Name: Expression transitoire dans la betterave rouge de biopharmaceutique candidat vaccin contre le diabète de Type 1 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Découvrez la transformation transitoire de feuilles de betterave rouge pour produire un vaccin oral candidat contre le diabète de type 1. Cette méthode permet d'obtenir des rendements élevés de protéines recombinantes pour l'induction de tolérance orale.

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Ce travail a été soutenu par le projet commun « L’utilisation des plantes pour la production d’un vaccin comestible de diabète auto-immun (eDIVA) » (projet ID : 891854) financé par l’Université de Vérone, dans le cadre de l’appel de 2014.

<ol><li>Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edible+plants+for+oral+delivery+of+biopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).</li>
<li>Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+recombinant+protein+production+in+different+biofactories%3A+The+green+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective.</a> BioMed Research International. , (2014).</li>
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<li>Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Agrobacterium+tumefaciens-mediated+transfection+of+viral+replicons+for+efficient+transient+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants.</a> Nature Biotechnology. 23, (2005).</li>
<li>Ludvigsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+treatment+of+type+1+diabetes+in+childhood%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pediatric+Reviews%22%5BJournal%5D)">Update on treatment of type 1 diabetes in childhood.</a> Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).</li>
<li>Merlin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+GAD65+production+in+plants+using+the+MagnICON+transient+expression+system%3A+Optimization+of+upstream+production+and+downstream+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing.</a> Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).</li>
<li>Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+Analysis+of+Recombinant+Protein+Expression+in+Different+Biofactories%3A+Bacteria%2C+Insect+Cells+and+Plant+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems.</a> Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).</li>
<li>Dal Santo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+terroir+concept+interpreted+through+grape+berry+metabolomics+and+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics.</a> Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agroinfiltration+as+an+effective+and+scalable+strategy+of+gene+delivery+for+production+of+pharmaceutical+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Techniques+in+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins.</a> Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).</li>
<li>Bertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+type-1+diabetes+vaccine+candidate+using+edible+plants+expressing+a+major+autoantigen%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen.</a> Frontiers in Plant Science. 9, Article 572 (2018).</li>
<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+in+planta+expression+of+the+human+islet+autoantigen+glutamic+acid+decarboxylase+%28GAD65%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65).</a> Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).</li>
<li>Sepúlveda-Jiménez, G., Rueda-Benítez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red+beet+%28Beta+vulgaris%29+UDP-glucosyltransferase+gene+induced+by+wounding%2C+bacterial+infiltration+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress.</a> Journal of Experimental Botany. 56, jxb/eri036 (2005).</li>
<li>Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+for+enhancing+oral+bioavailability+of+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins.</a> International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).</li>
<li>Mustafa, A. Z. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction. , Available from:
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<li>Kamei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexation+hydrogels+for+intestinal+delivery+of+interferon+beta+and+calcitonin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin.</a> Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).</li>
<li>Tuesca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexation+hydrogels+for+oral+insulin+delivery%3A+effects+of+polymer+dosing+on+in+vivo+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).</li>
<li>Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+yield+of+recombinant+pharmaceutical+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants.</a> Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).</li>
<li>Dhama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-based+oral+vaccines+for+human+and+animal+pathogens+%E2%80%93+a+new+era+of+prophylaxis%3A+current+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology+and+Agricultural+Sciences%22%5BJournal%5D)">Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens – a new era of prophylaxis: current and future perspectives.</a> Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447 (0), 75-93 (2013).</li>
<li>Hefferon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconceptualizing+cancer+immunotherapy+based+on+plant+production+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Future+science%22%5BJournal%5D)">Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems.</a> Future science. O3, FSO217 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans cette étude, nous avons montré une analyse préliminaire pour la conception d’un candidat-vaccin oral pour diabète auto-immun. La protéine cible pour cette expérience a été une forme mutante de l’humain 65 kDa Glutamate Décarboxylase, dont la production et la fonctionnalité sont facilement détectable et mesurable12. Son expression dans des tissus différents végétaux comestibles a été véhiculée par les vecteurs5, qui véhiculent un haut niveau de production de protéines r...

Depuis la révolution de la biologie moléculaire végétale dans les années 1980, les systèmes à base de plantes pour la fabrication de produits biopharmaceutiques peuvent être considérés comme une alternative aux systèmes traditionnels basés sur des cellules microbiennes et mammifères1. Plantes affichent plusieurs avantages sur les plateformes traditionnelles, avec l’évolutivité, de rentabilité et de sécurité étant les plus pertinents2. Le produit recombinant peut être purifié à partir de tissus végétaux transformés et ensuite administré, soit par voie parentérale ou par voie orale et, en outre, plante comestible transformée peut être utilisé directement pour administration par voie orale. Voie orale favorise simultanément l’immunité muqueuse et systémique, et il élimine le besoin d’aiguilles et de personnel médical spécialisé. En outre, prestation orale élimine le traitement complexe en aval, qui représente normalement 80 % du coût total de fabrication d’une protéine recombinante3. Tous ces avantages peuvent se traduire par des économies dans la production, des fournitures et du travail en réduisant les coûts de chaque dose, rendant la drogue abordables pour la plupart de la population mondiale.
Plusieurs stratégies, tant pour la transformation stable et expression transitoire, ont été développés pour la production de protéines recombinantes dans des plantes. Parmi eux, un système d’expression de base de virus de plante déconstruite à haut rendement (p. ex., magnICON) offre des performances supérieures entraînant des rendements élevés de protéines recombinantes des échelles de temps relativement court,4. Beaucoup d’exemples d’expression transitoire dans le système d’expression de base de virus de plante Nicotiana benthamiana plants est signalés, étant l’hôte de production de l’étalon-or. Cependant, cette plante de modèle n’est pas considérée comme une espèce comestible en raison des alcaloïdes et d’autres métabolites toxiques qui sont accumulent dans ses feuilles.
Dans ce travail, nous décrivons la comparaison entre deux systèmes de plantes comestibles, betterave rouge (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) et épinards (Spinacea oleracea cv Industria), pour l’expression de deux formes de candidat de l’isoforme 65 kDa de l’acide glutamique décarboxylase (GAD65), réalisée par l’usine base de virus vecteurs5. GAD65 est un auto-antigène majeur lié au diabète de Type 1 (T1D) et il est actuellement sous enquête dans des essais cliniques humains pour prévenir ou retarder T1D en induisant la tolérance6. La production de GAD65 chez les plantes a été étudiée chez les espèces de plantes modèle Nicotiana tabacum et N. benthamiana4,5,6,7. Nous décrivons ici l’utilisation d’espèces végétales comestibles pour la production de la molécule dans les tissus qui peut être signifié pour une livraison directe par voie orale. D’un point de vue technique, nous avons étudié et sélectionné le système plante agroinfiltration et la plate-forme de plantes comestibles pour la production de GAD65 en évaluant les différents paramètres : les niveaux de l’expression de protéine recombinante, la charge microbienne résiduelle en usine tissu destiné à l’administration orale, la résistance de GAD65 à la digestion gastrique et la bioéquivalence des plantes transformées avec le type sauvage.

<table><tbody><tr><td>0,2-&mu ; m Minisart RC4 filtres à membrane</td><td>Sartorius-Stedim</td><td>17764</td><td></td></tr><tr><td>2&ndash ; mercaptoéthanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>Toxique ; 4 % pour fabriquer un tampon de charge avec du glycérol, du SDS et du Tris-HCl</td></tr><tr><td>4-Acide morpholinéthanesulfonique (MES)</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td>pH 5,5</td></tr><tr><td>Plaque à 96 puits</td><td>Sarstedt</td><td>833924</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Sigma</td><td>27221</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile corrosif LC-MS grade</td><td>Sigma</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>Acétosyringone</td><td>Sigma</td><td>D134406</td><td>Toxique &ndash ; 0,1 M stock dans DMSO</td></tr><tr><td>Agar Bacteriological Grade</td><td>Applichem</td><td>A0949</td><td>15 g/L pour fabriquer un milieu LB (pH 7,5 avec NaOH) avec extrait de levure, NaCl et Tryptone</td></tr><tr><td>Ammonium</td><td>formate Sigma</td><td>70221</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-eGFP</td><td>ABCam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-GAD 65/67</td><td>Sigma</td><td>G5163</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-LHCB2</td><td>Agrisera</td><td>AS01 003</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Blue R-250</td><td>Sigma</td><td>B7920</td><td></td></tr><tr><td>C18 Column</td><td>Grace</td><td>&nbsp ; &nbsp ; -</td><td>Alltima HP C18 (150 mm x 2,1 mm ; 3 &mu ; m) Colonne</td></tr><tr><td>C18 Colonne de garde</td><td>Grace</td><td>&nbsp ; &nbsp ; -</td><td>Alltima HP C18 (7,5 mm x 2,1 mm ; 5 &mu ; m) Garde Colonne</td></tr><tr><td>CalMag Grower</td><td>Peter Excel</td><td>15-5-15</td><td>Engrais</td></tr><tr><td>Carbenicilline disodique</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C0109</td><td>Système</td></tr><tr><td>d’imagerie par chimiluminescence</td> toxique <td>BioRad</td><td>1708370</td><td>ChemiDoc Système d’imagerie tactile</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Détergent</td><td>Sigma</td><td>P5927</td><td>Polysorbate 20</td></tr><tr><td>Lecteur de fluorescence</td><td>Perkin-Elmer</td><td>&nbsp ; 1420-011</td><td>VICTOR Multilabel Compteur</td></tr><tr><td>d’acide formique LC-MS grade</td><td>Sigma</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>15 % pour faire tampon de chargement avec Tris-HCl, SDS et 2&ndash ; mercaptoéthanol</td></tr><tr><td>GoTaq G2 polymérase</td><td>Promega</td><td>M7841</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td>Colonne</td></tr><tr><td>HILIC</td> corrosive <td>Grace</td><td>&nbsp ; &nbsp ; -</td><td>Ascentis Express HILIC (150 mm x 2,1 mm ; particules de taille 2,7 &mu ; m) Colonne</td></tr><tr><td>HILIC Guard Column Grace</td><td></td><td>&nbsp ; &nbsp ; -</td><td>Vision HT HILIC (7,5 mm x 2,1 mm ; 3 &mu ; m) Garde Colonne Anticorps</td></tr><tr><td>anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort (HRP)</td><td>Sigma</td><td>A6154</td><td>Ne pas congeler/décongeler trop de fois</td></tr><tr><td>HPLC Autosampler</td><td>Beckman Coulter</td><td>&nbsp ; &nbsp ; -</td><td>Système Gold 508 Échantillonneur automatique</td></tr><tr><td>Système HPLC</td><td>Beckman Coulter</td><td>&nbsp ; &nbsp ; -</td><td>System Gold 128 Module de solvant HPLC</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>24137</td><td>Sulfate</td></tr> de <tr><td>kanamycine</td> inflammable <td>Sigma</td><td>K4000</td><td>Toxique</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>2 g/L avec NaCl , Na2HPO4 et KH2PO4 pour faire</td></tr><tr><td>PBS KH2PO4 </td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td>2,4 g/L avec NaCl , Na2HPO4 et KCl pour fabriquer une solution PBS</td></tr><tr><td>Loading Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Ge Healthcare</td><td>RPN2232</td><td>Préparez la solution à l’aide du kit commercial ECL Prime Western Blotting System</td></tr><tr><td>Lyophilizator</td><td>5Pascal</td><td>LIO5P0000DGT</td><td></td></tr><tr><td>Mass Spectometer</td><td>Bruker Daltonics</td><td>&nbsp ; -</td><td>Bruker Esquire 6000 ; le spectromètre de masse était équipé d’une source ESI et l’analyseur était un piège à ions</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Solution de blocage du lait</td><td>Ristora</td><td>&nbsp ; &nbsp ; -</td><td>3 % dans le</td></tr><tr><td>PBS Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td>Utiliser avec NaH2PO4 pour faire un tampon de phospate de sodium</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>80 g/L avec KCl, Na2HPO4 et KH2PO4 pour faire du PBS ; 10 g/L pour faire du milieu LB (pH 7,5 avec NaOH) avec de l’extrait de levure, Tryptone et gélose de qualité bactériologique</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>&nbsp ; À utiliser avec du Na2HPO4 pour fabriquer un tampon de phospate de sodium ; 14,4 g/L pour fabriquer PBS</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Membrane nitrocellulase</td><td>Ge Healthcare</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin à partir de la muqueuse gastrique porcine</td><td>Sigma</td><td>P7000</td><td></td></tr><tr><td>Substrat de peroxydase ECL</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2235</td><td>Matériau sensible à la lumière</td></tr><tr><td>Pompe Presse à vide</td><td>VWR</td><td>111400000098</td><td></td></tr><tr><td>Réactif A</td><td>Sigma</td><td>B9643</td><td>Utilisez 50 parties de ce réactif avec 1 partie de réactif B pour préparer la solution de travail BCA</td></tr><tr><td>Réactif B</td><td>Sigma</td><td>B9643</td><td>Utilisez 1 partie de ce réactif avec 50 parties de réactif A pour préparer la solution de travail BCA</td></tr><tr><td>Rifampicine</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>R0146</td><td>Toxique &ndash ; 25 mg/mL stock dans DMSO</td></tr><tr><td>SDS (Sodium dodecyl sulfate)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>Inflammable, toxique, corrosif-10 % de stock ; 3 % pour faire un tampon de charge avec du Tris-HCl, du Glycérol et 2&ndash ; mercaptoéthanol</td></tr><tr><td>Métabisulfite de sodium</td><td>Sigma</td><td>7681-57-4</td><td></td></tr><tr><td>Système de sonicateur</td><td>Soltec</td><td>090.003.0003</td><td>Sonica&reg ; 2200 MH ; fréquence 40 khz</td></tr><tr><td>Seringue</td><td>Terumo</td><td>&nbsp ; &nbsp ; -</td><td></td></tr><tr><td>Transparent fixe 300-& micro ; Tubes en verre à insert en L</td><td>Thermo Scientific</td><td>11573680</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Ajustez le pH avec 1N HCl pour faire un tampon Tris-HCl, utilisez 1,5M Tris-HCl (pH 6,8) pour faire un tampon de chargement avec SDS, Glycérol et 2&ndash ; mercaptoéthanol</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Formedium</td><td>TRP03</td><td>10 g/L pour faire un milieu LB (pH 7,5 avec NaOH) avec extrait de levure, NaCl et gélose Concentrateur sous vide de qualité bactériologique</td></tr><tr><td></td><td>Heto</td><td>3878 F1-3</td><td>Système Speed-vac</td></tr><tr><td>Eau de qualité LC-MS</td><td>Sigma</td><td>39253</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Sigma</td><td>Y1333</td><td>5 g/L pour fabriquer un milieu LB (pH 7,5 avec NaOH) avec du tryptone, du NaCl et de la gélose de qualité bactériologique</td></tr></tbody></table>

expression transitoire dans la betterave rouge de biopharmaceutique candidat vaccin contre le diabète de type 1

Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes

Moléculture végétale est l’utilisation des plantes pour produire des molécules d’intérêt. Dans cette perspective, plantes peuvent servir aussi bien comme des bioréacteurs pour la production et la purification ultérieure du produit final et la livraison directe par voie orale de protéines hétérologues lors de l’utilisation des espèces de plantes comestibles. Dans ce travail, nous présentons le développement d’un vaccin oral contre le diabète de Type 1 (T1D) dans les systèmes de plantes comestibles en utilisant la technologie de base de virus recombinant DNA plante déconstruite, livrée avec infiltration sous vide. Nos résultats montrent que la betterave rouge est un hôte approprié pour l’expression transitoire d’un auto-antigène dérivée humaine associée à T1D, considéré comme un candidat prometteur comme vaccin T1D. Feuilles produisant l’auto-antigène ont été soigneusement caractérisés pour leur résistance à la digestion gastrique, la présence d’une charge bactérienne résiduelle et leur profil métabolique secondaire, ce qui donne une vue d’ensemble de la production de processus pour l’utilisation potentielle des plantes pour la prestation orale directe d’une protéine hétérologue. Notre analyse a montré une dégradation presque complète du vaccin oral candidat lyophilisés après une digestion gastrique simulée, ce qui suggère qu’il faut une stratégie d’encapsulation dans la fabrication du vaccin GAD végétale.

Dans ce travail, le flux de travail pour l’élaboration d’un vaccin oral dans les tissus végétaux comestibles est présenté. L’objectif de ce travail est l’expression d’une protéine cible dans une espèce de plante hôte comestibles et la caractérisation du potentiel vaccin oral.
La première étape consistait à l’évaluation de la pertinence de la technologie d’expression à base de virus de plante pour produire des protéines recombina...

Nous présentons ici un protocole pour produire un candidat vaccin oral contre le diabète de Type 1 dans une plante comestible.

Expression transitoire dans la betterave rouge de biopharmaceutique candidat vaccin contre le diabète de Type 1

Plant molecular farming is the use of plants to produce molecules of interest. In this perspective, plants may be used both as bioreactors for the ...

Parmi les différentes stratégies de production de protéines recombinantes dans les plantes, l’expression vers déconstruite à base de plantes offre des performances supérieures, conduisant à des rendements élevés sur une période relativement courte. La réplication de cette technologie pour la production d’un vaccin oral présente un grand potentiel pour devenir une alternative aux vaccins conventionnels dans un proche avenir. Les feuilles de betterave rouge lyophilisées transformées de façon transitoire accumulent une quantité d’antigènes photo adaptés à l’induction de tolérance orale dans la prévention du diabète de type 1.Ce protocole expérimental pourrait être étendu à de nombreuses espèces comestibles différentes après une évaluation au cas par cas de l’accumulation de protéines recombinantes. Edoardo Bertini, Mattia Santoni, Anna Cuccurullo et Roberta Zampieri feront la démonstration de la procédure. Pour commencer cette procédure, cultivez des plants de betteraves rouges et d’épinards dans une chambre de croissance tel que décrit dans le protocole du texte.Après la germination des graines, fertiliser les plantes deux fois par semaine avec une solution d’engrais disponible dans le commerce à une concentration d’un gramme par litre. Pour l’agroinfiltration, utilisez des épinards de cinq semaines et des betteraves rouges vieilles de six semaines. Après avoir construit les vecteurs d’expression végétale, inoculer les trois transformateurs A.tumefaciens en 50 millilitres de milieu LB contenant de la rifampicine à une concentration de 50 microgrammes par millilitre et d’antibiotiques spécifiques au vecteur tel que décrit dans le protocole textuel.Poussez en secouant pendant la nuit à 28 degrés Celsius. Le lendemain, pelleter les cultures bactériennes en centrifugant à 4500 fois G pendant 20 minutes. Resuspendez la pastille en 100 millilitres de tampon d’infiltration contenant 10 millimilliles de MES et 10 millimolaires de sulfate de magnésium.Incuber les suspensions à température ambiante pendant trois heures. Mélangez un volume égal d’une suspension bactérienne contenant l’un des modules présentés ici, avec le module cinq premiers et le module d’intégrase. À l’aide d’une seringue sans aiguille, sortir cinq millilitres du mélange de suspension.Appuyez sur le bout de la seringue contre le dessous de la feuille de plante tout en appliquant doucement contre la pression de l’autre côté de la feuille. Infiltrer les trois premières feuilles complètement élargies, à partir de l’apex, pour chaque plante. Étiquetez les feuilles agroinfiltrées avec l’étiquette en papier sur la tige de la feuille.Retournez ensuite les plantes à la chambre de croissance dans des conditions standard. Les jours quatre à 14 post-infection, recueillir les feuilles agroinfiltrées et les congeler dans de l’azote liquide. Conservez ce tissu végétaux à moins 80 degrés Celsius.Tout d’abord, cultivez séparément les trois transformateurs A.tumefaciens en 50 millilitres de moyenne LB contenant de la rifampicine à une concentration de 50 microlitres par millilitre, et des antibiotiques spécifiques aux vecteurs appropriés en secouant pendant la nuit à 28 degrés Celsius. Le lendemain, pelleter les cultures bactériennes en centrifugant à 4500 fois G pendant 20 minutes. Resuspendez la pastille dans 1 litre de tampon d’infiltration à un OD600 de 0,35, et incuber les suspensions à température ambiante pendant trois heures.Ajouter ensuite 0,01% du détergent à chaque suspension. Mélangez un volume égal d’une suspension bactérienne contenant l’un des modules présentés ici avec le module cinq premiers et le module d’intégrase. Insérez une betterave rouge de six semaines dans le support.Inversez le support et placez-le sur un bécher contenant deux litres d’un bain d’infiltration pour submerger les feuilles dans la suspension d’infiltration. Après cela, transférez le bain d’infiltration avec la plante submergée à la chambre d’infiltration et fermez-la. Allumez la pompe à vide et ouvrez la vanne d’admission sous vide sur la chambre d’infiltration.Une fois que la pression dans la chambre est tombée à 90 millibar, maintenir le vide pendant trois minutes. Relâchez ensuite le vide pendant 45 secondes. Lorsque la chambre est revenue à la pression atmosphérique, ouvrez la chambre et retirez la plante infiltrée du bain bactérien.Remettre l’usine dans la chambre de croissance. Le jour de l’expression maximale, récolter les feuilles infiltrées et les congeler dans de l’azote liquide comme décrit précédemment. Tout d’abord, récolter le delta agroinfiltré sous vide 87 GAD65mut exprimant les feuilles de betterave rouge au pic d’expression, et les congeler dans de l’azote liquide.Lyophiliser les feuilles gelées à moins 50 degrés Celsius et à 0,04 millibar pendant 72 heures. Rangez-les ensuite à moins 80 degrés Celsius. Lorsque vous êtes prêt à procéder, moudre les feuilles en poudre fine et les conserver à température ambiante dans un contenant scellé avec du gel de silice pour exclure l’humidité.Pour la simulation de digestion gastrique, pesez 100 milligrammes des feuilles de betterave rouge lyophilisés finement moulues et dépensez-les en six millilitres de PBS. Utilisez six acides chlorhydriques molaire pour ajuster le pH de l’échantillon à deux. Ajouter quatre milligrammes par millilitres de pepsine de muqueuse gastrique porcine, et 10 millimolaire d’acide chlorhydrique, pour obtenir une concentration finale de pepsine d’un milligramme par millilitre.Agiter l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 120 minutes. Ensuite, utilisez de l’hydroxyde de sodium pour ajuster le pH de l’échantillon à huit et inactiver la pepsine. Transférer 750 aliquots microlitres de chaque échantillon dans des tubes de microcentrifugeuse, et centrifuger les aliquots à 20 000 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.Recueillir chaque supernatant séparément, et resuspendre chaque granulé dans un volume supernatant de tampon de chargement. Ensuite, analyser à la fois le supernatant et la pastille résuspendée par l’analyse des taches occidentales. Pour l’analyse de l’intégrité cellulaire, préparez deux échantillons de 100 milligrammes des feuilles de betterave rouge lyophilisés finement moulues et résuspendez les deux en six millilitres de PBS.Utilisez six acides chlorhydriques molaire pour ajuster le pH d’un échantillon à deux. Agiter les deux échantillons à 37 degrés Celsius pendant 120 minutes. Puis aliquot 750 microlitres de chaque échantillon aux tubes de microcentrifugeuse.Centrifugeuse à 20 000 fois G et à 4 degrés Celsius pendant 20 minutes. Recueillir chaque supernatant séparément, et resuspendre chaque granulé dans un volume supernatant de tampon de chargement. Ensuite, analyser à la fois le supernatant et la pastille résuspendée par l’analyse des taches occidentales.Tout d’abord, pesez 100 milligrammes des feuilles de betterave rouge lyophilisés finement moulues et résépendez-les en huit millilitres de PBS stérile. Vortex pendant une minute. Plaquez un millilitre de chaque homogénéité de feuilles lyophilisés dans l’un des cinq supports LB sélectifs préparés.Incuber les plaques à 28 degrés Celsius pendant trois jours. Par la suite, comptez les colonies d’agrobactéries cultivées sur chaque plaque et calculez la charge bactérienne résiduelle comme le nombre d’unités de formation de colonies par millilitre de l’homogénéité lyophilisé des feuilles. Dans ce travail, un vaccin oral est développé dans les tissus végétaux comestibles.Les plants de betteraves rouges et d’épinards sont manuellement agroinfiltrés avec des suspensions d’A.tumefaciens porteurs de vecteurs d’expression recombinants EGFP, et l’expression des protéines fluorescentes est visualisée par l’analyse des taches occidentales et quantifiée sous la lumière UV. Le système de betteraves rouges se caractérise par une expression EGFP plus élevée, atteignant environ 544 microgrammes par gramme de poids des feuilles fraîches à neuf jours après l’infection, tandis que les épinards n’ont atteint qu’un niveau maximum d’environ 113,4 microgrammes par gramme de poids des feuilles fraîches sur 11 jours après l’infection. Pour cette raison, la betterave rouge est choisie comme hôte d’expression pour toutes les expériences ultérieures.Les plantes sont ensuite infiltrées sous vide avec une suspension A.tumefaciens. Après l’extraction du TSP à partir de feuilles d’agroinfiltration, les échantillons sont analysés par tache occidentale, et la protéine recombinante est relativement quantifiée par une analyse de densitométrie. Enfin, les paramètres de développement d’un vaccin oral potentiel sont évalués.Comme on le voit ici, la protéine cible est considérée comme stable après le processus de lyophilisation. La digestion gastrique est simulée en ajoutant l’enzyme gastrique porcine pepsine aux matériaux lyophilisés, soit à une concentration finale d’un milligramme par millilitre, soit à un rapport de un à 20, au TSP. Les deux conditions digestives de traitement ont comme conséquence la dégradation de la protéine recombinante.L’absence d’un signal spécifique dans les échantillons de granulés après la digestion de la pepsine suggère qu’après le gel-séchage, les cellules végétales ont perdu leur intégrité, ce qui a conduit à la dégradation des protéines cible. La procédure doit être soigneusement adaptée aux espèces végétales en ce qui concerne l’infiltration sous vide et à la protéine recombinante cible en ce qui concerne l’analyse du cours du temps. La procédure de démonstration pourrait également être utilisée pour la production de produits biopharmaceutiques destinés à l’accouchement oral, comme le vaccin et les anticorps.

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