Name: Mesure de la masse mitochondriale et du potentiel membranaire dans les cellules souches hématopoïétiques et les lymphocytes T par cytométrie de flux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Découvrez une méthode de cytométrie en flux pour mesurer la masse mitochondriale et le potentiel membranaire dans les cellules souches hématopoïétiques et les lymphocytes T. Cette technique permet d'analyser les populations cellulaires rares et d'évaluer leur fonctionnalité métabolique.

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Nous remercions l'UNIL Flow Cytometry Core Facility pour son soutien, en particulier le Dr Romain Bedel. Ce travail a été soutenu par la subvention de la fondation Kristian Gerhard Jebsen à N.V et O.N.

Toutes les expériences décrites dans le manuscrit suivent les directives de notre institution et ont été réalisées conformément au droit suisse pour l'expérimentation animale (Autorisation: VD3194) et pour la recherche portant sur des échantillons humains (Protocole: 235/14; CER-VD 2017-00490)
1. Extraction hématopoïétique des cellules souches
<ol><li>Achetez des souris sauvages de type C57BL6/J et gardez-les dans la maison des animaux pendant au moins une semaine pour réduire le stress associé au transport.</li>
	<li>Le jour de l'expérience, euthanasiez la souris à l'aide de l'asphyxie au CO2.</li>
	<li>Vaporiser la souris avec 70% d'éthanol pour stériliser la fourrure et ouvrir la souris au ventre en utilisant des outils chirurgicaux standard, tels que les ciseaux de dissection et les forceps, pour couper le fémur et les os du tibia des pattes postérieures.</li>
	<li>Retirez les muscles attachés au fémur, au tibia et au bassin à l'aide d'une serviette en papier souple et placez les os nettoyés dans un tube de 50 ml contenant du PBS avec 1 mM EDTA (tampon) sur la glace.</li>
	<li>Vaporiser un mortier et un pilon avec 70 % d'éthanol et le placer dans une hotte de culture cellulaire. Stérilisez-le avec des UV pendant 30 min. Après la stérilisation, rincez le mortier et pilons avec tampon pour éliminer les traces d'éthanol.</li>
	<li>Mettre les os propres avec un tampon (10 ml) dans le mortier et les écraser délicatement pour sortir la moelle osseuse en suspension. Maintenant, collectez la suspension cellulaire et passez-la à travers une passoire à cellules de 70 m dans un tube de 50 ml pour obtenir une suspension à cellule unique.</li>
	<li>Répétez l'étape 1.6 jusqu'à ce que toute la moelle osseuse ait été extraite et que les débris osseux soient devenus blancs.</li>
	<li>Placez le tube (s) de 50 ml contenant la suspension à cellule unique de moelle osseuse sur une centrifugeuse. Faire fonctionner la centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à 4 oC pour granuler les cellules.</li>
	<li>Pendant ce temps, préparer 10 ml de tampon de lyse RBC 1x dans de l'eau distillée autoclaved. Filtrer la solution à l'intermédiaire d'un filtre de 0,22 m.</li>
	<li>Recueillir le tube de l'échantillon de la centrifugeuse et décant le supernatant. Pipette le tampon de lyse 1x RBC (Table des Matériaux) sur la pastille cellulaire. Déloger la pastille et préparer une solution homogène en faisant monter et descendre à quelques reprises. Laisser le tube être à température ambiante pendant 1 h 2 pour que la lyse RBC se produise. Arrêtez le processus de lyse en remplissant le tube avec le tampon.</li>
	<li>Placer le tube sur une centrifugeuse et faire tourner à 300 x g pendant 5 min à 4 oC. Recueillir le tube de la centrifugeuse et décant le supernatant. Resuspendre le granule en ajoutant 10 ml de tampon et filtrer la solution dans un nouveau tube de 50 ml via une passoire à cellules de 70 m pour enlever les débris en raison de la lyse RBC.</li>
	<li>Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min à 4 oC. Recueillir le tube de la centrifugeuse et décant le supernatant. Resuspendre la pastille dans 500 l'un de tampon.</li>
	<li>Retirer un aliquot de 100 l et conserver dans un tube séparé de 1,5 ml. Ajoutez 50 L de cocktail d'anticorps d'épuisement de la lignée de biotine du kit d'enrichissement de l'ancêtre (Table of Materials) aux 450 l'autre de suspension cellulaire. Incuber à 4 oC sur un shaker pendant 15 min.</li>
	<li>Ajouter 15 ml de tampon et centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min à 4 oC. Recueillir le tube de la centrifugeuse et décant le supernatant. Resuspendre la pastille dans 460 l'un de tampon. Retirer un aliquot de 10 l et conserver dans un tube séparé de 1,5 ml.</li>
	<li>Ajouter 50 l de perles magnétiques streptavidin es du kit d'enrichissement de l'ancêtre (Table of Materials), à la suspension cellulaire restante de 450 l. Incuber à 4 oC sur un shaker pendant 15 min.</li>
	<li>Ajouter 15 ml de tampon et centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min à 4 oC. Recueillir le tube de la centrifugeuse et décant le supernatant. Resuspendre la pastille dans 5 ml de tampon et transférer la solution dans un tube de 15 ml.</li>
	<li>Prendre le tube à un séparateur cellulaire automatisé (Table des matériaux). Exécuter un programme de lavage pour rincer et amorcer le tube du séparateur cellulaire. Placez l'échantillon et deux tubes de collecte sur le support du tube. Effectuer la séparation à l'aide du programme «Deplete». Recueillir les fractions positives et négatives du séparateur cellulaire automatisé une fois la course terminée. REMARQUE: En l'absence d'un séparateur cellulaire automatique, les utilisateurs peuvent utiliser des colonnes magnétiques manuelles et des aimants correspondants, selon le manuel de l'utilisateur. Les utilisateurs doivent garder à l'esprit que le processus de séparation manuelle est plus lent que celui automatisé. En outre, les colonnes manuelles sont plus sujettes à l'engorgement. Par conséquent, il est conseillé aux utilisateurs de diluer l'échantillon et de charger lentement sur la colonne.</li>
	<li>Jeter la fraction positive. Remplissez le tube de fraction négative avec un tampon. Centrifuger le tube à 300 x g pendant 5 min à 4 oC.</li>
	<li>Pendant ce temps, préparer le mélange d'anticorps dans 1 ml de solution de volume final et les commandes d'une seule couleur dans 200 L de solution de volume final comme décrit dans tableau des matériaux et tableau 1. REMARQUE: Si le TMRM et la tache mitochondriale fluorescente verte doivent être combinés avec la coloration de marqueur de cellules souches, puis remplacez CD150-PE avec CD150-PEcy5 et Streptavidin-Tx rouge avec Streptavidin-Pac Orange.</li>
	<li>Recueillir le tube de l'échantillon de la centrifugeuse et décant le supernatant. Resuspendre la pastille dans 1 ml de mélange d'anticorps. Ajouter 10 l de cellules (à partir de l'étape 1.13) dans chacun des tubes de contrôle d'une seule couleur (à l'exception de la lignée). Ajouter 10 l de cellules (à partir de l'étape 1.14) dans le tube de couleur unique de la lignée.</li>
	<li>Incuber l'échantillon et les tubes de commande d'une seule couleur à 4 oC sur un shaker pendant 45 min. Couvrir le seau à glace d'un couvercle ou d'une feuille d'aluminium.</li>
	<li>Remplir tous les tubes de tampon et de centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à 4 oC. Jetez le supernatant et suspendez l'échantillon dans 1 ml de tampon et de commandes d'une seule couleur dans 200 l'un de tampon.</li>
	<li>Transférer l'échantillon et les commandes unicolores sur des tubes FACS de 5 ml.</li>
	<li>Acqu'on trouve les tubes jusqu'à la machine de tri et triez la population de HSC (stratégie de gating dans la figure 1A)dans des tubes de 1,5 ml contenant 400 l de milieu d'expansion des cellules souches.</li>
</ol>2. Ex Vivo Culture of Hematopoietic Stem Cells
<ol><li>Recueillir des tubes contenant des cellules triées (voir la section 1 pour l'extraction cellulaire). Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 5 min à 4 oC. Retirez délicatement la majeure partie du supernatant sans déloger la pastille et laissez 50 à 80 l sur le dessus de la pastille cellulaire. Cela minimise la perte cellulaire.</li>
	<li>Resuspendre le granule cellulaire dans le milieu d'expansion des cellules souches à un volume final dépendant du nombre de conditions à tester (compte zettant pour 100 L par puits/condition de culture).</li>
	<li>Préparer un milieu de culture 2x contenant un milieu d'expansion des cellules souches, un facteur de cellules souches (200 ng/mL), un ligand FLT3 (4 ng/mL) et des antibiotiques pen-strep (1 %) (2x milieu basal; Tableau des matériaux).</li>
	<li>Prenez une culture stérile de tissu traitée 96 U-bottom plaque de puits (Tableau des matériaux) et d'identifier les puits où les cellules seront cultivées (conception de plaque dans la figure 1B). REMARQUE: Il est conseillé aux utilisateurs d'éviter les puits marginaux, car ils sont plus sensibles à l'évaporation.</li>
	<li>Mettre 100 ll de milieu basal 2x préalablement préparé à l'étape 2.3 dans ces puits. Dans le NR marqué bien ajouter 2 'L d'une solution NR 100x (Tableau des Matériaux). Réapprovisionnez NR toutes les 24 h. REMARQUE: Le réapprovisionnement est spécifique à NR. D'autres modulateurs métaboliques peuvent ou ne peuvent pas avoir besoin de reconstitution.</li>
	<li>Graines 100 l de cellules préparées à l'étape 2.2 sur les puits contenant 2x milieu basal. Dans cette expérience, le nombre de HSC ensedus par puits se trouvaient entre 800 et 1 000 cellules.</li>
	<li>Préparer cinq puits supplémentaires contenant 2x milieu basal. Dans chacune de ces cellules ajouter 100.000 cellules entières de moelle (à partir de l'étape 1.13) resuspendues dans 100 'L de milieu d'expansion de cellules souches pour être utilisé comme contrôles de coloration pour l'analyse de cytométrie de flux de post-culture. REMARQUE: Si les utilisateurs veulent combiner des marqueurs de cellules souches et des marqueurs mitochondriaux pour l'analyse post-culture, il est recommandé de trier en outre la population progénitrice (cellules CkitMD ou LKSCD150- cellules). Ensemencez ces progéniteurs triés dans les puits de contrôle de coloration pour l'analyse de cytométrie de flux de post-culture. Préparer un puits par couleur de tache unique.</li>
	<li>Mettre 200 ll d'eau autoclaved dans tous les puits environnants pour réduire l'évaporation des puits contenant des cellules. Laisser la plaque intacte dans un incubateur à 37 oC et 5 % de CO2 pendant toute la durée de la période de culture (72 h). Retirez la plaque pour reconstituer NR toutes les 24 h et placez-la de nouveau dans l'incubateur.</li>
</ol>3. Mesure de la masse mitochondriale et du potentiel membranaire
<ol><li>À la fin de la période de culture, préparez une solution 100x de TMRM (20 M) et de vert Mitotracker (10 M) (tache fluorescente verte) dans le milieu d'expansion des cellules souches(Tableau des matériaux).</li>
	<li>Ajouter 2 ll de la solution TMRM 100x et 2 l de solution de tache fluorescente verte de 100x dans chacun des puits d'essai. Ajouter 2 L de 100x TMRM dans le puits de commande TMRM. Ajouter 2 ll de tache fluorescente verte de 100x dans le puits de commande Mitotracker. Remettre la plaque dans un incubateur à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 45 min. Couvrir le dessus de la plaque de papier d'aluminium. REMARQUE: Un contrôle supplémentaire avec Verapamil (inhibiteur de pompe ABC) peut être préparé si l'efflux de colorant médié par la pompe ABC doit être testé. Pour cela, ajouter 50 M Verapamil dans l'un des puits d'essai 1 h avant de coloration pour TMRM et tache fluorescente verte.</li>
	<li>Retirer la plaque de l'incubateur et la centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Inverser la plaque pour enlever le supernatant. Ajouter 200 oL de tampon FACS standard (PBS-1 mM EDTA-P/S-2% FBS), centrifuger la plaque à 300 x g pendant 5 min. Retirez le supernatant. Répétez cette étape de lavage 3x. Les utilisateurs doivent s'assurer que la plaque est toujours recouverte de papier d'aluminium, afin d'offrir une exposition minimale à la lumière directe. REMARQUE: Si les utilisateurs ont besoin de combiner la coloration mitochondriale avec la coloration des cellules souches, l'échantillon devra être incubé avec un mélange d'anticorps de tous les marqueurs de cellules souches et les contrôles d'une seule couleur devront être tachés avec des anticorps individuels séparément à 4 oC pendant 30 à 45 min. REMARQUE: À toutes les étapes, les utilisateurs doivent garder la plaque recouverte de papier d'aluminium. Les utilisateurs doivent noter que cette étape de coloration supplémentaire et les étapes de lavage ultérieures peuvent entraîner une perte cellulaire supplémentaire.</li>
	<li>Resuspendre les cellules dans 200 l de tampon FACS et transférer dans les tubes FACS.</li>
	<li>Exécuter les échantillons sur le cytomètre d'écoulement (voir Figure 1). Les tubes de couleur unique contenant WBM comprennent : (1) Non taché; (2) DAPI; (3) TMRM (PE); (4) tache fluorescente verte (FITC); (5) Tache complète (PE et FITC).</li>
	<li>D'abord acquérir les commandes unicolores pour configurer la machine. Utilisez le logiciel en cours d'exécution sur la machine pour calculer la compensation. Une fois la compensation appliquée, acquérez l'échantillon de HSC et enregistrez autant d'événements que possible. REMARQUE: Si les marqueurs de cellules souches et mitochondriales sont combinés, les utilisateurs doivent être particulièrement prudents avec la compensation entre TMRM (PE), CD150 (PE-Cy5), et Sca-1 (APC). En outre, les échantillons doivent être exécutés immédiatement après coloration.</li>
	<li>Exporter les fichiers FACS à partir du cytomètre et analyser les données sur un logiciel d'analyse (Tableau des Matériaux).<ol>
<li>Pour l'analyse, ouvrez le fichier sur le logiciel d'analyse. L'utilisation de FSC-A et sSC-A pour identifier la population cellulaire. Identifiez les singlets dans les portes suivantes avant de tracer la fraction négative DAPI (cellules vivantes). Dans la porte des cellules vivantes faire une parcelle de contour dans le TMRM et vert canal de taches fluorescentes pour mesurer la masse et la masse, respectivement (Figure 2A). Exporter l'intensité moyenne de fluorescence (IMF) de ces deux canaux dans la porte des cellules vivantes.</li>
		<li>La porte basse TMRM est fixée en fonction de la population d'épaules dans le canal TMRM. Le contrôle tMRM d'une seule couleur peut être utilisé pour identifier cette population d'épaules pour définir la porte. Exportez la proportion de cellules vivantes dans la porte basse de TMRM dans votre contrôle et testez des échantillons pour tracer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405(2019).</li>
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</ol>

Certains éléments de ce travail ont été soumis à la demande P1828EP00 à l'Office européen des brevets.

Une régulation serrée de la fonction HSC est importante pour maintenir l'hématopoiesis stable pendant la vie d'un organisme. Comme divers autres types de cellules dans le corps, un composant clé qui contribue à la régulation de la fonction HSC est le métabolisme cellulaire. Des études antérieures de notre laboratoire9 et d'autres2,3 ont impliqué l'importance des mitochondries dans le maintien d'un état métabolique distinct dans les HSC. En...

Les cellules souches hématopoïétiques (HSC) sont une petite population de cellules résidant dans la moelle osseuse assurant la production sanguine et l'homéostasie tout au long de la vie d'un organisme. Les HSC font la médiation de ce processus en donnant naissance à des progéniteurs qui, à leur tour, produisent des lignées de cellules sanguines matures différenciées en phase terminale par plusieurs cycles de division cellulaire et des étapes de différenciation bien orchestrées1. Fait important, les HSC produisent leur énergie par glycolyse anaérobie. En revanche, les progéniteurs hématopoïétiques plus engagés et actifs commutent leur métabolisme vers le métabolisme mitochondrial2,3,4. Cet état métabolique distinct est censé protéger les HSC contre les dommages cellulaires infligés par les espèces réactives d'oxygène (ROS) produites par les mitochondries actives, maintenant ainsi leur fonction in vivo à long terme5,6,7,8. La mesure directe de l'état métabolique de HSC est provocante et souvent faible débit en raison de leur nombre limité. Ici, nous décrivons un essai basé sur la cytométrie d'écoulement pour la mesure robuste du potentiel de membrane mitochondriale (M) utilisant la fluorescence de méthyle de méthylàure de térameramethylrhodamine (TMRM), et la masse mitochondrique utilisant une tache mitochondriale fluorescente verte (Mitotracker Vert) dans HSCs. Nous avons déjà démontré que le bas -m est un marqueur fonctionnel de bonne foi des HSC fortement purifiés9 et des modulateurs métaboliques capables d'abaisser la fonction d'amélioration de HSCs9,10. Ici nous proposons l'utilisation de notre méthode sur le profilage mitochondrial de HSCs comme stratégie pour identifier de nouvelles molécules capables d'améliorer le potentiel à long terme de reconstitution de sang des HSC.
À titre d'exemple, nous démontrons que cet analyse mesure de façon fiable l'abaissement de HSC'm lors de l'exposition à la vitamine B3 analog nicotinamide riboside (NR). En conséquence, dans notre étude récemment éditée nous démontrons que NR améliore fortement la posttransplantation de récupération de sang dans les systèmes de souris et humanisés de souris en améliorant directement les fonctions hématopoïétiques de tige et d'ancêtre10. La capacité de ces modulateurs métaboliques est d'une grande valeur clinique considérant qu'un taux de mortalité de 25% est lié au retard dans le sang et à la récupération immunisée dans les patients posttransplantés11,12.
En outre, nous fournissons la preuve que cette méthodologie peut être appliquée pour la caractérisation du profil métabolique et de la fonction des lymphocytes T humains. Ces dernières années, le développement de la thérapie cellulaire adoptive (ACT) utilisant des lymphocytes infiltrants de tumeur autologue (TILs) est devenu l'approche la plus efficace pour certains types de cancer avancé avec le pronostic extrêmement défavorable (par exemple, mélanome métastatique, où 'gt;50% de patients répondent au traitement et jusqu'à 24% de patients ont la régression complète)13. Cependant, les TILs hébergeant une activité antitumorale suffisante sont difficiles à générer14. La prolifération et la stimulation étendues que les TILs subissent pendant l'expansion ex vivo causent l'épuisement et la sénescence de cellules T qui altèrent considérablement la réponse antitumorale de cellule T15. Fait important, la capacité antitumorale des TIL est étroitement liée à leur métabolisme16,17 et les approches visant à moduler le métabolisme par l'inhibition de la voie PI3K/Akt ont produit des résultats encourageants18,19. Pour cette raison, nous comparons les cellules T dérivées de cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMC) et de TIL dérivées du patient, et montrons que les lymphocytes T moins différenciés dérivés de PBMC ont une masse inférieure et mitochondriale par rapport aux TIL différenciés en phase terminale.
Nous envisageons que cet analyse peut être utilisé pour identifier de nouveaux modulateurs métaboliques qui améliorent la fonction HSC et les lymphocytes T par la modulation de l'amon.

<table><tbody><tr><td>Tubes FACS de 5 mL</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>Préparation d’échantillons</td></tr><tr><td>Plaque inférieure 96-U</td><td>Corning</td><td>3799</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Séparateur AutoMACS pro</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>Séparation automatique</td></tr><tr><td>des cellules BD FACS AriaIII</td><td>Becton et Dickinson</td><td></td><td>Tri cellulaire</td></tr><tr><td>BD IMag souris progéniteur hématopoïétique kit d’enrichissement</td> cellulaire <td>BD</td><td>558451</td><td>Epauvrissement de la lignée</td></tr><tr><td>BD LSRII</td><td>Becton et Dickinson</td><td></td><td>Machine d’acquisition FACS</td></tr><tr><td>BD-DIVA</td><td>Becton et Dickinson</td><td></td><td>Logiciel d’acquisition</td></tr><tr><td>CD150 PE</td><td>Biolegend</td><td>115904</td><td>Mélange de coloration d’anticorps</td></tr><tr><td>CD150 PE-Cy5</td><td>Biolegend</td><td>115912</td><td>Mélange de coloration d’anticorps</td></tr><tr><td>CD48 PB</td><td>Biolegend</td><td>103418</td><td>Mélange de coloration d’anticorps</td></tr><tr><td>Centrifugeuse- 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Centrifugation</td></tr><tr><td>Ckit PeCy7</td><td>Biolegend</td><td>105814</td><td>Mélange de coloration d’anticorps</td></tr><tr><td>Flow jo</td><td>FlowJo LLC</td><td></td><td>FACS Logiciel d’analyse</td></tr><tr><td>GraphPad-Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Tracé des données dans des graphiques</td></tr><tr><td>Mitotracker Green</td><td>Invitrogen</td><td>M7514</td><td>coloration mitocondriale fluorescente verte pour mesurer la masse mitochondriale ; concentration de travail = 100 nM ; concentration de stock = 1 mM</td></tr><tr><td>de nicotinamide riboside (NR)</td><td>synthétisé sur mesure en interne</td><td></td><td>Modulateur métabolique ; concentration de travail = 500 & micro ; M; concentration du stock = 50 mM</td></tr><tr><td>PBS</td><td>CHUV</td><td></td> 1000324 <td>Préparation du tampon ; concentration de travail = 1x ; concentration du stock = 1x</td></tr><tr><td>Pen-Strep (P/S)</td><td>Life technologies</td><td>15140122</td><td>Culture ex vivo ; concentration de travail = 1x ; concentration du stock = 1x</td></tr><tr><td>Tampon de lyse des globules rouges</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td>Lysing Globules rouges ; concentration de travail = 1x ; concentration du stock = 10x</td></tr><tr><td>Ligand Flt-3 de souris recombinante (FLT3)</td><td>RnD</td><td>427-FL-005/CF</td><td>Culture ex vivo ; concentration de travail = 2 ng/mL ; concentration de stock = 10 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Facteur de cellules souches de souris recombinantes (SCF)</td><td>RnD</td><td>455-MC-010/CF</td><td>Culture ex vivo ; concentration de travail = 100 ng/mL ; concentration de stock = 50 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Sca1 APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-5981-82</td><td>Mélange de coloration d’anticorps</td></tr><tr><td>StemlineII Milieu d’expansion de cellules souches hématopoïétiques</td><td>SIGMA</td><td>S0192</td><td>Culture ex vivo</td></tr><tr><td>Streptavidin Pac orange</td><td>Life Technologies</td><td>S32365</td><td>Mélange de coloration</td></tr><tr><td>d’anticorps Streptavidin Tx red</td><td>Life Technologies</td><td>S872</td><td>Mélange</td></tr> <tr><td>de coloration d’anticorpsTMRM</td><td>Invitrogen</td><td>T668</td><td>Coloration du potentiel de membrane mitochondriale ; concentration de travail = 200 nM ; concentration de matière = 10 mM</td></tr><tr><td>EDTA ultra pur</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>Préparation du tampon ; concentration de travail = 0,5 M ; concentration de matière = 1 mM</td></tr></tbody></table>

mesure de la masse mitochondriale et du potentiel membranaire dans les cellules souches hématopoïétiques et les lymphocytes t par cytométrie de flux

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

Un bel équilibre de quiescence, d'auto-renouvellement et de différenciation est essentiel pour préserver le bassin de cellules souches hématopoïétiques (HSC) et maintenir la production à vie de toutes les cellules sanguines matures. Ces dernières années, le métabolisme cellulaire a émergé comme un régulateur crucial de la fonction HSC et le destin. Nous avons précédemment démontré que la modulation du métabolisme mitochondrial influence le destin de HSC. Plus précisément, en découplant chimiquement la chaîne de transport d'électrons, nous avons pu maintenir la fonction HSC dans des conditions de culture qui induisent normalement une différenciation rapide. Cependant, la limitation des nombres de HSC empêche souvent l'utilisation des essais standard pour mesurer le métabolisme de HSC et donc prévoir leur fonction. Ici, nous rapportons un essai simple de cytométrie de flux qui permet la mesure fiable du potentiel de membrane mitochondrique et de la masse mitochondrique dans les cellules rares telles que HSCs. Nous discutons l'isolement des HSCde de la moelle osseuse de souris et la mesure de la masse mitochondriale et de la culture post ex vivo potentielle de membrane. Par exemple, nous montrons la modulation de ces paramètres dans les HSC par le traitement avec un modulateur métabolique. En outre, nous étendons l'application de cette méthodologie sur les lymphocytes T périphériques humains dérivés du sang et les lymphocytes infiltrants de tumeur humaine (TILs), montrant des différences dramatiques dans leurs profils mitochondriaux, reflétant probablement différentes cellules T Fonctionnalité. Nous croyons que cet analyse peut être employé dans les criblages pour identifier des modulateurs du métabolisme mitochondrique dans différents types de cellules dans différents contextes.

Dans la figure 1, nous montrons la stratégie de gating pour l'isolement des cellules souches hématopoïétiques de la moelle osseuse de la souris et la disposition de la plaque pour leur culture ex vivo. La figure 1A montre l'identification de la fraction de lymphocyte dans la parcelle SSC-A/FSC-A. Les doublets ont été enlevés dans la porte de singlet suivie par l'identification des cellules vivantes par l'absence du signal de DAPI. La population ...

Ici nous décrivons une méthode fiable pour mesurer la masse mitochondriale et le potentiel de membrane dans les cellules souches hématopoïétiques et les cellules T cultivées ex vivo.

Mesure de la masse mitochondriale et du potentiel membranaire dans les cellules souches hématopoïétiques et les lymphocytes T par cytométrie de flux

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Ce protocole est un essai simple basé sur la cytométrie d’écoulement permettant la mesure du potentiel mitochondrique de membrane et de la masse mitochondrique dans les cellules vivantes. Les analyses métaboliques standard échouent lorsque l’on travaille avec des populations rares telles que les cellules souches hématopoïétiques. Cette méthode permet aux utilisateurs de profiler la membrane mitochondriale lorsqu’ils travaillent avec un faible nombre de cellules et de déterminer de nouveaux modulateurs métaboliques de cellules telles que les HSC.En outre, vous pouvez le combiner avec des analyses fonctionnelles en aval telles que la transplantation de moelle osseuse ou des tests de formation de colonies pour déterminer la fonctionnalité de vos cellules post-culture. Notre technique peut être exploitée pour l’identification de nouvelles molécules capables d’améliorer la fonction HSC dans le contexte de la transplantation de moelle osseuse et de la récupération immunitaire hématopoïétique après des thérapies ablatives. Comme décrit dans notre protocole, notre méthode peut être employée pour évaluer la forme physique métabolique des cellules immunisées de T.Il est très important que les cellules aient une exposition minimale à la lumière après coloration. En outre, l’utilisation de l’inhibiteur de la pompe verapamil doit être inclus afin d’évaluer la contribution de l’efflux de la pompe. Cependant, les utilisateurs doivent être conscients que le verapamil perturbe profondément l’équilibre ionique et ne peut pas être utilisé afin d’évaluer l’effet d’un modulateur métabolique sur le potentiel meitochondrial de membrane.Démonstration visuelle de cette méthode est extrêmement important parce qu’il ya quelques étapes critiques que l’on doit garder à l’esprit lorsque vous travaillez avec un faible nombre de cellules, et ces étapes sont très souvent absents dans les journaux réguliers que les utilisateurs lisent sur PubMed. Pour le tri des AEC, la population de SLS, définie par lignée négative, Sca1 positive, cKit positive est identifiée. Les cellules souches hématopoïétiques d’environ cinq à 10 % des cellules de la population de LKS sont identifiées en gémissant pour la population négative positive de CD150, CD48, étiquetée comme HSC.Après le tri des cellules souches hématopoïétiques, centrifugez les tubes à 300 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retirer délicatement la majeure partie du supernatant sans déloger la pastille et laisser 50 à 80 microlitres sur le dessus de la pastille cellulaire. Resuspendez la pastille cellulaire dans le milieu d’expansion des cellules souches à un volume final de 200 microlitres.Préparer une culture stérile des tissus traités 96 U-bottom plaque de puits, et d’identifier les puits où les cellules seront cultivés. Transférer 100 microlitres de milieu basal 2x préalablement préparés dans ces puits. Dans le NR bien marqué, ajouter deux microlitres d’une solution riboside nicotinamide 100x.Transférer 100 microlitres de milieu basal 2x dans des puits pour le contrôle des taches. Graine 100 microlitres de cellules souches hématopoïétiques préparées sur le dessus des puits contenant 2x milieu basal. Ensemencer 100 microlitres de cellules entières de moelle osseuse sur des puits marqués comme des commandes de coloration.Ajouter 200 microlitres d’eau autoclavée dans tous les puits environnants pour réduire l’évaporation des puits contenant des cellules. Placez la plaque intacte dans un incubateur à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5 % pendant 72 heures. Sortez la plaque pour reconstituer le riboside nicotinamide toutes les 24 heures, et remettre dans l’incubateur.À la fin de la période de culture, ajouter deux microlitres de solution TMRM 100x et deux microlitres de solution de tache fluorescente verte 100x dans chacun des puits d’essai. Ajouter deux microlitres de 100x TMRM dans le puits de contrôle des taches TMRM. Ajouter deux microlitres de tache fluorescente verte 100x dans le puits de contrôle des taches MitoTracker.Couvrir le dessus de la plaque de papier d’aluminium. et remettre la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5 % pendant 45 minutes. Retirer la plaque de l’incubateur et la centrifuger à 300 fois g pendant cinq minutes.Inverser la plaque pour enlever le supernatant, et ajouter 200 microlitres de tampon FACS standard pour résuspendre. Couvrir la plaque de papier d’aluminium. Centrifuger la plaque à 300 fois g pendant cinq minutes.Répétez cette étape de lavage trois fois. Resuspendez les cellules en 200 microlitres de tampon FACS, et transférez-les dans des tubes FACS. Pour exécuter les échantillons sur le cytomètre d’écoulement, chargez d’abord les commandes de couleur unique dans la machine, et enregistrez au moins 5000 événements dans chacun par un.Dans le logiciel, appuyez sur Acquérir, puis Enregistrer sur le tableau de bord pour acquérir et enregistrer des commandes de couleur unique. Appuyez sur Configuration de la rémunération, et cliquez sur Calculer la compensation pour calculer la compensation. Une fois que la compensation a été appliquée, acquérir l’échantillon hématopoïétique de cellules souches, et enregistrer autant d’événements que possible.Exportez les fichiers FACS à partir du cytomètre et ouvrez le fichier sur le logiciel d’analyse. Sur FlowJo, utilisez la dispersion vers l’avant et la diffusion latérale pour identifier la population cellulaire. Identifiez les singlets dans les portes d’à côté, puis tracez la fraction négative DAPI représentant les cellules vivantes.Dans la porte cellulaire vivante, faire une parcelle de contour dans le TMRM et le canal vert tache fluorescente pour mesurer le potentiel de membrane mitochondriale et la masse, respectivement. Exportez l’intensité moyenne de fluorescence de ces deux canaux dans la porte des cellules vivantes. Ensuite, exportez la proportion de cellules dans la porte basse TMRM dans tous les échantillons.Le traitement de riboside de nicotinamide a montré une augmentation claire de la population basse de TMRM. Il a également augmenté de manière significative la proportion de cellules dans la porte basse de TMRM et a montré un abaissement significatif de l’intensité de fluorescence de TMRM. La masse mitochondrique n’a pas changé sur la supplémentation riboside de nicotinamide.En outre, la coloration de marqueur de cellules souches a été combinée avec la coloration mitochondrique post-culture. Avec la stratégie de gating pour identifier des cellules souches hématopoïétiques, l’exposition au riboside de nicotinamide a montré une augmentation significative de la population basse de TMRM et une diminution significative de l’intensité de fluorescence de TMRM dans les HSCs gated. Le signal vert vert vert de tache mitochondrique fluorescente est resté inchangé dans les deux conditions.Il est important de couvrir la plaque de coloration avec du papier d’aluminium afin de minimiser l’exposition de la lumière aux échantillons tachés. Cette méthode peut être combinée avec des analyses en aval telles que la transplantation de moelle osseuse et des analyses de formation de colonies pour déterminer la fonctionnalité de vos cellules souches. Cette technique permet donc une méthode de dépistage simple pour l’identification de nouveaux modulateurs métaboliques des HSC.

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Mesure de la masse mitochondriale et du potentiel membranaire dans les cellules souches hématopoïétiques et les lymphocytes T par cytométrie de flux (Vidéo) | JoVE Journal

Mesure de la masse mitochondriale et du potentiel membranaire dans les cellules souches hématopoïétiques et les lymphocytes T par cytométrie de flux

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