Préparation d’échantillons biologiques pour la spéciation à température cryogénique à l’aide de la spectroscopie d’absorption de rayons X à haute résolution

Ce protocole a été normalisé pour les spécimens cellulaires, permettant la comparaison d’expériences en cours à différents endroits synchrotron. Le principal avantage de cette technique est un flux de travail simple et direct qui permet une préservation rapide et fiable de l’intégration chimique de l’échantillon. Les personnes novices dans cette technique peuvent avoir du mal avec l’engrenage des cellules itérées congelées et le chargement rapide de la pastille cellulaire dans l’ordre du cryoéchantillonnage.

Un découplage précis et rapide d’un échantillon en température cryogénique est essentiel. En tant que tel, une démonstration visuelle est essentielle pour comprendre comment exécuter la technique. Pour préparer les pastilles de lignées cellulaires du cancer de la prostate et de l’ovaire humain à la spéciation du sélénium, ensemencez le nombre approprié de cellules de chaque lignée cellulaire dans trois flacons T-75 par condition dans le milieu de culture cellulaire approprié dans une hotte à flux laminaire et placez les flacons dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et à 5% de dioxyde de carbone jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 80%.

Pour exposer les cellules cancéreuses au traitement au sélénium, il faut d’abord soniquer des solutions mères de nanoparticules fraîchement préparées dans un bain-marie à ultrasons pendant 30 minutes à température ambiante avant de diluer en série la solution de nanoparticules de sélénium dans un milieu de culture cellulaire complet aux concentrations de travail appropriées. Dans la hotte à écoulement laminaire, lavez doucement les cellules deux fois avec cinq millilitres de PBS de 37 degrés Celsius par lavage et utilisez une pipette stérile de 25 millilitres pour ajouter soigneusement 15 millilitres du traitement au sélénium d’intérêt au fond de la fiole. Fermez les couvercles sans sceller complètement la fiole et placez les flacons horizontalement dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures.

Pour préparer les granulés cellulaires après le lavage et le réapprovisionnement du milieu de culture, utilisez un grattoir cellulaire par flacon pour détacher doucement les cellules. Utilisez un milieu pour rincer toutes les cellules collées à la fiole dans le surnageant et recueillir les cellules dissociées par centrifugation. Lavez les granulés deux fois sur cinq millilitres de PBS par tube et par lavage pour éliminer toutes les traces restantes du traitement et resusciter les cellules dans un millilitre de PBS.

Transférer les cellules dans un tube de polypropylène de 1,5 millilitre et prélever les cellules avec une autre centrifugation. Utilisez ensuite une pipette de 200 microlitres pour retirer doucement tout le surnageant et plonger la partie inférieure de chaque tube de 1,5 millilitre dans de l’azote liquide au niveau de la pastille de la cellule. Immédiatement après la congélation, transférer les tubes dans un dewar d’azote liquide pour un stockage à long terme.

Pour la spectroscopie d’absorption de rayons X à haute résolution, optimisez tous les cristaux du spectromètre de l’analyseur de cristaux dans des conditions de Bragg par rapport à l’énergie de la ligne de fluorescence d’intérêt et utilisez une référence pour laquelle la position énergétique du bord d’absorption est connue pour calibrer l’énergie du faisceau monochromatique incident. Transférer le porte-échantillon dans un cryostat d’hélium liquide pour les échantillons biologiques et régler le cryostat à 10 degrés Kelvin, puis fermer le clapier expérimental en suivant les règles de sécurité du synchrotron et commencer l’analyse. Ici, les spectres représentatifs de spectroscopie d’absorption des rayons X à haute résolution du sélénium à l’état initial et dans les cellules incubées en milieu nutritif démontrent que le sélénium dans les nanoparticules initiales de sélénium était présent à la fois sous forme de sélénium zéro et de forme semblable à la cellulite.

Après les interactions avec les cellules PC3, cependant, le sélénium était principalement présent dans les cellules sous forme de sélénium zéro, démontrant un changement d’espèces de sélénium dans les cellules. Pour le fer, les spectres de référence de la spectroscopie d’absorption des rayons X à haute résolution présentent des positions de bord distinctes en fonction de l’état d’oxydation du fer, avec des espèces réduites de fer déplacées vers des valeurs de faible énergie. Deux spectres successifs collectés sur la même position d’une pastille de diatomée étaient similaires, indiquant que les dommages au faisceau étaient limités entre deux acquisitions lors de l’utilisation d’un cryostat d’hélium à 10 Kelvin.

De plus, les spectres des différentes positions de la pastille de diatomée étaient identiques, ce qui démontrait que la pastille de l’échantillon était homogène et que les spectres pouvaient être moyennés pour obtenir un meilleur spectre de rapport signal/bruit. Les étapes les plus critiques sont la préparation du diltuion de nanoparticules, la granulation à température cryogénique et la préparation des échantillons de référence standard. Cette procédure peut être appliquée à d’autres techniques d’analyse en vrac, telles que ICP-MS ou HPLC-ICP-MS ou à d’autres techniques spectroscopiques non synchrotron pouvant être réalisées à température cryogénique.

D’autres questions scientifiques peuvent être explorées à l’aide de cette procédure, en particulier dans les domaines de la biogéologie, de la biochimie et des sciences de l’environnement ou de la recherche en toxicologie. Les composés de sélénium et les nanoparticules de sélénium peuvent être aussi difficiles pour votre santé et doivent être manipulés dans une hotte chimique dédiée à l’aide de gants, de lunettes et d’un masque facial.