (généralement 1-2 mm de dimension) à l’aide d’une lame de rasoir de laboratoire. Remarque : Selon le but, les parois des cellules extraites sont parfois utilisés pour la caractérisation structurale et les protocoles détaillés sont signalés dans les précédentes études21,46.</li>
		<li>Si l’échantillon a été préalablement séché, ajouter 100 µL d’eau à 30 mg de matières végétales dans un tube de microtubes de 1,5 mL, vortex, équilibrer à température ambiante pendant 1 jour. Centrifuger à 4 000 x g pendant 10 min et enlever l’excès d’eau à l’aide d’une pipette.</li>
		<li>Si l’échantillon n’était jamais séché à tout moment, directement utiliser l’échantillon sans autre traitement.</li>
		<li>Emballer le matériel végétal qui en résulte dans 3,2 mm ou 4 mm ZrO2 rotors pour des expériences RMN à l’état solide.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation des matières végétales pour études DNP<ol>
<li>Préparer 60 µL solution de 10 mM AMUPol radical comme étapes décrites 2.2.1 et 2.2.2.</li>
		<li>Couper l’uniformément 13C marqué matière végétale à être étudiés en petits morceaux (1-2 mm de dimension) à l’aide d’une lame de rasoir de laboratoire et peser 20 mg des matières végétales.</li>
		<li>Main-broyer les morceaux de plante en petites particules (~ 1-2 mm de la taille) à l’aide d’un mortier et un pilon. Les poudres finales ont un aspect homogène.</li>
		<li>Ajouter 40 µL de la solution mère de DNP préparées à l’étape précédente (étape 2.2.2) pour le matériel végétal et broyer légèrement pendant 5 min pour homogène mélange avec le radical.</li>
		<li>Ajouter un autre 20 µL de la solution mère à hydrater davantage le matériel végétal après broyage.</li>
		<li>Emballer l’échantillon de plante équilibrée dans un rotor de saphir de 3,2 mm pour des expériences DNP. Mettez une cheville de silicone pour éviter la perte d’hydratation.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. des expériences de RMN à l’état solide standard pour la caractérisation initiale des biomatériaux riches en glucides
Remarque : Un bref aperçu de l’expériences RMN est fourni dans cette section. Cependant, l’élucidation de la structure nécessite généralement une vaste expertise. Par conséquent, des efforts de collaboration avec les spectroscopistes NMR est recommandé.
<ol><li>Mesure 1D 13C Cross polarisation (CP), 13polarisation directe C (DP) avec 2 s et 35-s recycler les retards et 1H -13C INEPTE48,49 spectra afin d’obtenir une compréhension générale de la dynamique distribution de composants cellulaires (Figure 1 a). Les parois cellulaires sont en général la partie relativement rigide et pièce dominantes signaux dans le spectre de CP.</li>
	<li>Mesurer une série d’expériences de corrélation 2D standard 13C -13C pour les affectations de résonance des signaux 13C. Commencez par recentré insuffisante50,51 pour obtenir la connectivité de carbone, qui ont besoin d’être assisté par une série d’expériences à travers l’espace comme 1,5-ms RFDR52 (Figure 1 b) et cordon de 50 ms/DARR53 des expériences. Remarque : Si il est intéressant de trouver un échantillon riche en un composant spécifique, par exemple, le primaire ou secondaire parois, puis plusieurs segments ou plusieurs usines devrez peut-être être mesuré séparément pour rechercher l’exemple avec la composition optimale.</li>
	<li>Mener des expériences de corrélation 2D 15N -13C qui peuvent être mesurées pour faciliter les affectations de résonance des protéines et des glucides azotées. Remarque : La cession de résonance est en général beaucoup de temps. Une méthode est actuellement développée pour faciliter la cession de la résonance des signaux de glucides pour les scientifiques sans expérience préalable.</li>
	<li>Mesurer les expériences plus spécialisés pour déterminer les proximités spatiales (Figure 1 c, d), l’hydratation et la mobilités des biomolécules complexes pour déterminer la structure tridimensionnelle des matières riches en glucides comme systématiquement décrits précédemment22,29.</li>
</ol>

Nous n’avons rien à divulguer.

Comparé à des méthodes biochimiques, NMR à semi-conducteurs a des avantages comme une technique non destructive et haute résolution. RMN est également quantitative à l’analyse de la composition, et contrairement à la plupart des autres méthodes analytiques, ne fait pas ont les incertitudes introduites par la solubilité limitée de biopolymères. Mise en place du protocole actuel facilite les études futures sur les riches en glucides de biomatériaux et polymères fonctionnalisés. Toutefois, il est à noter que l’analyse de do...

Glucides jouent un rôle central dans divers processus biologiques tels que le stockage de l’énergie, renforcement structurel et reconnaissance cellulaire et adhérence. Ils sont enrichis dans la paroi cellulaire, qui est une composante fondamentale dans les plantes, les champignons, les algues et les bactéries1,2,3. La paroi cellulaire est une source centrale pour la production de biocarburants et de biomatériaux, mais aussi une cible prometteuse pour des thérapies antimicrobiennes4,5,6,7,8 , 9.
La compréhension contemporaine de ces matériaux complexes a été considérablement avancée par des décennies d’efforts qui ont été consacrées à la caractérisation à l’aide de quatre méthodes biochimiques ou génétiques importants. La première méthode majeure s’appuie sur des traitements séquentiels à l’aide de produits chimiques agressifs ou enzymes pour briser les parois cellulaires en différentes portions, qui est suivie par la composition et l’analyse de liaison de sucres dans chaque fraction de10. Cette méthode apporte un éclairage sur la répartition du domaine des polymères, mais l’interprétation peut prêter à confusion en raison des propriétés chimiques et physiques des biomolécules. Par exemple, il est difficile de déterminer si la fraction extractible à l’alcali provient d’un domaine unique de molécules moins structurées ou de molécules séparées dans l’espace avec la solubilité comparable. Deuxièmement, les parties extraites ou toute les parois cellulaires peut également être mesurées à l’aide de solution NMR pour déterminer les liaisons covalentes, aussi appelées réticulation, entre les différentes molécules11,12,13, 14,,15. De cette façon, la structure détaillée des ancres covalentes peut être sondée, mais limites peuvent exister en raison de la faible solubilité de polysaccharides, le relativement petit nombre de sites de réticulation et l’ignorance des effets non covalentes qui stabilise emballage de polysaccharide, y compris la liaison hydrogène, interaction électrostatique et force de van der Waals, enchevêtrement de polymère. Troisièmement, l’affinité de liaison a été déterminée in vitro à l’aide de polysaccharides isolées16,17,18,19, mais la purification procédures peuvent modifier considérablement la structure et les propriétés de ces biomolécules. Cette méthode échoue aussi à reproduire la déposition sophistiquée et l’assemblage des macromolécules après la biosynthèse. Enfin, le phénotype, de la morphologie cellulaire et de propriétés mécaniques des mutants génétiques dont la production atténuée certain composant de la paroi cellulaire hangar lumières sur les fonctions structurelles des polysaccharides, mais les preuves moléculaires plus est nécessaire pour combler ces observations macroscopiques avec la fonction ingénierie des protéines machineries20.
Les progrès récents dans l’élaboration et l’application de la spectroscopie RMN à l’état solide multidimensionnelle ont introduit une occasion unique pour résoudre ces casse-tête structurel. Expériences de RMN à l’état solide 2D/3D permettent une enquête à haute résolution de la composition et l’architecture de matériaux riches en hydrates de carbone à l’état natif sans perturbation majeure. Des études structurales ont été menées avec succès à la fois primaire et parois secondaires des plantes, la biomasse catalytiquement traitée, biofilm bactérien, le pigment fantômes chez les champignons et récemment par les auteurs, les parois des cellules intactes dans un champignon pathogène Aspergillus fumigatus 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31. le développement de polarisation nucléaire dynamique (DNP)32,33,34,35,36,,du3738 , 39 , 40 , 41 , 42 facilite considérablement l’élucidation de la structure NMR comme l’accroissement de la sensibilité par DNP nettement réduit le temps expérimental sur ces biomatériaux complexes. Le protocole décrit ici en détail les procédures de marquage isotopique du champignon a. fumigatus et préparation fongique et des échantillons de végétaux pour la caractérisation de DNP et RMN à l’état solide. Procédures d’étiquetage similaires devraient s’appliquer aux autres champignons avec milieu modifié, et les procédures de préparation d’échantillon devraient être généralement applicables aux autres biomatériaux riches en glucides.

<table><tbody><tr><td>Ammonium Molybdate Tétrahydraté</td><td>Acros Organics</td><td>12054-85-2</td><td></td></tr><tr><td>AMUPol</td><td>Cortecnet</td><td>C010P002</td><td></td></tr><tr><td>Balance analytique</td><td>Ohaus</td><td>B730439218</td><td>Modèle PA84C</td></tr><tr><td>Bioclave 16 L</td><td>VWR</td><td>470230-598</td><td></td></tr><tr><td>Cabinet de biosécurité</td><td>Labconco corporation</td><td>302319100</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>VWR</td><td>BDH9222</td><td>magasin à 15-30 &deg ; C</td></tr><tr><td>Chlorure de cobalt (II) hexahydraté</td><td>Honeywell |Fluka</td><td>60820</td><td>&ge ; 98 %</td></tr> <tr><td>Sulfate de cuivre(II) pentahydraté</td><td>BDH</td><td>BDH9312</td><td>&ge ; 98 %</td></tr><tr><td>Incubateur à secousses Corning LSE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7202152</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151882</td><td>99,9 atomes % D</td></tr><tr><td>d6-DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151874</td><td>99,9 atomes % D</td></tr><tr><td>d8-glycérol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447498</td><td>&ge ; 99 atomes % D</td></tr><tr><td>Tube de dialyse 3,2 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2272</td><td>132724</td></tr><tr><td>Phosphate dipotassique</td><td>VWR</td><td>BDH9266</td><td>&ge ; 98 %</td></tr> <tr><td>Glycérol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>&ge ; 99.5 %</td></tr><tr><td>Heraus Megafuge 16R Centrifugeuse</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>750004271</td><td>Maximum RCF 25 830 x g</td></tr><tr><td>HR-MAS Kit d’insertion jetable</td><td>Bruker</td><td>B4493</td><td>Kel-F</td></tr><tr><td>Sulfate de fer(II) Heptahydrate</td><td>Alfa Aesar</td><td>14498</td><td>&ge ; 99+ %</td></tr> <tr><td>de sulfate de magnésium heptahydraté</td><td>VWR</td><td>10034998</td><td>stocker à 18-26 &deg ; C</td></tr><tr><td>Chlorure de manganèse(II) tétrahydraté</td><td>Alfa Aesar</td><td>11563</td><td>&ge ; 99 %</td></tr> <tr><td>Phosphate monopotassique</td><td>VWR</td><td>470302-254</td><td>&ge ; 99 %</td></tr><tr><td>pH-mètre</td><td>Mettler Toledo</td><td>B706689216</td><td></td></tr><tr><td>Tétrasodium Ethylènediaminetétraacétate</td><td>Acros Organics</td><td>13235-36-9</td><td>&ge ; 99,5 %</td></tr> <tr><td>Sulfate de zinc heptahydraté</td><td>Alfa Aesar</td><td>33399</td><td>&ge ; 98 %</td></tr><tr><td>12C3, d8-glycérol</td><td>Laboratoire d’isotopes de Cambridge</td><td>CDLM-8660</td><td>12C3, 99,95 %; D8, 98 %</td></tr><tr><td>13C6-glucose</td><td>Sigma Alrdrich</td><td>364606</td><td>&ge ; 99 % (CP)</td></tr><tr><td>15N-nitrate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>364606</td><td>&ge ; 98 % 15N, &ge ; 99 (cp)</td></tr><tr><td>Rotor RMN saphir 3,2 mm</td><td>Cortecnet</td><td>B6939</td><td></td></tr><tr><td>Bouchon silicone 3,2 mm</td><td>Bruker</td><td>B7089</td><td></td></tr><tr><td>Kit rotor MAS 4 mm</td><td>Bruker</td><td>H14355</td><td>Zircone</td></tr></tbody></table>

préparation de champignons et de matières végétales pour l’élucidation de la structure dynamique de polarisation nucléaire rmn à l’état solide

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

Ce protocole montre comment uniformément 13C, 15N-étiqueté fongiques matériaux peuvent être produites et comment ces matériaux souples devrait être traitée pour la RMN à l’état solide et DNP sensibilité améliorée des expériences. La procédure de traitement des échantillons de la biomasse végétale est aussi détaillée. Cette méthode permet la mesure d’une série de 1D et 2D 13C -13C /15N des spectres de corrélations, qui permet l’élucidation de la structure à haute résolution des biomatériaux complexes dans leur état natif, avec une perturbation minimale. Le marquage isotopique peut être examiné en quantifiant l’intensité dans les spectres de 1D et l’efficacité de transfert de polarisation dans les spectres de corrélation 2D. Le succès de la préparation d’échantillons de polarisation nucléaire dynamique (DNP) peut être évalué par le facteur de mise en valeur de sensibilité. D’autres expériences examinant les aspects structurels des polysaccharides et protéines conduira à un modèle de l’architecture en trois dimensions. Ces méthodes peuvent être modifiés et adaptés afin d’étudier un large éventail de matériaux riches en glucides, y compris les parois naturelles des plantes, des champignons, des algues et des bactéries, ainsi que de synthèse ou conçu de polymères glucidiques et leur complexe avec d’autres molécules.

L’isotope labeling sensiblement augmente la sensibilité de NMR et rend possible pour mesurer une série de 2D 13C -13C et spectres de corrélation15N 13C - d’analyser la composition, l’hydratation, la mobilité et de l’emballage de polymères, qui seront intégrés à construire un modèle tridimensionnel de l’architecture de la paroi cellulaire (Figure 1). Si l’étiquetage uniforme réussit, un ensemble complet de 1D 13...

Un protocole pour la préparation de 13C,15échantillons fongiques et plantes marquées N pour la spectroscopie RMN à l’état solide multidimensionnelle et enquêtes de polarisation nucléaire dynamique (DNP) est présenté.

Préparation de champignons et de matières végétales pour l’élucidation de la structure dynamique de polarisation nucléaire RMN à l’état solide

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Ce protocole peut être utilisé pour préparer des matières fongiques et végétales pour la résonance magnétique nucléaire à l’état solide, ou NMR, et la polarisation nucléaire dynamique, ou DNP, des expériences pour la caractérisation complexe du biosystème. Cette technique nous permet d’étudier les biomatériaux à un niveau de résolution atomique dans leur environnement naturel, par exemple, dans des cellules entières. L’acquisition d’informations structurelles à haute résolution sur les matières fongiques aidera au développement de médicaments antifongiques.La méthode donne un aperçu de la composition et de la structure des glucides complexes dans les parois fongiques des cellules et peut être appliquée à de nombreux organismes riches en glucides, y compris les plantes, les champignons, les algues et les bactéries. Certains chercheurs peuvent lutter contre la contamination fongique dans leurs cultures cellulaires. Mon conseil est de stériliser le milieu et l’équipement à fond avant de l’utiliser pour prévenir cette contamination.Cette démonstration aidera les chercheurs ayant peu d’expérience dans la NMR ou la culture cellulaire à apprendre à mettre en œuvre ces techniques dans les systèmes fongiques et végétaux. Pour préparer un milieu de croissance liquide non étiqueté, dissoudre 6,5 grammes d’extrait de levure peptone dextrose ou poudre ypd en 100 millilitres d’eau distillée, puis autoclave la solution résultante pendant 25 minutes à 134 degrés Celsius. Pour préparer un milieu de croissance solide non étiqueté, ajouter 6,5 grammes de poudre d’agar YPD à 100 millilitres d’eau distillée, et autoclave le milieu pendant 25 minutes à 121 degrés Celsius, avant de refroidir le milieu à environ 50 degrés Celsius.Ensuite, transférer 13 à 15 millilitres du milieu de croissance solide fondu dans des boîtes de Pétri en plastique stériles individuelles, et placer immédiatement les couvercles sur la vaisselle. Pour préparer le carbone-13, milieu de croissance liquide étiqueté azote-15, ajustez un volume de 100 millilitres de milieu minimal contenant des isotopes à un pH de 6,6 avec de l’acide ou de la base au besoin. Ensuite, dissoudre les sels énumérés dans le tableau en 100 millilitres d’eau distillée, ajouter au carbone-13, azote-15-étiqueté milieu de croissance liquide, et autoclave la solution résultante pendant 25 minutes à 121 degrés Celsius.Lorsque la solution s’est refroidie à température ambiante, ajouter 100 microlitres de solution d’oligo-éléments à l’ensemble du volume de carbone-13, azote-15-étiqueté milieu minimal. Pour cultiver les matériaux fongiques, utilisez une boucle inoculante pour transférer une petite quantité de champignons de stockage sur une plaque YPD, et la culture du champignon pendant deux jours dans un incubateur de 30 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, utilisez une nouvelle boucle d’inoculation pour transférer un bord fongique en croissance active vers le milieu de croissance liquide étiqueté carbone-13, azoté 15, et placez la culture à 30 degrés Celsius et 220 rotations par minute pendant trois à cinq jours dans un incubateur secouant.Lorsque de grandes quantités du champignon recouvrent le fond du flacon et flottent dans le liquide, recueillir les champignons par centrifugation et jeter le supernatant. Hydratez la pastille avec une solution appropriée, et utilisez des forceps pour recueillir environ 0,5 grammes de la pastille bien hydratée pour les analyses NMR et DNP. Ensuite, mélangez le reste du matériau avec une solution de glycérol à 20 % dans un tube conique et placez l’échantillon fongique à moins 80 degrés Celsius pour le stockage à long terme.Pour préparer l’A.fumigatus à l’analyse de la NMR à l’état solide, utilisez d’abord un sac de dialyse avec un seuil de poids moléculaire de 3,5 kilodaltons pour dialyser le tampon de phosphate de 0,5 gramme de carbone-13, échantillon fongique étiqueté azote-15 contre un litre de tampon de phosphate de 10 millimlaires à quatre degrés Celsius pendant trois jours pour éliminer les petites molécules du milieu de croissance. À la fin de la dialyse, transférer l’échantillon dans un tube de 15 millilitres pour centrifugation et emballer de 70 à 80 milligrammes de la pâte d’échantillon uniformément étiquetée au carbone 13 et bien hydratée dans un rotor de dioxyde de zirconium de quatre millimètres. Utilisez une tige métallique pour presser doucement et répétitivement l’échantillon, à l’aide de papier pour absorber l’excès d’eau.Ensuite, bien caler le rotor, et insérer l’échantillon dans le spectromètre pour la caractérisation NMR à l’état solide. Pour préparer l’A.fumigatus à l’analyse du DNP, ajoutez 100 microlitres de matrice DNP dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre par carbone-13, échantillon fongique étiqueté carbone-15, et dissolvez 0,7 milligramme d’agent polarisant à chaque tube pour former une solution de stock radical de 10 millimolaires. Après avoir vortexé pendant deux à trois minutes pour s’assurer que les radicaux sont complètement dissous dans la solution, tremper 10 milligrammes de carbone dialysé-13, l’azote-15 étiqueté échantillon fongique dans 50 microlitres de la solution agent polarisant, et utiliser un pilon et un mortier pour moudre légèrement le mélange pour assurer la pénétration des radicaux dans les parois cellulaires poreuses.Ajouter 30 microlitres supplémentaires de la solution radicale à la pastille au sol pour hydrater davantage l’échantillon fongique et emballer la pastille dans un rotor saphir de 3,2 millimètres. Presser légèrement et enlever l’excès de solvant DNP comme démontré, et ajouter un bouchon de silicone de 3,2 millimètres pour prévenir la perte d’hydratation. Ensuite, ajoutez le rotor à un spectromètre NMR pour une expérience de routine ou à un spectromètre DNP pour la mesure du spectre amélioré par DNP sous irradiation micro-ondes.Pour préparer les matériaux végétaux aux études sur le DNP, utilisez une lame de rasoir pour couper le matériau végétal uniformément étiqueté carbone-13 en morceaux d’un à deux millimètres. Utilisez un mortier et un pilon pour moudre les morceaux en particules plus petites jusqu’à ce que la poudre finale ait un aspect homogène. Ajouter 40 microlitres de solution de bouillon radical de 10 millimlaires au matériau végétal, et moudre légèrement l’échantillon pendant cinq minutes supplémentaires pour assurer un mélange homogène avec le radical.Hydratez l’échantillon au sol avec 20 autres microlitres de solution de stock radical, et emballez l’échantillon de plante équilibré dans un rotor saphir de 3,2 millimètres pour l’analyse DNP. Ensuite, insérez un bouchon en silicone pour éviter la perte d’hydratation et chargez l’échantillon sur le spectrophotomètre DNP. L’étiquetage isotopique améliore considérablement la sensibilité à la NMR et permet de mesurer une série de spectres de corrélation carbone-13-carbone-13 et carbone-13-azote-15 bidimensionnels pour analyser la composition, l’hydratation, la mobilité et l’emballage des polymères pour leur intégration pour la construction d’un modèle tridimensionnel d’architecture des paroi cellulaires.Si les signaux hors diagonale sont difficiles à obtenir dans le spectre 2D carbone-13-carbone-13, l’étiquetage statistique aurait pu se produire. Les deux pics de carbone-13 à 96 et 92 parties par million sont des signaux de carbone-1 signature de glucose. Par conséquent, leurs fortes intensités dans les spectres quantitatifs de polarisation directe carbone-13 mesurés avec de longs retards de recyclage de 35 secondes indiquent généralement la dominance des petites molécules en raison d’une dialyse ou d’un lavage incomplets.Avec des échantillons bien étiquetés, des corrélations à longue portée peuvent être mesurées davantage pour détecter les proximités spatiales des biomolécules et pour construire un modèle structurel des parois cellulaires intactes. Cette technique permet d’explorer la fonction de structure de nombreux matériaux naturels et d’ingénierie, facilitant ainsi les études futures sur les biomatériaux riches en glucides et les polymères fonctionnalisés. Comme certains champignons peuvent causer une infection ou des maladies systématiques chez l’homme, assurez-vous de manipuler des matériaux fongiques dans un capot d’écoulement laminaire pour la protection et de minimiser l’exposition.

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