Surveillance in Situ des assemblages de chaperon moléculaire s'est formé de façon transitoire dans les bactéries, les levures et les cellules humaines

Cette méthode capture les interactions protéiques transitoires dans des organismes comme les bactéries et les levures et dans différents types de cellules. Ici, nous surveillons transitoirement formés complexes chaperons spécifiques qui sont impliqués dans la protéostasie cellulaire. Le principal avantage de cette technique est la capacité de générer des informations sur la dynamique et la localisation subcellulaire des assemblages protéiques dans les cellules procaryotes et eucaryotes.

Les adaptations de cette technique dans les organismes unicellulaires comme les bactéries et les levures, permet aux chercheurs de l’utiliser comme un outil puissant pour étudier les maladies liées aux infections microbiennes. Cette technique pourrait potentiellement être utilisée pour analyser les interactions protéiques dans presque tous les organismes en changeant simplement les conditions à la phase de préparation de l’échantillon du protocole. Il est important de sélectionner des anticorps de bonne qualité qui sont spécifiques et testés dans l’immunohistochimie, l’immunofluorescence, l’ELISA ou les immunoprécipices.

Commencez par pré-traiter les diapositives diagnostiques de 10 puits avec la poly-L-Lysine. Ajouter 100 microlitres de stérile et filtré 0,0001% poly-L-Lysine à chaque puits, et incuber les diapositives pendant 30 minutes dans un capot stérile d’écoulement laminaire. Ensuite, lavez chaque puits avec 50 microlitres d’eau stérile pour enlever l’excès de poly-L-Lysine.

Ajouter environ 15 000 cellules par puits selon le type de cellule, et faire pousser les cellules dans un incubateur humide stérile à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone à une confluence de 60 à 80%. Après 24 heures, retirer le milieu de croissance en plaçant un papier de soie au bord de chaque puits, et laver les cellules trois fois avec 50 microlitres de PBS. Puis fixer les cellules en ajoutant 50 microlitres de paraformaldéhyde fraîchement préparé 4% dans PBS à chaque puits et l’incubation de la diapositive à température ambiante pendant 10 minutes.

Après fixation, lavez la lame trois fois en plongeant la glissière dans un bocal à taches de glissière avec du PBS. Pour perméabiliser les membranes des cellules attachées, submergez la lame en 100 millilitres de 0,5% Triton-X100 dans PBS, et incubez les cellules pendant 10 minutes à température ambiante. Lavez ensuite les glissières trois fois dans tbs-t.

Après le dernier lavage, retirer l’excès de tampon à l’intérieur d’un papier de soie. Cultiver et diluer les cellules S.cerevisiae selon les instructions manuscrites, puis les transférer dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres et pellet par centrifugation à 665 fois g pendant trois minutes. Enlevez le surnatant et resuspendez les cellules en cinq millilitres de milieu frais.

Ajouter ensuite 550 microlitres de formaldéhyde à 37% pour une concentration finale de 4% et incuber la culture à température ambiante pendant 15 minutes pour fixer les cellules. Après l’incubation, pelleter les cellules, enlever le supernatant, et resuspendre la pastille dans un millilitre de paraformaldéhyde fraîchement préparé 4% dans le tampon de lavage. Incuber les cellules à température ambiante pendant 45 minutes.

Pendant ce temps, préparez les diapositives diagnostiques en ajoutant 100 microlitres de solution 0,0001% poly-L-Lysine à chaque puits et en incubant les glissières pendant 30 minutes à température ambiante. Puis laver l’excès de poly-L-Lysine avec de l’eau ultrapure et laisser sécher à l’air libre. Après l’étape d’incubation, lavez les cellules deux fois avec un millilitre de tampon de lavage par centrifugation.

Retirez le supernatant et resuspendez les cellules dans le tampon de lavage. Pelleter les cellules après le dernier lavage, et enlever le supernatant et resuspendre les cellules dans un millilitre de tampon de lavage contenant 1,2 sorbitol molaire. Pour digérer la paroi cellulaire, pelleter les cellules à nouveau et résuspendre les cellules dans 250 microlitres de solution lyticase fraîchement préparée.

Incuber les cellules à 30 degrés Celsius pendant 15 minutes avec des secousses douces. Après l’étape de digestion, laver les cellules trois fois dans le tampon de lavage et de résuspendre les cellules dans 250 microlitres de tampon de lavage contenant 1,2 sorbitol molaire. Ajouter 20 microlitres de cellules re-suspendues à chaque puits recouvert de poly-L-Lysine, et permettre aux cellules fixes et perméabilisées de s’attacher pendant 30 minutes.

Lavez les puits trois fois avec 50 microlitres de tampon de lavage pour enlever les cellules non adhérentes, et procéder à l’analyse de ligature de proximité. Lancez l’analyse de ligature de proximité, ou protocole PLA, en ajoutant une goutte du tampon de blocage à chaque puits et incuber la glissière dans une chambre humide pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Retirez le tampon de blocage en plaçant un papier de soie au bord de chaque puits, et lavez les cellules deux fois dans 100 millilitres de tampon de lavage A.Next, ajoutez 40 microlitres de la solution primaire d’anticorps à chaque puits, et incuber la glissière pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius dans une chambre humide.

Retirez la solution d’anticorps primaire et lavez les glissières deux fois dans le tampon de lavage A.Après le lavage, ajoutez 40 microlitres de la solution secondaire d’anticorps à chaque puits et incubez la lame pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius dans une chambre humide. Ensuite, retirez la solution et lavez les glissières deux fois dans le tampon de lavage A.Then ajouter 40 microlitres du mélange de ligature de l’ADN qui contient les oligonucléotides connecteur et ligase d’ADN, à chaque puits, et incuber la diapositive dans la chambre humide à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’incubation, retirer le mélange de ligature et laver les glissières deux fois avec le tampon de lavage A.Ajouter 40 microlitres de mélange d’amplification de l’ADN qui contient la polymésase d’ADN et les oligonucléotides étiquetés fluorescents à chaque puits, et incuber pendant 100 minutes dans la chambre humide à 37 degrés Celsius.

Retirer le mélange d’amplification et laver les glissières en 100 millilitres de tampon de lavage B pendant 10 minutes par lavage. Ensuite, lavez les glissières en 100 millilitres de tampon de lavage B dilué un à 100 dans de l’eau ultrapure. Ajouter 20 microlitres de support contenant du DAPI par puits.

Couvrir les puits de la glissière d’un slip de couverture et sceller avec du vernis à ongles. Ce protocole a été utilisé avec succès pour surveiller les assemblages transitoires de chaperons formés entre les protéines distinctes du domaine J et les protéines du chaperon Hsp70 et du domaine J dans les cellules HeLa, S.cerevisiae et E.coli. Les protéines humaines de classe A et de classe B du domaine J ont été ciblées avec des anticorps primaires très spécifiques.

Chacun des ponctions fluorescentes rouges représente un complexe protéique formé entre deux protéines distinctes du domaine J dans les cellules HeLa. Des complexes protéiques similaires de classe mixte du domaine J sont également observés dans l’eukaryote unicellulaire S.cerevisiae, ou levure de boulanger. Certains des ponctions fluorescentes générées par l’APL étaient plus difficiles à résoudre en tant que foyers individuels, en raison de la petite taille des cellules.

La formation complexe entre les protéines de classe A et B du domaine J n’a pas été observée dans les cellules E.coli, ce qui est compatible avec des études biochimiques réalisées avec des protéines purifiées. Mais d’autres assemblages de chaperons impliquant des protéines du domaine J et le chaperon Hsp70 ont été capturés en utilisant le protocole PLA. Les contrôles techniques dépourvus d’un anticorps primaire contre l’une des protéines ou chaperons interagissants du domaine J dans les réactions d’APL par ailleurs complètes ont montré peu ou pas de formation de puncti de fluorescence dans les cellules, indiquant un manque d’amplification faussement positive du signal.

Pour obtenir des résultats fiables à l’aide de l’analyse de ligature de proximité, vérifiez à l’avance que les anticorps utilisés sont de qualité suffisante. En outre, prenez des précautions pour éviter la surdigestion des cellules contenant une paroi cellulaire.