Préparation de champignons et de matières végétales pour l’élucidation de la structure dynamique de polarisation nucléaire RMN à l’état solide

Ce protocole peut être utilisé pour préparer des matières fongiques et végétales pour la résonance magnétique nucléaire à l’état solide, ou NMR, et la polarisation nucléaire dynamique, ou DNP, des expériences pour la caractérisation complexe du biosystème. Cette technique nous permet d’étudier les biomatériaux à un niveau de résolution atomique dans leur environnement naturel, par exemple, dans des cellules entières. L’acquisition d’informations structurelles à haute résolution sur les matières fongiques aidera au développement de médicaments antifongiques.

La méthode donne un aperçu de la composition et de la structure des glucides complexes dans les parois fongiques des cellules et peut être appliquée à de nombreux organismes riches en glucides, y compris les plantes, les champignons, les algues et les bactéries. Certains chercheurs peuvent lutter contre la contamination fongique dans leurs cultures cellulaires. Mon conseil est de stériliser le milieu et l’équipement à fond avant de l’utiliser pour prévenir cette contamination.

Cette démonstration aidera les chercheurs ayant peu d’expérience dans la NMR ou la culture cellulaire à apprendre à mettre en œuvre ces techniques dans les systèmes fongiques et végétaux. Pour préparer un milieu de croissance liquide non étiqueté, dissoudre 6,5 grammes d’extrait de levure peptone dextrose ou poudre ypd en 100 millilitres d’eau distillée, puis autoclave la solution résultante pendant 25 minutes à 134 degrés Celsius. Pour préparer un milieu de croissance solide non étiqueté, ajouter 6,5 grammes de poudre d’agar YPD à 100 millilitres d’eau distillée, et autoclave le milieu pendant 25 minutes à 121 degrés Celsius, avant de refroidir le milieu à environ 50 degrés Celsius.

Ensuite, transférer 13 à 15 millilitres du milieu de croissance solide fondu dans des boîtes de Pétri en plastique stériles individuelles, et placer immédiatement les couvercles sur la vaisselle. Pour préparer le carbone-13, milieu de croissance liquide étiqueté azote-15, ajustez un volume de 100 millilitres de milieu minimal contenant des isotopes à un pH de 6,6 avec de l’acide ou de la base au besoin. Ensuite, dissoudre les sels énumérés dans le tableau en 100 millilitres d’eau distillée, ajouter au carbone-13, azote-15-étiqueté milieu de croissance liquide, et autoclave la solution résultante pendant 25 minutes à 121 degrés Celsius.

Lorsque la solution s’est refroidie à température ambiante, ajouter 100 microlitres de solution d’oligo-éléments à l’ensemble du volume de carbone-13, azote-15-étiqueté milieu minimal. Pour cultiver les matériaux fongiques, utilisez une boucle inoculante pour transférer une petite quantité de champignons de stockage sur une plaque YPD, et la culture du champignon pendant deux jours dans un incubateur de 30 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, utilisez une nouvelle boucle d’inoculation pour transférer un bord fongique en croissance active vers le milieu de croissance liquide étiqueté carbone-13, azoté 15, et placez la culture à 30 degrés Celsius et 220 rotations par minute pendant trois à cinq jours dans un incubateur secouant.

Lorsque de grandes quantités du champignon recouvrent le fond du flacon et flottent dans le liquide, recueillir les champignons par centrifugation et jeter le supernatant. Hydratez la pastille avec une solution appropriée, et utilisez des forceps pour recueillir environ 0,5 grammes de la pastille bien hydratée pour les analyses NMR et DNP. Ensuite, mélangez le reste du matériau avec une solution de glycérol à 20 % dans un tube conique et placez l’échantillon fongique à moins 80 degrés Celsius pour le stockage à long terme.

Pour préparer l’A.fumigatus à l’analyse de la NMR à l’état solide, utilisez d’abord un sac de dialyse avec un seuil de poids moléculaire de 3,5 kilodaltons pour dialyser le tampon de phosphate de 0,5 gramme de carbone-13, échantillon fongique étiqueté azote-15 contre un litre de tampon de phosphate de 10 millimlaires à quatre degrés Celsius pendant trois jours pour éliminer les petites molécules du milieu de croissance. À la fin de la dialyse, transférer l’échantillon dans un tube de 15 millilitres pour centrifugation et emballer de 70 à 80 milligrammes de la pâte d’échantillon uniformément étiquetée au carbone 13 et bien hydratée dans un rotor de dioxyde de zirconium de quatre millimètres. Utilisez une tige métallique pour presser doucement et répétitivement l’échantillon, à l’aide de papier pour absorber l’excès d’eau.

Ensuite, bien caler le rotor, et insérer l’échantillon dans le spectromètre pour la caractérisation NMR à l’état solide. Pour préparer l’A.fumigatus à l’analyse du DNP, ajoutez 100 microlitres de matrice DNP dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre par carbone-13, échantillon fongique étiqueté carbone-15, et dissolvez 0,7 milligramme d’agent polarisant à chaque tube pour former une solution de stock radical de 10 millimolaires. Après avoir vortexé pendant deux à trois minutes pour s’assurer que les radicaux sont complètement dissous dans la solution, tremper 10 milligrammes de carbone dialysé-13, l’azote-15 étiqueté échantillon fongique dans 50 microlitres de la solution agent polarisant, et utiliser un pilon et un mortier pour moudre légèrement le mélange pour assurer la pénétration des radicaux dans les parois cellulaires poreuses.

Ajouter 30 microlitres supplémentaires de la solution radicale à la pastille au sol pour hydrater davantage l’échantillon fongique et emballer la pastille dans un rotor saphir de 3,2 millimètres. Presser légèrement et enlever l’excès de solvant DNP comme démontré, et ajouter un bouchon de silicone de 3,2 millimètres pour prévenir la perte d’hydratation. Ensuite, ajoutez le rotor à un spectromètre NMR pour une expérience de routine ou à un spectromètre DNP pour la mesure du spectre amélioré par DNP sous irradiation micro-ondes.

Pour préparer les matériaux végétaux aux études sur le DNP, utilisez une lame de rasoir pour couper le matériau végétal uniformément étiqueté carbone-13 en morceaux d’un à deux millimètres. Utilisez un mortier et un pilon pour moudre les morceaux en particules plus petites jusqu’à ce que la poudre finale ait un aspect homogène. Ajouter 40 microlitres de solution de bouillon radical de 10 millimlaires au matériau végétal, et moudre légèrement l’échantillon pendant cinq minutes supplémentaires pour assurer un mélange homogène avec le radical.

Hydratez l’échantillon au sol avec 20 autres microlitres de solution de stock radical, et emballez l’échantillon de plante équilibré dans un rotor saphir de 3,2 millimètres pour l’analyse DNP. Ensuite, insérez un bouchon en silicone pour éviter la perte d’hydratation et chargez l’échantillon sur le spectrophotomètre DNP. L’étiquetage isotopique améliore considérablement la sensibilité à la NMR et permet de mesurer une série de spectres de corrélation carbone-13-carbone-13 et carbone-13-azote-15 bidimensionnels pour analyser la composition, l’hydratation, la mobilité et l’emballage des polymères pour leur intégration pour la construction d’un modèle tridimensionnel d’architecture des paroi cellulaires.

Si les signaux hors diagonale sont difficiles à obtenir dans le spectre 2D carbone-13-carbone-13, l’étiquetage statistique aurait pu se produire. Les deux pics de carbone-13 à 96 et 92 parties par million sont des signaux de carbone-1 signature de glucose. Par conséquent, leurs fortes intensités dans les spectres quantitatifs de polarisation directe carbone-13 mesurés avec de longs retards de recyclage de 35 secondes indiquent généralement la dominance des petites molécules en raison d’une dialyse ou d’un lavage incomplets.

Avec des échantillons bien étiquetés, des corrélations à longue portée peuvent être mesurées davantage pour détecter les proximités spatiales des biomolécules et pour construire un modèle structurel des parois cellulaires intactes. Cette technique permet d’explorer la fonction de structure de nombreux matériaux naturels et d’ingénierie, facilitant ainsi les études futures sur les biomatériaux riches en glucides et les polymères fonctionnalisés. Comme certains champignons peuvent causer une infection ou des maladies systématiques chez l’homme, assurez-vous de manipuler des matériaux fongiques dans un capot d’écoulement laminaire pour la protection et de minimiser l’exposition.