Name: Gewebesammlung von Fledermäusen für -Omics Analysen und primäre Zellkultur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 31 s
Description: Lernen Sie humane Gewebesammlung von Fledermäusen für genomische, transkriptomische und proteomische Analysen sowie primäre Zellkultur. Dieses Protokoll maximiert molekulare Datenqualität bei minimalem Populationsimpact.

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Wir danken Centro de Ecologa y Biodiversidad CEBIO, Erika Paliza, Miluska Sénchez, Jorge Carrera, Edgar Rengifo Vésquez, Harold Porocarrero Zarria, Jorge Ruz Leveau, Jaime Pecheco Castillo, Carlos Tello, Fanny Cornejo und Fanny Fernandez Melo für die Herstellung von Gewebe Sammlung in Peru möglich. Wir danken auch allen Mitgliedern der Grupo Jaragua und Yolanda Leon für die Möglichkeit der Gewebesammlung in der Dominikanischen Republik, sowie Bernal Rodriguez Hernandez, Bernal Matarrita und allen in der Biologischen Forschungsstation La Selva in Costa Rica für die Herstellung von Probenahme möglich. Wir danken Ella Lattenkamp & Lutz Wiegrebe für den Zugang und die Mustersammlung von Flügelschlägen von Phyllostomus Verfärbung Fledermäuse für die Zellkultur-Generation. Phyllostomus Verfärbungfledermäuse stammen aus einer Zuchtkolonie im Fachbereich Biologie II der Ludwig-Maximilians-Universität München. Die Genehmigung zum Halten und Züchten der Fledermäuse wurde vom Landesveterinäramt München erteilt. LMD, SJR, KTJD und LRY wurden von NSF-DEB 1442142 finanziert. LMD wurde von NSF-DEB 1838273 finanziert. LRY wurde vom NSF-PRFB 1812035 finanziert. SCV und PD wurden durch einen Max-Planck-Forschungsgruppenpreis und ein Human Frontiers Science Program (HFSP) Research Grant (RGP0058/2016) gefördert. SJR, JHTP und KTJD wurden vom Europäischen Forschungsrat (ERC Starting Grant 310482 [EVOGENO]) an SJR, ECT wurde durch stipendium des Europäischen Forschungsrats (ERC-2012-StG311000) finanziert.

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das in diesem Manuskript diskutierte Protokoll beschreibt die besten Probenahmeverfahren für verschiedene molekulare Analysen von Fledermäusen mit hohem Durchsatz. Alle erfolgreichen -omics-Studien erfordern qualitativ hochwertiges Gewebe, aber die Probenahme von Fledermausgewebe, sowie andere Nicht-Modellorganismen, tritt oft unter Feldbedingungen auf, die nicht auf die gleichen Standards wie die einer kontrollierten Laborumgebung eingestellt werden können. Probenahme findet häufig an abgelegenen Orten mit minimalen Res...

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Eppendorf Safelock Röhrchen</td><td>Fischer Scientific</td><td>10509691</td><td>1,5 mL sterile Röhrchen für das Zellkulturprotokoll</td></tr><tr><td>15 mL Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62,554,002</td><td>15 mL sterile Röhrchen für das Zellkulturprotokoll</td></tr><tr><td>2 mL Kryoröhrchen</td><td>Thomas Scientific</td><td>1154P75</td><td>Kryoröhrchen für Gewebe zur Lagerung in flüssigem Stickstoff</td></tr><tr><td>3 mm Biopsie-Stanze</td><td>Medline</td><td>MIL3332</td><td>Flügel-Biopsie-Stanze für Zellkulturen</td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>Greiner</td><td>83.392</td><td>Kulturgefäß</td></tr><tr><td>Allprotect Gewebereagenz</td><td>Qiagen</td><td>76405</td><td>für Stuhlproben; Gewebestabilisierungslösung</td></tr><tr><td>Zellzählobjektträger für TC10/TC20 Zellzähler, Doppelkammer</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td>Kammern für die Zählzellen mit dem automatisierten Zellzähler TC20 von Bio-Rad</td></tr><tr><td>Kollagenase IV</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7909</td><td>Zur Dissoziation von Primärzellen</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-5X5ML</td><td>Verhindert die Kristallisation von Wasser während des Einfrierens der Zellen.</td></tr><tr><td>DMEM&ndash; Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>12491-015</td><td>Nährmedien</td></tr><tr><td>Dulbecco's</td><td>PBS Invitrogen</td><td>14190169</td><td>Ausgewogene Salzlösung zum Waschen von Zellen</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Fischer Scientific</td><td>10270106</td><td>Serum-Supplement für die in vitro Zellkultur eukaryotischer Zellen</td></tr><tr><td>Gentamycinsulfat Salz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1264-250MG</td><td>Antibiotikum für Nährmedien</td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0050</td><td>Gefrierbehälter mit 1 & Grad; C/min Kühlrate</td></tr><tr><td>PARAFILM</td><td>Sigma</td><td>P7793</td><td>Wickelröhrchen usw. zum Versiegeln</td></tr> von <tr><td>Penicillin-Streptomycin (Pen-Streptokokken), 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15140130</td><td>Antibiotikum für Nährmedien</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 10x, pH 7,4</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td>Salzpuffer zum Waschen und zur Lagerung von Knochengewebe; verdünnen auf 10x mit deionisiertem Wasser</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM7021</td><td>RNA-Stabilisierungslösung</td></tr><tr><td>RNAse</td><td>weg Genetech</td><td>83931-250 ml</td><td>baut Enzyme ab, die zum RNA-Abbau führen</td></tr><tr><td>Kieselgel</td><td>Fisher Scientific</td><td>7631-86-9</td><td>Trockenmittel</td></tr><tr><td>TC20 Automatisierter Zellzähler</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td>Automatisierter Zellzähler</td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0013</td><td>Zellfärbung zur Beurteilung der Zellviabilität</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049</td><td>Zur Dissoziation von Zellen während der Teilung</td></tr></tbody></table>

gewebesammlung von fledermäusen für -omics analysen und primäre zellkultur

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

Mit dem Fortschritt der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien ermöglichen standardisierte Methoden zur qualitativ hochwertigen Gewebeerfassung und -konservierung die Ausweitung dieser Methoden auf Nichtmodellorganismen. Eine Reihe von Protokollen zur Optimierung der Gewebesammlung von Fledermäusen wurde für eine Reihe von Hochdurchsatz-Sequenzierungsansätze entwickelt. Hier sind Protokolle für die Erfassung von Fledermäusen, gewünschte Demografie für jede Fledermaus gesammelt werden, und optimierte Methoden, um Stress auf eine Fledermaus während der Gewebesammlung zu minimieren. Konkret beschrieben werden Methoden zur Sammlung und Behandlung von Gewebe, um (i) DNA für genomische Analysen mit hohem Molekulargewicht zu erhalten, (ii) RNA für gewebespezifische Transkriptome und (iii) Proteine für proteomische Analysen. Schließlich wird auch eine Methode beschrieben, um tödliche Probenahmen zu vermeiden, indem aus Flügelclips lebensfähige primäre Zellkulturen erstellt werden. Eine zentrale Motivation dieser Methoden ist es, die Menge der potenziellen molekularen und morphologischen Daten für jede Fledermaus zu maximieren und schlagen optimale Möglichkeiten, um Gewebe zu erhalten, so dass sie ihren Wert behalten, wie neue Methoden in der Zukunft entwickeln. Diese Standardisierung ist besonders wichtig geworden, da Initiativen zur Sequenzierung von chromosomenfreien Genomen von Arten auf der ganzen Welt entstanden sind, in denen mehrere wissenschaftliche Parteien die Sequenzierung verschiedener taxonomischer Gruppen. Die hier beschriebenen Protokolle definieren die idealen Methoden zur Gewebesammlung und Gewebeerhaltung für Bat1K, das Konsortium, das die Genome jeder Fledermausart sequenziert.

Dna Für Standardanalysen mit niedrigem Molekulargewicht (LMW) wurde DNA aus drei neotropischen Fledermausarten extrahiert. Gewebeproben wurden vor Ort aus der Dominikanischen Republik und Costa Rica nach den in diesem Papier beschriebenen Protokollen entnommen. Nach der Zerlegung wurden kleine Stücke (&lt;0,5 cm im dünnsten Abschnitt) von Mischgeweben (Gehirn, Leber und Darm) in rnastabilisierende Lösung, blitzgefroren, dann bei -80 °C gelagert. Extraktionen wurden mit...

Dies ist ein Protokoll für die optimale Gewebevorbereitung für genomische, transkriptomische und proteomische Analysen von Fledermäusen, die in freier Wildbahn gefangen sind. Es enthält Protokolle für Fledermaus-Capture und -Sektion, Gewebekonservierung, und Zellkultivierung von Fledermausgewebe.

Gewebesammlung von Fledermäusen für -Omics Analysen und primäre Zellkultur

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

In diesem Video bieten wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Sammeln von Fledermäusen in einer humanen Weise, um die Auswirkungen auf die Populationen zu minimieren und den wissenschaftlichen Wert zu maximieren. Die Vorteile unseres Ansatzes sind, dass wir die Menge potenzieller molekularer und morphologischer Daten für jede Fledermaus maximieren, Gewebe erhalten, um ihren zukünftigen Wert zu behalten, und die Ernte wildlebender Individuen minimieren. Sezierprotokolle sind schwer verbal zu demonstrieren.Viele der Gewebevorbereitungstechniken, die wir hier präsentieren, werden am besten durch die Visualisierung vermittelt, wie verschiedene Organe identifiziert und dann richtig seziert und gespeichert werden. Bereiten Sie alle Durchstechflaschen vor, bevor Sie mit den Sezierungen beginnen, um Verzögerungen zu vermeiden. Legen Sie für RNA die Anzahl der Fläschchen beiseite, die für jede Probe benötigt werden.Beschriften Sie jedes Rohr mit dem gesammelten Gewebetyp sowie Standard-Probenidentifikationsinformationen. Füllen Sie die Fläschchen 50% voll von RNA-Stabilisierungslösung, und kühlen Sie auf vier Grad Celsius. Achten Sie darauf, die Durchstechflaschen nicht vollständig mit

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Verfahren beschreibt, wie primäre hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus zu etablieren und wird durch Transfektion mit dem Gene Pulser MXCell Elektroporation Systems.

Die Herstellung von primären hämatopoetischen Zellkulturen aus Knochenmark der Maus für die Elektroporation

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Isolierung und Instandhaltung von Fibroblastenkulturen von Haut-und Lungengewebe von wilden Nagetieren.

Gründung Primary Adult Fibroblastenkulturen von Nagetieren

Wir bieten Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von primären Zellen losgelöst...

Primären Zellkulturen aus Drosophila Gastrula Embryonen

Säugetier-Hülle enthält Lösungsmittel extrahierbaren Lipide, die chemischen Zusammensetzungen der einzelnen Arten charakteristisch bieten kann. Dieser Beitrag stellt eine Routinemethode zur Trennung breiten Lipidklassen aus Integumentary Geweben isoliert mit Dünnschicht-Chromatographie und Bestimmung der Triacylglycerid Profil von Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionisation Time-of-Flight-Massenspektrometrie.

Profilierung der Triacylglycerid Inhalt in Bat Integumentary Lipide durch präparative Dünnschicht-Chromatographie und MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Beschreiben wir eine einfache und schnelle experimentelle Verfahren zur Erzeugung von primären Fibroblasten, die aus den Ohren und Schwänze von Mäusen. Das Verfahren erfordert keine spezielle Tiertrainings erfordern und für die Erzeugung von Fibroblastenkulturen von den Ohren bei RT für bis zu 10 Tage gelagert werden.

Erzeugenden Primärfibroblastenkulturen von Maus-Ohr und Schwanz Tissues

Hier beschreiben wir ein Protokoll für effiziente Chromatin Immunopräzipitation (ChIP), gefolgt von Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung (ChIP-Seq) von braunen Fettgewebe (BAT) isoliert von einer Maus. Dieses Protokoll eignet sich für sowohl mapping Histon Änderungen und genomweite Lokalisierung von Histonproteine von Interesse in Vivozu untersuchen.

Chromatin Immunopräzipitation der murinen braunen Fettgewebe

Dieses Protokoll beschreibt die allgemeine Prozesse und Qualitätskontrollen für die Zubereitung von gesunder Erwachsenen einziger Säugerzellen Droplet-basierte, hohen Durchsatz Einzelzelle RNA-Seq Vorbereitungen notwendig. Sequenzierung Parameter, lesen Sie Ausrichtung und nachgelagerten einzellige bioinformatische Analyse sind ebenfalls vorhanden.

Droplet Barcode-basierte Einzelzelle Transkriptom des adulten Säugetier-Geweben

Dieses Protokoll führt ein Standard-Labor-Betriebsverfahren für diagnostische Tests von Lyssavirus-Antigenen bei Fledermäusen in Taiwan.

Standard-Betriebsverfahren für Lyssavirus-Überwachung der Fledermauspopulation in Taiwan

Wir beschreiben einen Ansatz zum Nachweis und zur Erfassung invasiver Zellsubpopulationen in Echtzeit. Das experimentelle Design verwendet die Echtzeit-Zellanalyse, indem Änderungen in der elektrischen Impedanz von Zellen überwacht werden. Invasive Krebs-, Immun-, Endothel- oder Stromazellen in komplexen Geweben können eingefangen und die Auswirkungen von Kokulturen beurteilt werden.

Echtzeit-Detektion und Erfassung invasiver Zellsubpopulationen aus Co-Kulturen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Metaboliten in seltenen Zelltypen genau und zuverlässig zu messen. Technische Verbesserungen, darunter eine modifizierte Mantelflüssigkeit zur Zellsortierung und die Generierung relevanter Blindproben, ermöglichen eine umfassende Quantifizierung von Metaboliten mit einem Input von nur 5000 Zellen pro Probe.

Gezielte Metabolomik an seltenen Primärzellen

Lernen Sie humane Gewebesammlung von Fledermäusen für genomische, transkriptomische und proteomische Analysen sowie primäre Zellkultur. Dieses Protokoll maximiert molekulare Datenqualität bei minimalem Populationsimpact.

Gewebesammlung von Fledermäusen für -Omics Analysen und primäre Zellkultur

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