Name: Un test d’excroissance de neurite et évaluation de neurotoxicité avec des neurones neuronaux progéniteurs humains dérivés des cellules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T15:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Découvrez un test d'excroissance de neurite et d'évaluation de neurotoxicité utilisant des progéniteurs neuronaux humains. Cette méthode offre une pertinence physiologique élevée pour le criblage de médicaments.

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Cette recherche a été financée par la subvention de recherche nimad (940714) accordée au CRG.

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<li>Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+brain+in+a+dish%3A+the+promise+of+iPSC-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons.</a> Cell. 145 (6), 831-834 (2011).</li>
<li>Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomic+phenotyping+of+cell+lines+and+primary+cells+to+assess+preservation+of+cell+type-specific+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).</li>
<li>Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+protein+profiling+of+primary+versus+immortalized+human+RPE+cells+identifies+expression+patterns+associated+with+cytoskeletal+remodeling+and+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival.</a> Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).</li>
<li>Yeo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Neural+Lineages+as+In+Vitro+Models+for+Screening+the+Neuroprotective+Properties+of+Lignosus+rhinocerus+%28Cooke%29+Ryvarden%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden.</a> BioMed Research International. 2019, (2019).</li>
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Tous les auteurs n’indiquent aucun conflit d’intérêts potentiel.

Ce protocole est l’un des rares articles publiés décrivant le test de longueur de neurite lors du traitement avec des composés d’essai. En outre, nous décrivons comment employer des hNPC pour un essai de neure de excroissance et évaluation de neurotoxicité. En utilisant cet essai d’excroissance de neure et l’évaluation de neurotoxicité sur les neurones dérivés des HNPC, le potentiel neurogénique d’une catégorie de composés épigénétiques à petites molécules, inhibiteurs du HDAC, dans l’induction de la croissance des neuri...

La croissance de la neurite est un processus fondamental pour la formation du réseau neuronal et la régénération nerveuse1,2. À la suite d’une blessure, l’excroissance de la neurite joue un rôle clé dans la régénération du système nerveux. L’excroissance de neurite est également un élément important de la signalisation extracellulaire en induisant des activités régénératrices neuronales pour améliorer les résultats pour les désordres neurodégénératifs et les dommages neuronaux3,4,5,6.
En maintenant leur potentiel de différenciation dans la production de diverses lignées neuronales, les cellules progénitrices neuronales humaines (hNPC) pourraient fournir un système modèle pour l’étude de la fonction et du développement du système nerveux central (SNC)7,8,9. Le potentiel translationnel élevé et la pertinence physiologique des HNPC en tant que modèle primaire de cellules humaines offrent un avantage considérable dans les dépistages de découverte de drogue liés à l’excroissance de neurite. Toutefois, l’entretien et l’échelle des modèles de cellules primaires pour les tests à haut débit pourraient prendre beaucoup de temps et10,11,12,13.
En plus de l’application de la méthode présentée dans les études sur l’excroissance de la neurite, l’évaluation de la neurotoxicité est une autre application utilisant les neurones dérivés du HNPC. Il y a des milliers de composés chimiques commerciaux qui ne sont pas examinés ou avec un potentiel de neurotoxicité mal compris. Par conséquent, des expériences de dépistage plus fiables et plus efficaces pour évaluer, distinguer et classer les composés en fonction de leur potentiel pour susciter une neurotoxicité développementale sont très demandées14. L’augmentation de la prévalence et de l’incidence des troubles neurologiques ainsi que l’abondance de composés non testés dans l’environnement nécessite le développement d’expériences plus fiables et efficaces pour identifier les composés environnementaux dangereux qui peuvent poser la neurotoxicité15.
La méthode présentée ici peut être utilisée pour dépister la capacité des composés à induire l’excroissance de la neurite et la neurotoxicité en profitant des neurones humains dérivés des cellules progéniteurs, un modèle cellulaire représentant étroitement la biologie humaine.

<table><tbody><tr><td>Lames de chambre en verre à 4 puits</td><td>Sigma</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>R37117</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique-Antimycotique</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&beta ;-Tubulin III</td><td>Thermo</td><td>MA1-118X</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermo</td><td></td><td></td>17504001</tr><tr><td>B27 - moins la vitamine A</td><td>Thermo</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell</td><td>Corning</td><td>432000</td><td>Conteneurs de congélation cellulaire assurant un taux contrôlé standardisé -1&#176 ; C/minute de congélation dans un -80&#176 ; C congélateur</td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>StemCell Technologies</td><td>7930</td><td>Milieu de cryoconservation contenant 10 % de DMSO</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>34869-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Gibco</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>FGF</td><td>Gibco</td><td>PHG6015</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Thermo</td><td>FB002</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PeproTech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>L-alanyl-L-glutamine supplément</td></tr><tr><td>sérum de chèvre</td><td>Thermo</td><td>50062Z</td><td></td></tr><tr><td>héparine</td><td>Calbiochem</td><td>375095</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Acide L-ascorbique</td><td>Sigma</td><td>A92902-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-lysine</td><td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>MEM acides aminés non essentiels</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>StemCell Technologies</td><td>5854</td><td>Milieu de cryoconservation sans sérum conçu pour la cryoconservation de cellules souches embryonnaires humaines et pluripotentes induites</td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 384-Well Polystyrène Blanc</td><td>Microplaques Thermo</td><td>164610</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>Sigma</td><td>P5899-5MG</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Acide rétinoïque</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>Réactif de dissociation cellulaire contenant des enzymes protéolytiques et collagénolytiques</td></tr><tr><td>Synaptophysin</td><td>Thermo</td><td>MA5-14532</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

un test d’excroissance de neurite et évaluation de neurotoxicité avec des neurones neuronaux progéniteurs humains dérivés des cellules

A Neurite Outgrowth Assay and Neurotoxicity Assessment with Human Neural Progenitor Cell-Derived Neurons

L’analyse d’excroissance de neurite et l’évaluation de neurotoxicité sont deux études principales qui peuvent être exécutées utilisant la méthode présentée ci-dessus. Ce protocole fournit une analyse fiable de la morphologie neuronale ainsi que des mesures quantitatives des modifications sur la longueur de la neurite et la localisation des protéines synaptiques et l’abondance lors du traitement avec de petits composés de molécules. En plus de l’application de la méthode présentée dans les études sur l’excroissance de la neurite, l’évaluation de la neurotoxicité peut être effectuée pour évaluer, distinguer et classer les composés chimiques commerciaux en fonction de leur effet potentiel de neurotoxicité développementale.
Même si les lignées cellulaires sont aujourd’hui largement utilisées dans les tests de dépistage composés en neurosciences, elles diffèrent souvent génétiquement et phénotypiquement de leur origine tissulaire. Les cellules primaires, d’autre part, maintiennent des marqueurs et des fonctions importants observés in vivo. Par conséquent, en raison du potentiel de traduction et de la pertinence physiologique que ces cellules pourraient offrir l’essai de néoration et l’évaluation de neurotoxicité peuvent considérablement bénéficier de l’utilisation des cellules progénitrices neuronales humaines (hNPC) comme modèle cellulaire humain primaire.
La méthode présentée ici peut être utilisée pour dépister la capacité des composés à induire l’excroissance de la neurite et la neurotoxicité en profitant des neurones humains dérivés des cellules progéniteurs, un modèle cellulaire représentant étroitement la biologie humaine.

Le protocole présenté dans le manuscrit a été utilisé avec succès dans deux articles récemment publiés22,23. La figure 3 démontre l’utilisation de neurones dérivés des HNPC pour examiner l’effet des inhibiteurs du HDAC comme composés épigénétiques sur l’extension des neurites comme marqueur de l’excroissance des neurites et de la capacité neurogénique subséquente des composés de petites molécules.
En outre...

Le protocole présenté décrit une méthode pour un test d’excroissance de neurite et l’évaluation de neurotoxicité des composés de petites molécules.

Un test d’excroissance de neurite et évaluation de neurotoxicité avec des neurones neuronaux progéniteurs humains dérivés des cellules

Neurite outgrowth assay and neurotoxicity assessment are two major studies that can be performed using the presented method herein. This protocol provides ...

Le protocole présenté décrivant l’analyse de l’excroissance neurite qui est très pertinent pour la biologie humaine et l’évaluation de la neurotoxicité d’une petite molécule composés. Le potentiel translationnel élevé et la pertinence physiologique des cellules progénitrices neurales humaines en tant que modèle principal de cellules humaines offrent un avantage considérable dans le criblage et l’évaluation de neurotoxicité liés à la découverte de drogues liées à la croissance neurite. En utilisant le protocole présenté, les cellules souches pluripotentes induites par l’homme et les neurones humains dérivés de cellules souches embryonnaires peuvent également être utilisés comme sources cellulaires alternatives pour l’analyse de la prolifération des neurites et l’évaluation de la neurotoxicité.Commencez par recueillir les médias avec des neurosphères flottantes et le transférer dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifuger le tube à 300 à 400 fois g pendant trois minutes. Ensuite, aspirez soigneusement le surnatant.et résuspendez les sphères dans 500 microlitres de réaménagement de dissociation cellulaire décongelé. Incuber les sphères à 37 degrés Celsius pendant cinq à 15 minu

a-neurite-outgrowth-assay-neurotoxicity-assessment-with-human-neural

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Biologie du développement

Cet article décrit un nouveau protocole et de réactif mis conçu pour la mesure sensibles des effets neurotoxiques de composés et de traitements sur les co-cultures de neurones et les astrocytes en utilisant l'analyse à haute teneur. Les résultats démontrent que l'analyse de contenu de haute technologie représente un roman passionnant pour l'évaluation de la neurotoxicité.

Un neuronale et astrocytes de co-culture de dosage pour l&#39;analyse du contenu haute de la neurotoxicité

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Dérivation efficace des ressources humaines progéniteurs neuronaux et des neurones à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

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Il est essentiel en neurobiologie et en neurovirologie de disposer d’un système in vitro fiable et reproductible qui serve de modèle translationnel pour ce qui se passe in vivo dans les neurones humains. Ce protocole décrit comment cultiver et différencier les cellules de neuroblastome humain SH-SY5Y en neurones viables pour une utilisation dans des applications in vitro.

La différenciation de la SH-SY5Y neuroblastome humain Cell Line

Les cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC) sont considérées comme un outil puissant pour le dépistage médicamenteux et chimique et pour le développement de nouveaux modèles in vitro pour les tests de toxicité, y compris la neurotoxicité. Ici, un protocole détaillé pour la différenciation des hiPSC dans les neurones et la glie est décrit.

Protocole pour la différenciation de cellules souches pluripotentes induites par l&#39;homme dans des cultures mixtes de neurones et Glia pour des tests de neurotoxicité

Sur le développement neurologique des processus tels que la prolifération, la migration et la croissance des neurites sont souvent perturbées dans les maladies neuropsychiatriques. Ainsi, nous présentons des protocoles afin de rapidement et de façon reproductible évaluer ces processus neurologique dans humain iPSC dérivés PNJ. Ces protocoles permettent également l’évaluation des effets des facteurs de croissance et de la thérapeutique sur le développement de NPC.

Détection rapide des phénotypes de développement neurologique dans des cellules précurseurs neurales humaines (PNJ)

Ce protocole décrit une procédure détaillée pour resuspendre et cultiver les neurones dérivés de cellules souches humaines qui étaient précédemment différenciés des progéniteurs neuronaux in vitro pendant plusieurs semaines. La procédure facilite les essais basés sur l'imagerie des neurites, des synapses et des marqueurs neuronaux à expression tardive dans un format compatible avec la microscopie légère et le dépistage à haute teneur.

Post-différenciation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Dans ce rapport, nous décrivons un protocole simple pour étudier la croissance neurite dans les neurones corticaux embryonnaires de rat en co-transfectant avec l'EGFP et la protéine d'intérêt.

Un meilleur assougo de fluorescence verte à base de protéines pour étudier la croissance de la neurite dans les neurones primaires

Découvrez un test d'excroissance de neurite et d'évaluation de neurotoxicité utilisant des progéniteurs neuronaux humains. Cette méthode offre une pertinence physiologique élevée pour le criblage de médicaments.

Un test d’excroissance de neurite et évaluation de neurotoxicité avec des neurones neuronaux progéniteurs humains dérivés des cellules (Vidéo) | JoVE Journal

Un test d’excroissance de neurite et évaluation de neurotoxicité avec des neurones neuronaux progéniteurs humains dérivés des cellules

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