Un modèle de culture de lots in vitro pour estimer les effets des régimes interventionnels sur le microbiote fécal humain

Compte tenu du rôle émergent du microbiome intestinal dans diverses maladies humaines, plusieurs modulateurs de microbiome intestinal comme les probiotiques, les prébiotiques, les régimes alimentaires et les médicaments peuvent aider à améliorer les affections de santé associées au microbiome intestinal. Cependant, aucun système de dépistage rapide et abordable n’est disponible pour prédire les effets de ces modulateurs de microbiome intestinal, mais ce système est assez simple pour prédire comment des interventions particulières peuvent avoir un impact sur le microbiome intestinal qui, en fin de compte, peut avoir un impact sur la santé de l’hôte. Ce protocole est simple, abordable et pratique pour les laboratoires qui étudient les modulateurs du microbiome intestinal et leurs effets sur le microbiote et la santé de l’hôte.

Le maintien des conditions aseptiques et anaérobies est crucial pour cette expérience. Aussi le spécimen fécal doit être utilisé à nouveau, immédiatement après la collecte. Dans le cas contraire, si l’expérience est planifiée plus tard, l’échantillon doit être conservé à moins 80 immédiatement après la collecte, sans aucune exposition à la température ambiante et à l’air.

La précision de manipulation pendant le préparation et le pipetage d’aliquot est également importante pour maintenir la précision et la reproductibilité. Cela prendra moins de 12 heures dans la journée. Nous pouvons construire une culture du jour au lendemain s’ils ont besoin des échantillons en 24 heures.

Puis, suivi par les acides gras à chaîne courte et la détermination du microbiome. Ce processus sera démontré par deux grands étudiants uni, Shokouh Ahmadi et Rabina Mainali de mon laboratoire. Pour préparer les supports de fermentation sous un capot de fumée, dans une bouteille de réapprovisionnement sur le mélange d’aimant, mélanger la solution A, la solution B, la solution minérale de trace, la solution soluble dans l’eau de vitamine, la solution folique de biotine, la solution de riboflavine, la solution d’hemin, le mélange d’acide gras à chaîne courte, et la resazurin.

Ajouter ensuite dans la bouteille l’extrait de levure, le carbonate de sodium, l’hydrochlorure de cystéine monohydrate et la trypticase. Ajouter 296,1 millilitres d’eau distillée, ajuster le pH avec un hydrochlorure normal ou hydroxyde de sodium pour s’assurer qu’il est d’environ 7,0. Transférez le bécher à un poste de travail aseptique et utilisez un filtre à vide dont la taille des pores est de 0,22 micromètre pour filtrer le média pour la stérilisation.

Pour préparer une solution de dilution anaérobie d’un litre, dissoudre cinq grammes de chlorure de sodium, deux grammes de glucose et 0,3 gramme de monohydrate d’hydrochlorure de cystéine dans l’eau ionisée. Autoclavez la bouteille de reagent avec le capuchon à 121.1 degrés Celsius pendant 15 minutes, et stockez-la à l’intérieur de la chambre anaérobie. Avant le début de l’expérience de fermentation, gardez tous les matériaux, solutions et outils nécessaires à l’expérience de fermentation à l’intérieur de la chambre anaérobie pendant au moins 48 heures, afin de s’assurer que tout résidu d’oxygène est éliminé.

Au moins 24 heures avant l’expérience de fermentation, peser 300 milligrammes d’inuline, et le transférer dans un tube de 50 millilitres, qui est ensuite placé à l’intérieur de la chambre anaérobie. Ajouter 26 millilitres de supports de fermentation stérilisés dans le tube et le vortex pour mélanger. Permettre l’hydratation des fibres pendant environ 24 heures.

Le jour de l’expérience de fermentation, préparer l’inoculum fécal. Tout d’abord, peser cinq grammes d’échantillon fécal frais dans un tube conique de 50 millilitres. Ajouter une solution de dilution anaérobie au tube pour atteindre un volume final de 50 millilitres.

Vortex pendant 15 minutes, ou jusqu’à homogénéisation complète. Gardez les tubes inoculés à 37 degrés Celsius à l’intérieur de la chambre anaérobie, et inverser doucement une fois par heure pour résusquer les fibres et l’inoculum. Après trois, six, neuf ou 24 heures, sortez la bonne quantité de médias fermentés, et centrifugez les échantillons à 14 000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.

Congelez immédiatement le supernatant et les granulés dans de l’azote liquide, puis après une congélation rapide, conservez le supernatant pour l’analyse des acides gras à chaîne courte et les granulés pour l’analyse du microbiome, à moins 80 degrés Celsius. Ce protocole est utilisé pour démontrer l’effet d’un prébiotique spécifique. Les excréments des sujets humains sains, suivant le traitement avec l’inuline, ont montré le pH relativement stable pendant neuf heures, alors qu’ont chuté de façon spectaculaire après 24 heures.

L’inoculation de l’inuline a augmenté de manière significative les niveaux des acides gras à chaîne courte et du lactate dans le spécimen fécal inuline-traité est comparé à la culture fécale non traitée de microbiote. L’analyse principale des coordonnées montre différentes compositions de microbiotes par les mesures unifrac pondérées et non pondérées de la diversité bêta entre les échantillons traités à l’inuline et les échantillons non traités. Les indices de diversité alpha par rapport à la diversité phylogénétique par l’intermédiaire de l’arbre entier, de la richesse des espèces, des unités taxonomiques opérationnelles, de l’équilibre des espèces, ainsi que de l’abondance relative de phyla et de genres majeurs, présentent tous différentes signatures de microbiotes intestinaux entre les échantillons traités par inuline et les échantillons non traités.

Le cladogram taxonomique, dérivé de l’analyse linéaire de la taille de l’effet discriminant des séquences 16S, représente le taxa différentiel abondant entre différents groupes d’échantillons. Suivez toutes les étapes avec soin. La chose la plus importante est de maintenir des conditions aseptiques et anaérobies strictes.

Le supernatant et de l’expérience peut être utilisé pour traiter les changements de niveau d’acides gras à chaîne courte à la suite de la fermentation basée sur les fibres. En outre, le dans la pastille peut être utilisé pour analyser les changements dans la composition du microbiome intestinal. Certains produits chimiques utilisés pour fabriquer les supports de culture sont potentiellement dangereux.

S’il vous plaît la feuille MSDS et prendre des précautions en conséquence.