Name: Analyse quantitative du lipidome cellulaire de Saccharomyces Cerevisiae à l’aide de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Découvrez une méthode de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem pour quantifier dix classes lipidiques dans Saccharomyces cerevisiae. Cette technique permet la détection d'espèces isobariques et isomériques avec sensibilité.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous sommes reconnaissants aux membres actuels et anciens du laboratoire Titorenko pour les discussions. Nous remercions le Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry et le Centre for Structural and Functional Genomics (tous deux de l’Université Concordia) pour leurs services exceptionnels. Cette étude a été appuyée par des subventions du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie (NSERC) du Canada (RGPIN 2014-04482) et du Fonds de la chaire de l’Université Concordia (CC0113). K.M. a reçu l’appui du Prix du mérite de l’Université Concordia.

1. Préparation de supports stériles pour la culture de la levure
<ol><li>Préparer 90 ml d’un milieu VP complet qui contient 1% (w/v) extrait de levure et 2% (w/v) bactopeptone.</li>
	<li>Préparer 90 ml d’un milieu synthétique minimal de la BNNB contenant 0,67 % (w/v) base d’azote de levure sans acides aminés, 20 mg/L L-histidine, 30 mg/L L-leucine,30 mg/L L-lysine et 20 mg/L uracil. </li>
	<li>Répartir 90 ml du support total YP également en deux flacons Erlenmeyer de 250 ml (soit 45 ml chacun).</li>
	<li>Répartir 90 ml du milieu synthétique minimal YNB en deux flacons Erlenmeyer de 250 ml (soit 45 ml chacun).</li>
	<li>Autoclavez les flacons avec les médias YP et YNB à 15 psi/121 oC pendant 45 minutes avant utilisation.</li>
</ol>2. Souche de levure
<ol><li>Utilisez la souche de type sauvage BY4742(MATmd his3 '1 leu2 '0 lys2 '0 ura3 '0).</li>
</ol>3. Levure de culture dans le milieu complet de YP avec le glucose
<ol><li>Autoclave une solution de stock de 20% (w/v) de glucose à 15 psi/121 oC pendant 45 minutes avant utilisation.</li>
	<li>Ajoutez 5 ml de la solution stérile de 20 % (w/v) de glucose à chacun des deux flacons Erlenmeyer contenant le milieu stérile de YP pour une concentration finale de 2 % de glucose (w/v).</li>
	<li>Utilisez une boucle microbiologique pour inoculer les cellules de la souche de type sauvage BY4742 dans chacun des deux flacons Erlenmeyer contenant le milieu YP avec du glucose.</li>
	<li>Culture les cellules pendant la nuit à 30 oC avec secousses de rotation à 200 tr/min.</li>
	<li>Prenez un aliquot de la culture de levure. Utilisez un hémocytomètre pour déterminer le nombre total de cellules de levure par ml de culture.</li>
</ol>4. Transférer la levure et les cultiver dans le milieu synthétique minimal de la BNS avec du glucose
<ol><li>Ajoutez 5 ml de la solution stérile de 20 % (w/v) de glucose à chacun des deux flacons Erlenmeyer contenant le milieu stérile de YNB à une concentration finale de 2 % de glucose (w/v).</li>
	<li>Utilisez une pipette stérile pour transférer un volume de la culture de levure de nuit qui contient le nombre total de 5,0 x 107 cellules dans chacune des deux flacons Erlenmeyer contenant le milieu YNB avec du glucose.</li>
	<li>Culture les cellules pour au moins 24 h (ou plus, si l’expérience l’exige) à 30 oC avec secousses de rotation à 200 tr/min.</li>
</ol>5. Préparation des réactifs, des laboratoires et de l’équipement pour l’extraction des lipides
<ol><li>Préparer ce qui suit: 1) de haute qualité (-gt;99.9%) chloroforme; 2) de haute qualité (99,9%) méthanol; 3) 28 % (v/v) solution d’hydroxyde d’ammonium dans l’eau nano-pure; 4) perles de verre (lavées à l’acide, 425-600 m); 5) un vortex avec adaptateur approprié; 6) 15 mL tubes à centrifugeuse en verre à grande vitesse avec bouchons doublés de polytetrafluoroethylène; 7) 17:1 et 2:1 mélanges de chloroforme et de méthanol; 8) un mélange chloroforme/méthanol (2:1) avec 0,1% d’hydroxyde d’ammonium (v/v); 9) solution ABC (155 mM d’ammonium bicarbonate, pH à 8,0); 10) un mélange de normes lipidiques internes préparées dans un mélange de chloroforme et de méthanol tel qu’indiqué dans le tableau 1; et 11) flacons d’échantillon de verre de 2 ml avec des bouchons doublés de polytetrafluoroethylène pour l’extraction des lipides cellulaires.</li>
</ol>6. Préparation des réactifs, des laboratoires et de l’équipement pour LC
<ol><li>Préparer ce qui suit : 1) acetonitrile/2-propanol/nano-pure water (65:35:5) mélange; 2) un vortex avec adaptateur approprié; 3) un sonicateur à ultrasons; 4) flacons de verre avec inserts pour une plaque de puits; 5) un système LC équipé d’une pompe binaire, d’un degasser et d’un autosampler; 6) une colonne en phase inverse C18 (2,1 mm; 75 mm; taille de pores 130 euros; gamme de pH de 1-11) couplée à un système de pré-colonne; 7) mélange A : acétonitrile/eau (60:40); et 8) mélange B: isopropanol/acetonitrile (90:10).</li>
</ol>7. Extraction lipidique des cellules de levure
<ol><li>Prenez un aliquot de la culture de levure. Utilisez un hémocytomètre ou mesurez600 OD pour déterminer le nombre total de cellules de levure par ml de culture.</li>
	<li>Prenez un volume de culture de levure qui contient un nombre total de 5.0 x 107 cellules (3.3 unités OD600). Placez ce volume de culture dans un tube de microcentrifuge préchilled de 1,5 mL.</li>
	<li>Récoltez les cellules par centrifugation à 16 000 x g pendant 1 min à 4 oC. Jetez le supernatant.</li>
	<li>Ajouter 1,5 ml d’eau nano-pure glacée et laver les cellules par centrifugation à 16 000 x g pendant 1 min à 4 oC. Jetez le supernatant.</li>
	<li>Ajouter 1,5 ml de solution ABC glacée et laver les cellules par centrifugation à 16 000 x g pendant 1 min à 4 oC. Jetez le supernatant. La pastille cellulaire peut être stockée à -80 oC avant l’extraction des lipides.</li>
	<li>Pour commencer l’extraction des lipides, décongeler la boulette de cellules sur la glace.</li>
	<li>Réutilisez la pastille cellulaire dans 200 l’eau nano-pure glacée. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse en verre de haute résistance de 15 mL avec un bouchon doublé de polytetrafluoroethylène. Ajouter ce qui suit à ce tube : 1) 25 l de mélange de normes lipidiques internes préparées dans le mélange chloroforme/méthanol (2:1) ; 2) 100 l de 425-600 perles de verre lavées à l’acide; et 3) 600 l de mélange chloroforme/méthanol (17:1).</li>
	<li>Vortex le tube à grande vitesse pendant 5 minutes à température ambiante (RT) pour perturber les cellules.</li>
	<li>Vortex le tube à basse vitesse pendant 1 h à RT pour faciliter l’extraction des lipides.</li>
	<li>Incuber l’échantillon pendant 15 min sur la glace afin de favoriser les précipitations protéiques et la séparation des phases aqueuses et organiques les unes des autres.</li>
	<li>Centrifuger le tube dans une centrifugeuse clinique à 3.000 x g pendant 5 min à RT. Cette étape de centrifugation permet de séparer la phase aqueuse supérieure de la phase organique inférieure, qui contient toutes les classes de lipides.</li>
	<li>Utilisez une pipette en verre borosilicate pour transférer la phase organique inférieure (400 ll) à un autre tube de centrifugeuse en verre de 15 mL avec un bouchon doublé de polytetrafluoroethylène. Ne perturbez pas les perles de verre ou la phase aqueuse supérieure pendant un tel transfert. Maintenir la phase organique inférieure sous l’écoulement du gaz azoté.</li>
	<li>Ajouter 300 L de mélange chloroforme-méthanol (2:1) à la phase aqueuse supérieure restante pour permettre l’extraction de sphingolipids et PA, PS, PI et CL. Vortex le tube vigoureusement pendant 5 min à RT.</li>
	<li>Centrifuger le tube dans une centrifugeuse clinique à 3.000 x g pendant 5 min à RT.</li>
	<li>Utilisez une pipette en verre borosilicate pour transférer la phase organique inférieure (200 ll) formée après centrifugation à la phase organique recueillie à l’étape 7.13.</li>
	<li>Utilisez le flux de gaz azoté pour évaporer le solvant dans les phases organiques combinées. Fermez les tubes contenant le film lipidique sous l’écoulement du gaz azoté. Conservez ces tubes à -80 oC.</li>
</ol>8. Séparation des lipides extraits par LC
<ol><li>Ajouter 500 L d’acétyl/2-propanol/nano-pur water (65:35:5) mélange à un tube contenant le film lipidique obtenu à l’étape 7.16. Vortex le tube 3x pour 10 s à RT.</li>
	<li>Soumettez le contenu du tube à la sonication par ultrasons pendant 15 min. Vortex le tube 3x pour 10 s à RT.</li>
	<li>Prenez 100 L d’un échantillon du tube et ajoutez-le à une fiole de verre avec un insert utilisé pour une plaque de puits. Éliminez les bulles d’air dans l’insert avant de le arpenter dans le puits.</li>
	<li>Utilisez un système LC pour séparer différentes espèces lipidiques sur une colonne CSH en phase inverse C18 couplée à un système pré-colonne (voir Tableau des matériaux). Pendant la séparation, maintenez la colonne à 55 oC et à un débit de 0,3 ml/min. Conserver l’échantillon dans la plaque de puits à RT.</li>
	<li>Utilisez les phases mobiles qui se composent du mélange A (acetonitrile/eau [60:40 (v/v)]) et du mélange B (isopropanol/acetonitrile [90:10 (v/v)]). Pour un mode positif de détection des ions parentés créés à l’aide de la source d’ions d’ionisation électrospray (ESI), le mode ESI(MD), les phases mobiles A et B contiennent un format d’ammonium à la concentration finale de 10 mM. Pour un mode négatif de détection des ions parentaux, le mode ESI (-), les phases mobiles A et B contiennent de l’acétate d’ammonium à la concentration finale de 10 mM.</li>
	<li>Utilisez un volume d’échantillon de 10 L pour l’injection dans le mode ESI et ESI (-).</li>
	<li>Séparer différentes espèces lipidiques par LC à l’aide du gradient LC suivant : 0-1 min 10% (phase B); 1-4 min 60% (phase B); 4-10 min 68% (phase B); 10-21 97% (phase B); 21-24 min 97% (phase B); 24-33 min 10% (phase B).</li>
	<li>Exécuter les blancs d’extraction comme premier échantillon, entre tous les quatre échantillons, et comme dernier échantillon. Soustrayez l’arrière-plan pour normaliser les données.</li>
	<li>Un chromatogramme total représentatif d’ions provenant de données LC/MS sur les lipides extraits des cellules de la souche de type sauvage BY4742 est indiqué dans la figure 1.</li>
</ol>9. Analyse spectrométrique de masse des lipides séparés par LC
<ol><li>Utilisez un spectromètre de masse équipé d’une source d’ion ionaire HESI (électrospray) pour analyser les lipides qui ont été séparés par LC. Utilisez les paramètres fournis dans le tableau 2.</li>
	<li>Utilisez l’analyseur de transformation Fourier pour détecter les ions parent (MS1) à une résolution de 60 000 et dans la plage de masse de 150-2 000 Da.</li>
	<li>Utilisez les paramètres fournis dans le tableau 3 pour détecter les ions secondaires (MS2).</li>
</ol>10. Identification et quantitation de différentes classes et espèces de lipides par le traitement des données brutes de LC-MS/MS
<ol><li>Consultez le Tableau des matériaux pour les logiciels pour effectuer l’identification et la quantitation de différents lipides à partir de fichiers bruts LC-MS/MS. Ce logiciel utilise la plus grande base de données lipidique, contenant plus de 1,5 million de précurseurs d’ions lipidiques (MS1) et leurs ions fragmentés prévus (MS2). Le logiciel utilise également des pics MS1 pour la quantitation des lipides et MS2 pour l’identification des lipides. Un chromatogramme représentatif de deux formes de phosphatidylserine isomerique (34:0) qui ont la même valeur m/z, mais des temps de rétention différents, ainsi que leurs spectres MS1 et MS2, sont indiqués dans la figure 2, figure 3, et la figure 4, respectivement.</li>
	<li>Rechercher gratuitement des acides gras LC-MS contenant des données MS1 et des données MS2 dépendantes des données (non stéérisées), cardiolipin (CL), phytoceramide (PHC), phytosphingosine (PHS), phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylglycerol (PG), phosphatidylinositol (PI), phosphatidylserine (PS), et triacylglycerol (TAG) classes lipidiques en utilisant une tolérance m/z de 5 ppm pour les ions précurseurs et 10 ppm pour les ions de produit. D’autres paramètres de recherche sont indiqués dans le tableau 4. Suivez les instructions fournies dans le manuel d’utilisation du logiciel. Les identités des normes lipidiques internes et des espèces lipidiques avec la composition inhabituelle d’acide gras doivent être vérifiées manuellement.</li>
	<li>Pour identifier et quantifier différentes classes et espèces de lipides à l’aide d’alternatives open-source librement disponibles pour le logiciel lipidique de recherche, utilisez l’analyseur de données lipidiques (<a href="http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml" target="_blank">http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml</a>), MZmine 2 (<a href="http://mzmine.github.io/" target="_blank">http://mzmine.github.io/</a>), ou XCMS (<a href="https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html" target="_blank">https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html)</a>logiciel pour traiter les données brutes de LC-MS/MS.</li>
</ol>

<ol><li>Bou Khalil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics+era%3A+accomplishments+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Review%22%5BJournal%5D)">Lipidomics era: accomplishments and challenges.</a> Mass Spectrometry Review. 29 (6), 877-929 (2010).</li>
<li>Shevchenko, A., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics%3A+coming+to+grips+with+lipid+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipidomics: coming to grips with lipid diversity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).</li>
<li>Brügger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics%3A+analysis+of+the+lipid+composition+of+cells+and+subcellular+organelles+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Lipidomics: analysis of the lipid composition of cells and subcellular organelles by electrospray ionization mass spectrometry.</a> Annual Review of Biochemistry. 83, 79-98 (2014).</li>
<li>Zechner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAT+SIGNALS+-+lipases+and+lipolysis+in+lipid+metabolism+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">FAT SIGNALS - lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling.</a> Cell Metabolism. 15 (3), 279-291 (2012).</li>
<li>Eisenberg, T., Büttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipids+and+cell+death+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Lipids and cell death in yeast.</a> FEMS Yeast Research. 14 (1), 179-197 (2014).</li>
<li>Richard, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+liponecrosis%2C+a+distinct+mode+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Mechanism of liponecrosis, a distinct mode of programmed cell death.</a> Cell Cycle. 13 (23), 3707-3726 (2014).</li>
<li>Arlia-Ciommo, A., Svistkova, V., Mohtashami, S., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+the+discovery+of+anti-tumor+pharmaceuticals%3A+searching+for+activators+of+liponecrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">A novel approach to the discovery of anti-tumor pharmaceuticals: searching for activators of liponecrosis.</a> Oncotarget. 7 (5), 5204-5225 (2016).</li>
<li>Mårtensson, C. U., Doan, K. N., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+lipids+on+mitochondrial+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Effects of lipids on mitochondrial functions.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (1), 102-113 (2017).</li>
<li>Basu Ball, W., Neff, J. K., Gohil, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+non-bilayer+phospholipids+in+mitochondrial+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The role of non-bilayer phospholipids in mitochondrial structure and function.</a> FEBS Letters. 592 (8), 1273-1290 (2018).</li>
<li>Thakur, R., Naik, A., Panda, A., Raghu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+membrane+turnover+by+phosphatidic+acid%3A+cellular+functions+and+disease+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of membrane turnover by phosphatidic acid: cellular functions and disease implications.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 83(2019).</li>
<li>Goldberg, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+of+lipid+droplets+in+regulating+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">A novel function of lipid droplets in regulating longevity.</a> Biochemical Society Transactions. 37 (5), 1050-1055 (2009).</li>
<li>Kohlwein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obese+and+anorexic+yeasts%3A+experimental+models+to+understand+the+metabolic+syndrome+and+lipotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Obese and anorexic yeasts: experimental models to understand the metabolic syndrome and lipotoxicity.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 222-229 (2010).</li>
<li>Titorenko, V. I., Terlecky, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+metabolism+and+cellular+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Peroxisome metabolism and cellular aging.</a> Traffic. 12 (3), 252-259 (2011).</li>
<li>Henry, S. A., Kohlwein, S. D., Carman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+regulation+of+glycerolipids+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Metabolism and regulation of glycerolipids in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 190 (2), 317-349 (2012).</li>
<li>Kohlwein, S. D., Veenhuis, M., vander Klei, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+and+peroxisomes%3A+key+players+in+cellular+lipid+homeostasis+or+a+matter+of+fat--store+%27em+up+or+burn+%27em+down%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets and peroxisomes: key players in cellular lipid homeostasis or a matter of fat--store 'em up or burn 'em down.</a> Genetics. 193 (1), 1-50 (2013).</li>
<li>Baile, M. G., Lu, Y. W., Claypool, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+topology+and+regulation+of+cardiolipin+biosynthesis+and+remodeling+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">The topology and regulation of cardiolipin biosynthesis and remodeling in yeast.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 179, 25-31 (2014).</li>
<li>Dimmer, K. S., Rapaport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+contact+sites+as+platforms+for+phospholipid+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial contact sites as platforms for phospholipid exchange.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (1), 69-80 (2017).</li>
<li>Csordás, G., Weaver, D., Hajnóczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum-mitochondrial+contactology%3A+structure+and+signaling+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum-mitochondrial contactology: structure and signaling functions.</a> Trends in Cell Biology. 28 (7), 523-540 (2018).</li>
<li>Mitrofanova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolism+and+transport+define+longevity+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience+%28Landmark+Edition%29%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolism and transport define longevity of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 23, 1166-1194 (2018).</li>
<li>Tamura, Y., Kawano, S., Endo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+contact+zones+as+sites+for+lipid+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Organelle contact zones as sites for lipid transfer.</a> Journal of Biochemistry. 165 (2), 115-123 (2019).</li>
<li>Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeissman%2C+J+%22Guide+to+Yeast+Genetics%3A+Functional+Genomics%2C+Proteomics%2C+and+Other+Systems+Analyses%22">Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses</a>. , Academic Press. Burlington. (2010).</li>
<li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast%3A+an+experimental+organism+for+21st+Century+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Yeast: an experimental organism for 21st Century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li>
<li>Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Budding+yeast+for+budding+geneticists%3A+a+primer+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system.</a> Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).</li>
<li>Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+surrogate+and+chemical+genetics+in+model+organisms+can+suggest+therapies+for+human+genetic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases.</a> Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).</li>
<li>Zimmermann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+as+a+tool+to+identify+anti-aging+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Yeast as a tool to identify anti-aging compounds.</a> FEMS Yeast Research. 18 (6), (2018).</li>
<li>Ejsing, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+the+yeast+lipidome+by+quantitative+shotgun+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).</li>
<li>Guan, X. L., Riezman, I., Wenk, M. R., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+lipid+analysis+and+quantification+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Yeast lipid analysis and quantification by mass spectrometry.</a> Methods in Enzymology. 470, 369-391 (2010).</li>
<li>Guan, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+membrane+lipidomics+during+Drosophila+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development.</a> Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).</li>
<li>Klose, C., Tarasov, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+yeast+lipids+by+shotgun+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Profiling of yeast lipids by shotgun lipidomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1361, 309-324 (2016).</li>
<li>Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+advances+in+shotgun+lipidomics+for+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine.</a> Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).</li>
<li>Sud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LMSD%3A+LIPID+MAPS+structure+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">LMSD: LIPID MAPS structure database.</a> Nucleic Acids Research. 35 (Database issue), D527-D532 (2007).</li>
<li>Pauling, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposal+for+a+common+nomenclature+for+fragment+ions+in+mass+spectra+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Proposal for a common nomenclature for fragment ions in mass spectra of lipids.</a> PLoS One. 12 (11), e0188394(2017).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les précautions suivantes sont importantes pour la mise en œuvre réussie du protocole décrit ici :
1. Le chloroforme et le méthanol sont toxiques. Ils extraient efficacement diverses substances des surfaces, y compris la plasticware de laboratoire et votre peau. Par conséquent, manipuler ces solvants organiques avec prudence en évitant l’utilisation de plastiques dans les étapes qui impliquent le contact avec le chloroforme et / ou le méthanol, en utilisant des pipettes en verre borosilicate p...

Un ensemble de preuves indique que les lipides, l’une des principales classes de biomolécules, jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus vitaux au sein d’une cellule eucaryote. Ces processus comprennent l’assemblage de bilayers lipidiques qui constituent la membrane plasmatique et les membranes entourant les organites cellulaires, le transport de petites molécules à travers les membranes cellulaires, la réponse aux changements de l’environnement extracellulaire et la transduction intracellulaire du signal, la production et le stockage de l’énergie, l’importation et l’exportation de protéines confinées à différents organites, le trafic vésicular des protéines dans le système endomémbrane et la sécrétion de protéines, et plusieurs modes de la cellule de mort réglementée1 ,2,3,4,5,6,7,8,9,10.
La levure en herbe S. cerevisiae, un organisme eucaryote unicellulaire, a été utilisé avec succès pour découvrir certains des mécanismes sous-jacents aux rôles essentiels des lipides dans ces processus cellulaires vitaux4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 ,16,17,18,19,20. S. cerevisiae est un organisme modèle précieux pour découvrir ces mécanismes parce qu’il est favorable à la biochimie complète, génétique, biologique cellulaire, biologique chimique, biologique du système biologique, et microfluidique dissection analyses21,22,23,24,25. D’autres progrès dans la compréhension des mécanismes par lesquels le métabolisme lipidique et le transport intracellulaire contribuent à ces processus cellulaires vitaux nécessite des technologies sensibles de spectrométrie de masse pour la caractérisation quantitative du lipidome cellulaire, la compréhension de la complexité moléculaire lipidome, et l’intégration de lipidomiques quantitatifs dans une plate-forme multidisciplinaire de biologie des systèmes1,2,3,26, 27,28,29,30.
Les méthodes actuelles pour la lipidomique quantitative de masse assistée par spectrométrie des cellules et des cellules de levure d’autres organismes eucaryotes ne sont pas suffisamment polyvalentes, robustes ou sensibles. En outre, ces méthodes actuellement utilisées sont incapables de différencier diverses espèces de lipides isobariques ou isomériques les unes des autres. Ici, nous décrivons une méthode polyvalente, robuste et sensible qui permet l’utilisation de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem (LC-MS/MS) pour l’analyse quantitative des lipides cellulaires majeurs de S. cerevisiae.

<table><tbody><tr><td>15 mL Tubes à centrifuger en verre haute vitesse avec bouchons doublés de téflon</td><td>PYREX</td><td>05-550</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Flacons d’échantillons en verre avec bouchons doublés de téflon</td><td>Fisher Scientific</td><td>60180A-SV9-1P</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A461-500</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>A9554</td><td></td></tr><tr><td>Agilent série 1100 Système LC</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1312A</td><td></td></tr><tr><td>Agilent1100 Plaque de puits</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1367A</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’ammonium</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11450</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate d’ammonium</td><td>Sigma</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Formiate d’ammonium</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11550</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde d’ammonium</td><td>Fisher Scientific</td><td>A470-250</td><td></td></tr><tr><td>Bactopeptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420-2</td><td></td></tr><tr><td>Cardiolipin</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>750332</td><td></td></tr><tr><td>Centra CL2 centrifugeuse clinique</td><td>Thermo Scientific</td><td>004260F</td><td></td></tr><tr><td>Céramide</td><td>Avanti Lipides polaires</td><td>860517</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Fisher Scientific</td><td>C297-4</td><td></td></tr><tr><td>CSH C18 VanGuard</td><td>Eaux</td><td>186006944</td><td>Système de pré-colonne</td></tr><tr><td>Acide gras libre (19:0)</td><td>Matreya</td><td>1028</td><td></td></tr><tr><td>Perles de verre (lavées à l’acide, 425-600 &mu ; M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>Hémacytomètre</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>L-histidine</td><td>Sigma</td><td>H8125</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de recherche lipidique (V4.1)</td><td>Fisher Scientific</td><td>V4.1</td><td>Logiciel d’analyse LC-MS/MS</td></tr><tr><td>L-leucine</td><td>Sigma</td><td>L8912</td><td></td></tr><tr><td>L-lysine</td><td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4564</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylcholine</td><td>Avanti Lipides polaires</td><td>850340</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidyléthanolamine</td><td>Avanti Lipides polaires</td><td>850704</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylglycérol</td><td>Avanti Lipides polaires</td><td></td><td></td>840446</tr><tr><td>Phosphatidylinositol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>LM1502</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylsérine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840028</td><td></td></tr><tr><td>Colonne en phase inverse CSH C18</td><td>Waters</td><td>186006102</td><td></td></tr><tr><td>Sphingosine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860669</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Orbitrap Velos MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>ETD-10600</td><td></td></tr><tr><td>Tricylglycérol</td><td>Larodan, Malmö</td><td>TAG Mixte FA</td><td></td></tr><tr><td>Sonicateur à ultrasons</td><td>Fisher Scientific</td><td>15337416</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Base azotée de levure sans acides aminés</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0919-15-3</td><td></td></tr><tr><td>Souche de levure BY4742</td><td>Dharmacon</td><td>YSC1049</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse quantitative du lipidome cellulaire de saccharomyces cerevisiae à l’aide de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Les lipides sont des molécules amphipathiques structurellement diverses qui sont insolubles dans l’eau. Les lipides sont des facteurs essentiels à l’organisation et à la fonction des membranes biologiques, du stockage et de la production d’énergie, de la signalisation cellulaire, du transport vésiculaire des protéines, de la biogenèse d’organelle et de la mort cellulaire réglementée. Parce que la levure naissante Saccharomyces cerevisiae est un eucaryote unicellulaire favorable à des analyses moléculaires approfondies, son utilisation comme un organisme modèle a aidé à découvrir des mécanismes reliant le métabolisme des lipides et le transport intracellulaire à des processus biologiques complexes dans les cellules eucaryote. La disponibilité d’une méthode d’analyse polyvalente pour l’évaluation quantitative robuste, sensible et précise des grandes classes de lipides au sein d’une cellule de levure est cruciale pour obtenir des connaissances approfondies sur ces mécanismes. Ici, nous présentons un protocole pour utiliser la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem (LC-MS/MS) pour l’analyse quantitative des lipides cellulaires principaux de S. cerevisiae. La méthode LC-MS/MS décrite est polyvalente et robuste. Il permet l’identification et la quantification de nombreuses espèces (y compris différentes formes isobariques ou isomériques) dans chacune des 10 classes de lipides. Cette méthode est sensible et permet l’identification et la quantitation de certaines espèces lipidiques à des concentrations aussi basses que 0,2 pmol/L. La méthode a été appliquée avec succès à l’évaluation des lipidomes des cellules entières de levure et de leurs organites purifiés. L’utilisation d’additifs alternatifs de phase mobile pour la spectrométrie de masse d’ionisation électrospray dans cette méthode peut augmenter l’efficacité de l’ionisation pour certaines espèces lipidiques et peut donc être utilisée pour améliorer leur identification et leur quantitation.

Notre méthode pour une évaluation quantitative des lipides cellulaires principaux dans une cellule de levure avec l’aide de LC-MS/MS était polyvalente et robuste. Il nous a permis d’identifier et de quantifier 10 différentes classes de lipides dans les cellules de la Cérévisiae de S. cultivées dans le milieu minimal synthétique de YNB contenant initialement 2% de glucose. Ces classes de lipides comprennent les acides gras gratuits (non stérilisés) (FFA), CL, phytoceramide (PHC), ...

Nous présentons un protocole utilisant la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem pour identifier et quantifier les lipides cellulaires principaux dans saccharomyces cerevisiae. La méthode décrite pour une évaluation quantitative des classes lipidiques majeures dans une cellule de levure est polyvalente, robuste et sensible.

Analyse quantitative du lipidome cellulaire de Saccharomyces Cerevisiae à l’aide de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Ce protocole fournit une méthode précise et reproductible pour quantifier dix classes lipidiques différentes de Saccharomyces cerevisiae à l’aide d’une méthode d’extraction unique et d’une seule méthode LC-MS. Cette méthode permet la détection et la quantification d’espèces lipidiques isobariques et isomériques ayant des propriétés chimiques et physiques différentes. Pour la culture des cerevisiae saccharomyces, ajoutez d’abord 5 ml de solution stérile de stock de glucose à chacune des deux flacons Erlenmeyer contenant du milieu stérile YNB à une concentration finale de 2 % de glucose.Ensuite, utilisez une pipette stérile pour transférer un volume d’une culture de levure de nuit contenant cinq fois dix à la septième cellule de levure dans chaque flacon et la culture des flacons pendant au moins 24 heures à 30 degrés Celsius avec rotation secouant à 200 révolutions par minute. Pour l’extraction des lipides, déterminer le nombre total de cellules de levure par millilitre de culture et transférer cinq fois dix à la septième cellule dans un tube centrifugeuse de 15 ml. Ajouter de l’eau nano-pure glacée pour porter le volume total jusqu’à 15 ml et recueillir les cellules par centrifugation.Suspendre à nouveau la pastille de levure dans 15 ml de tampon de bicarbonate d’ammonium iso-tonique glacé pour une deuxième centrifugation et suspendre à nouveau la pastille dans 1,5 ml de solution de bicarbonate d’ammonium glacé frais. À la fin de la centrifugation, conserver la pastille à 80 degrés Celsius jusqu’à l’extraction. Pour commencer l’extraction des lipides, décongeler la pastille cellulaire sur la glace avant de suspendre à nouveau les cellules dans 200 microlitres d’eau glacée nano-pure.Dans une hotte à vapeur, transférer la suspension cellulaire dans un verre à haute résistance de 15 ml, visser le tube de centrifugeuse avec un bouchon doublé de polytétrafluoroéthylène et ajouter 25 microlitres d’un mélange interne de normes lipidiques, préparé en méthanol chloroforme 2:1. 100 microlitres de 425 à 600 perles de verre lavées à l’acide micromolaire et 600 microlitres d’un méthanol chloroforme 17:1 au tube. Vortex le tube à grande vitesse pendant cinq minutes à température ambiante pour perturber les cellules.Suivi d’un vortex d’une heure à basse vitesse à température ambiante pour faciliter l’extraction des lipides. À la fin de l’extraction, incuber l’échantillon pendant 15 minutes sur la glace, afin de favoriser les précipitations protéiques et la séparation des phases aqueuse et organique. À la fin de l’incubation, centrifugeuse de l’échantillon pour séparer davantage la phase aqueuse supérieure de la phase organique inférieure et, dans le capot de fumée, utiliser une pipette en verre borosilicate pour transférer la phase organique inférieure à un nouveau tube centrifugeuse supérieure à vis en verre de 15 ml de haute résistance avec un bouchon doublé de polytétrafluoroéthylène.Placez la phase organique inférieure sous l’écoulement du gaz azoté et, dans le capot des vapeurs, ajoutez 300 microlitres d’un mélange de méthanol chloroforme 2:1 à la phase aqueuse supérieure restante. Pour faciliter l’extraction de phosphatidicacid, phosphatidylserine, phosphatidylinositol et extraction cardio-lipidique vortex le tube vigoureusement pendant cinq minutes à température ambiante avant de centrifuger l’échantillon. Utilisez une pipette en verre borosilicate pour transférer la phase organique inférieure dans la phase organique inférieure sous azote et évaporer le solvant dans les phases organiques combinées dans le capot de fumée.Ensuite, fermez les tubes de film lipidique sous le flux de gaz azoté et stockez les échantillons à 80 degrés Celsius. Pour la chromatographie liquide, séparation des lipides extraits à 500 microlitres d’un mélange d’eau nano-pure de 63:35:5 aceto-nitrile-2-propanol au tube du film lipidique et du vortex trois fois pendant dix secondes par vortex à température ambiante. Soumettons le contenu du tube à la sonication ultrasonique pendant 15 minutes avant de vortexer le tube trois fois pendant dix secondes par vortex comme vient de le démontrer.Transférer 100 microlitres de l’échantillon dans un flacon de verre avec un insert utilisé pour une plaque de puits 24 et éliminer les bulles dans l’insert. Placez l’insert dans un puits d’une plaque de puits de 24 puits et chargez une colonne CSH de phase C18 inversée couplée à une pré-colonne dans le système de chromatographie liquide. Réglez la température de la colonne à 55 degrés Celsius et le débit à 300 microlitres par minute.Lorsque tous les paramètres ont été définis, chargez dix microlitres d’une extraction vierge avant de charger le premier échantillon. Ensuite, séparez les différentes espèces lipidiques en utilisant le gradient chromatographie liquide, comme indiqué. Un chromatogramme total représentatif d’ion des données de LC-MS pour les lipides extraits des cellules sera généré.Pour l’analyse spectrométrique de masse des lipides extraits, chargez les échantillons sur un spectromètre de masse équipé d’une source d’ionisation par électro-pulvérisation chauffée et définissez les paramètres d’analyse tels qu’ils sont décrits dans le tableau. Utilisez l’analyseur Fourier Transform pour détecter les ions parent MS-1 à une résolution de 60 000 et dans la plage de masse de 150-2000 daltons. Ensuite, détectez les ions secondaires MS-2 à l’aide des paramètres indiqués dans le tableau.Pour identifier et quantifier les différents lipides des fichiers LC-MS en tandem, recherchez gratuitement les fichiers bruts LC-MS contenant des données MS-1 complètes et des données MS-2 dépendantes des données, acides gras non stérilisés, cardio-lipides, phytocerimide, phytosphyngocène, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatydlglycérol, phosphatydlinositol, phosphatydlserine et triacylglycérol classes lipidiques en utilisant une masse divisée par tolérance de charge de cinq parties par million pour les ions précurseurs et dix parties par million pour les ions produits. Ensuite, suivez les instructions fournies dans le manuel de l’utilisateur du logiciel pour identifier les normes lipidiques internes et les espèces lipidiques avec des compositions inhabituelles en acides gras. Cette méthode sensible en tandem LC-MS permet l’identification et la quantification d’espèces moléculaires de lipides à des concentrations aussi faibles que 0,165 picomolaire par microlitre.Cette limite de quantification diffère des différentes classes lipidiques dans un large éventail de concentrations. Cette méthode peut être utilisée pour augmenter l’efficacité de l’ionisation des lipides en utilisant des additifs de phase mobiles alternatifs pour la spectrométrie de masse d’ionisation électrospray. Chacun de ces additifs de phase mobiles alternatifs peut être utilisé à la fois pour la phase normale et les colonnes LC de phase inverse.La méthode de dissociation induite par collision est bénéfique si elle est utilisée en combinaison avec l’additif de phase mobile d’acétium pour le mode négatif d’ionisation électro-pulvérisation de spectrométrie de masse, car, dans ces conditions, il permet l’augmentation de l’efficacité de la fragmentation des ion lipidiques MS-1 en produits MS-2. En revanche, la méthode de dissociation collisionnelle à haute énergie est favorable si elle est utilisée en combinaison avec l’additif de phase mobile formate ammonium pour le mode positif de spectrométrie de masse d’ionisation par électro-pulvérisation car dans ces conditions, elle permet une augmentation de l’efficacité de la fragmentation des ion lipidiques MS-1 dans les produits MS-2. Ne mélangez pas les phases lors de la collecte de la phase organique.Fermer les tubes sous l’écoulement du gaz azoté. Éliminez toute bulle dans l’insert et connectez la colonne dans la bonne direction. Si l’identité d’un pic ne peut être déterminée par la LC-MS, MS-NMR peut être utilisé pour déduire la structure de cette molécule.

quantitative-analysis-cellular-lipidome-saccharomyces-cerevisiae

Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Ici, nous décrivons une nouvelle technique quantitative en protéomique pour identifier les complexes protéiques chez Saccharomyces cerevisiae. Dans cette étude, nous avons utilisé la méthode SILAC avec purification par affinité suivie par spectrométrie de masse en tandem afin d'identifier avec une grande spécificité les partenaires de liaison d'une protéine ER, Scs2p.

Identification des complexes protéiques avec la protéomique quantitative chez S. cerevisiae

Description d'une procédure de phosphorylation quantitative à l'aide cryolysis, solubilziation urée, de fractionnement et l'enrichissement HILIC IMAC de peptides phosphorylés.

Phosphoprotéomique quantitatives en acide gras Stimulé Saccharomyces cerevisiae</em

Nous décrivons une nouvelle méthode quantitative lipidomique pour identifier les espèces de lipides dans la levure à l'aide de nombreuses enquêtes-scan spectrométrie de masse electrospray ionisation (ESI / MS). Cette méthode dépasse actuellement les méthodes disponibles pour l'identification et la quantification des lipides dans la capacité à résoudre les diverses formes moléculaires de lipides, la sensibilité et la vitesse.

Une évaluation quantitative du lipidome levure en utilisant la spectrométrie de masse électrospray ionisation

Ce protocole démontrera l’extraction et l’analyse des acides gras bioactifs libres et estérifiés à partir de cellules. Les acides gras sont quantifiés avec précision à l’aide de la dilution d’isotopes stables, de la chromatographie liquide chirale, de la capture d’électrons, de l’ionisation chimique atmosphérique, de la surveillance de réactions multiples, de la spectrométrie de masse (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

L&#39;extraction des lipides cellulaires pour ciblées dilution isotopique stable analyse de spectrométrie de masse chromatographie liquide-

Ici, nous présentons un protocole pour quantifier et qualifier chaque espèce de sphingomyéline multiple réaction sous contrôle et le mode MS/MS/MS, respectivement.

Méthode quantitative et Qualitative de sphingomyéline par LC-MS à l’aide de deux Stable isotopiquement étiquetés sphingomyéline espèces

Ici, nous présentons une implémentation de MATLAB de la détection automatisée et de la description quantitative des gouttelettes de lipide dans les images de microscopie de fluorescence des cellules de fission et de levure en herbe.

Analyse du contenu des gouttelettes lipidiques dans les levures de fission et les levures en herbe à l'aide du traitement automatisé de l'image

Nous présentons un protocole pour l’identification et la quantification des principales classes de métabolites solubles dans l’eau dans la levure Saccharomyces cerevisiae. La méthode décrite est polyvalente, robuste et sensible. Il permet de séparer les isomères structurels et les formes stéréoisomériques de métabolites solubles dans l’eau les uns des autres.

Métabolomique quantitative de Saccharomyces Cerevisiae par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem

Ici, un protocole est présenté pour le profilage métabolique de la levure avec de l’acide 14C-acétique, qui est couplé à la chromatographie sur couche mince pour la séparation des lipides neutres.

Analyse de la synthèse lipidique neutre chez Saccharomyces cerevisiae par marquage métabolique et chromatographie sur couche mince

Les protocoles décrivent des méthodes de chromatographie liquide à haute performance couplées à la détection de l’indice de réfraction ou de la spectrométrie de masse pour l’étude des réactions métaboliques dans des systèmes complexes sans cellules à base de lysate.

Chromatographie liquide couplée à la détection par spectrométrie de réfraction ou de masse pour le profilage de métabolites dans des systèmes sans cellules à base de lysate

flexibilité conformationnelle joue un rôle essentiel dans la fonction des protéines. Nous décrivons ici l'utilisation de la spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation couplée à l'échange hydrogène-deutérium résolue dans le temps pour sonder les changements structurels rapides qui favorisent la fonction des protéines ordonné et désordonné.

Résolue en temps d&#39;échange hydrogène Ionisation ElectroSpray-deuterium spectrométrie de masse pour l&#39;étude de la structure des protéines et dynamique

Découvrez une méthode de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem pour quantifier dix classes lipidiques dans Saccharomyces cerevisiae. Cette technique permet la détection d'espèces isobariques et isomériques avec sensibilité.

Analyse quantitative du lipidome cellulaire de Saccharomyces Cerevisiae à l’aide de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem (Vidéo) | JoVE Journal

Analyse quantitative du lipidome cellulaire de Saccharomyces Cerevisiae à l’aide de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem

Explorer plus de vidéos