Name: Mesures FLIM-FRET des interactions protéines-protéines chez les bactéries vivantes. (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Apprenez à mesurer les interactions protéines-protéines par FLIM-FRET dans des bactéries vivantes. Cette méthode utilise Pseudomonas aeruginosa pour analyser les interactions protéiques dans leur environnement cellulaire natif.

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Nous reconnaissons le Dr Ludovic Richert pour son aide précieuse dans l’acquisition de données FLIM et pour la maintenance technique et le développement de la configuration FLIM. Ces travaux ont été financés par des subventions de la Fondation pour la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/). VN est financé par la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM‐SPF201809006906). YM remercie l’Institut Universitaire de France (IUF) pour son soutien et son temps supplémentaire consacré à la recherche. L’IJS et JG reconnaissent l’Institut de livraison de médicaments de Strasbourg pour son soutien financier.

<ol><li>Braun, P., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+protein-protein+interactions%3A+From+egg-white+to+complex+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks.</a> Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).</li>
<li>Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterisation+and+functional+significance+of+transient+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions.</a> Journal of Molecular Biology. 325, 991-1018 (2003).</li>
<li>Hayes, S., Malacrida, B., Kiely, M., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein-protein+interactions%3A+Progress%2C+pitfalls+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Studying protein-protein interactions: Progress, pitfalls and solutions.</a> Biochemical Society Transactions. 44, 994-1004 (2016).</li>
<li>Guillon, L., Altenburger, S., Graumann, P. L., Schalk, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+protein+dynamics+of+the+siderophore+pyoverdine+pathway+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Deciphering protein dynamics of the siderophore pyoverdine pathway in Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS ONE. 8, 1-9 (2013).</li>
<li>Ringel, M. T., Brüser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biosynthesis+of+pyoverdines%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell%22%5BJournal%5D)">The biosynthesis of pyoverdines.</a> Microbial Cell. 5, 424-437 (2018).</li>
<li>Schalk, I. J., Rigouin, C., Godet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+siderophore+biosynthesis+among+fluorescent+Pseudomonads+and+new+insights+into+their+complex+cellular+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">An overview of siderophore biosynthesis among fluorescent Pseudomonads and new insights into their complex cellular organization.</a> Environmental Microbiology. 22, 1447-1466 (2020).</li>
<li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+detecting+protein-protein+interactions+in+living+cells%3A+principles%2C+limitations%2C+and+recent+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Science+China+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Techniques for detecting protein-protein interactions in living cells: principles, limitations, and recent progress.</a> Science China Life Sciences. , (2019).</li>
<li>Day, R. N., Mazumder, N., Sun, Y., Christopher, K. G. FRET microscopy: Basics, issues and advantages of FLIM-FRET imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDay%2C+RN+%22Springer+Series+in+Chemical+Physics%22">Springer Series in Chemical Physics</a>. 111, 249-276 (2015).</li>
<li>Bastiaens, P. I. H., Squire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%3A+Spatial+resolution+of+biochemical+processes+in+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging microscopy: Spatial resolution of biochemical processes in the cell.</a> Trends in Cell Biology. 9, 48-52 (1999).</li>
<li>Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+spatiotemporal+dynamics+of+neuronal+signaling+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Current Opinion in Neurobiology. 16, 551-561 (2006).</li>
<li>Tramier, M., Zahid, M., Mevel, J. -C., Masse, M. -J., Coppey-Moisan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+CFP%2FYFP+and+GFP%2FmCherry+Pairs+to+Donor+Photobleaching+on+FRET+Determination+by+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Microscopy+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of CFP/YFP and GFP/mCherry Pairs to Donor Photobleaching on FRET Determination by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy in Living Cells.</a> Microscopy Research and Technique. 71, 146-157 (2008).</li>
<li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+fluorescent+protein+FRET+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">A guide to fluorescent protein FRET pairs.</a> Sensors (Switzerland). 16, 1-24 (2016).</li>
<li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32, 407-414 (2007).</li>
<li>Leray, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+of+a+frequency+domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscope+for+fret+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol of a frequency domain fluorescence lifetime imaging microscope for fret measurements.</a> Microscopy Research and Technique. 72, 371-379 (2009).</li>
<li>Elson, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+including+single-shot+acquisition+with+a+segmented+optical+image+intensifier%5BTitle%5D)+AND+%22New+Journal+of+Physics%22%5BJournal%5D)">Real-time time-domain fluorescence lifetime imaging including single-shot acquisition with a segmented optical image intensifier.</a> New Journal of Physics. 6, 1-13 (2004).</li>
<li>Rajoria, S., Zhao, L., Intes, X., Barroso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIM-FRET+for+Cancer+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">FLIM-FRET for Cancer Applications.</a> Current Molecular Imaging. 3, 144-161 (2014).</li>
<li>Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+absorption+properties+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon absorption properties of fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 8, 393-399 (2011).</li>
<li>Visca, P., Ciervo, A., Orsi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+nucleotide+sequence+of+the+pvdA+gene+encoding+the+pyoverdin+biosynthetic+enzyme+L-ornithine+N5-oxygenase+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Cloning and nucleotide sequence of the pvdA gene encoding the pyoverdin biosynthetic enzyme L-ornithine N5-oxygenase in Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 176, 1128-1140 (1994).</li>
<li>Imperi, F., Visca, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+the+pyoverdine+biogenesis+machinery+of+Pseudomonas+aeruginosa%3A+A+membrane-associated+%27siderosome%27%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of the pyoverdine biogenesis machinery of Pseudomonas aeruginosa: A membrane-associated 'siderosome'.</a> FEBS Letters. 587, 3387-3391 (2013).</li>
<li>Gasser, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+cellulo+FRET-FLIM+and+single+molecule+tracking+reveal+the+supra-molecular+organization+of+the+pyoverdine+bio-synthetic+enzymes+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">In cellulo FRET-FLIM and single molecule tracking reveal the supra-molecular organization of the pyoverdine bio-synthetic enzymes in Pseudomonas aeruginosa.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. , 1-11 (2019).</li>
<li>Rietsch, A., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+type+III+secretion+gene+expression+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of type III secretion gene expression in Pseudomonas aeruginosa.</a> Molecular Microbiology. 59, 807-820 (2006).</li>
<li>Herrero, M., De Lorenzo, V., Timmis, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+vectors+containing+non-antibiotic+resistance+selection+markers+for+cloning+and+stable+chromosomal+insertion+of+foreign+genes+in+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 172, 6557-6567 (1990).</li>
<li>Godet, J., Mély, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+protein-protein+interactions+with+large+differences+in+protein+expression+levels+using+FLIM-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Applications+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Exploring protein-protein interactions with large differences in protein expression levels using FLIM-FRET.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 8, 014007(2019).</li>
<li>El Meshri, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+nucleocapsid+domain+in+HIV-1+gag+oligomerization+and+trafficking+to+the+plasma+membrane%3A+A+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of the nucleocapsid domain in HIV-1 gag oligomerization and trafficking to the plasma membrane: A fluorescence lifetime imaging microscopy investigation.</a> Journal of Molecular Biology. 427, 1480-1494 (2015).</li>
<li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bh+TCSPC+Handbook%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">The bh TCSPC Handbook.</a> Scanning. , 1(2010).</li>
<li>Richert, L., Didier, P., de Rocquigny, H., Mély, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+HIV-1+protein+oligomerization+by+FLIM+FRET+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Springer+Series+in+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Monitoring HIV-1 protein oligomerization by FLIM FRET microscopy.</a> Springer Series in Chemical Physics. , 111(2015).</li>
<li>Fereidouni, F., Blab, G. A., Gerritsen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phasor+based+analysis+of+FRET+images+recorded+using+spectrally+resolved+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Applications+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Phasor based analysis of FRET images recorded using spectrally resolved lifetime imaging.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 2, (2014).</li>
<li>Fereidouni, F., Gorpas, D., Ma, D., Fatakdawala, H., Marcu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+fluorescence+lifetime+estimation+with+modified+phasor+approach+and+Laguerre+deconvolution%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Applications+in+Fluorescence%22%5BJournal%5D)">Rapid fluorescence lifetime estimation with modified phasor approach and Laguerre deconvolution: a comparative study.</a> Methods and Applications in Fluorescence. 5, 035003(2017).</li>
<li>Margineanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+protein-protein+interactions+using+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+%28FRET%29+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+%28FLIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Screening for protein-protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM).</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
<li>Guzmán, C., Oetken-Lindholm, C., Abankwa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+High-Throughput+Fluorescence+Lifetime+Imaging+Microscopy+to+Detect+Protein-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Automated High-Throughput Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy to Detect Protein-Protein Interactions.</a> Journal of Laboratory Automation. 21, 238-245 (2016).</li>
<li>Liu, W., Cui, Y., Ren, W., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+biomarker+screening+by+FLIM-FRET+for+combination+therapy+in+ER%2B+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic biomarker screening by FLIM-FRET for combination therapy in ER+ breast cancer.</a> Clinical Epigenetics. 11, 1-9 (2019).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+fluorescence+lifetime+imaging+techniques%3A+A+review+on+challenge+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innovative+Optical+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fast fluorescence lifetime imaging techniques: A review on challenge and development.</a> Journal of Innovative Optical Health Sciences. 12, 1-27 (2019).</li>
<li>Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non+fitting+based+FRET-FLIM+analysis+approaches+applied+to+quantify+protein-protein+interactions+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Non fitting based FRET-FLIM analysis approaches applied to quantify protein-protein interactions in live cells.</a> Biophysical Reviews. 3, 63-70 (2011).</li>
<li>Padilla-Parra, S., Audugé, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+FRET+analysis+by+fast+acquisition+time+domain+FLIM+at+high+spatial+resolution+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells.</a> Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).</li>
<li>Stringari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phasor+approach+to+fluorescence+lifetime+microscopy+distinguishes+different+metabolic+states+of+germ+cells+in+a+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phasor approach to fluorescence lifetime microscopy distinguishes different metabolic states of germ cells in a live tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13582-13587 (2011).</li>
<li>Digman, M. A., Caiolfa, V. R., Zamai, M., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phasor+approach+to+fluorescence+lifetime+imaging+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The phasor approach to fluorescence lifetime imaging analysis.</a> Biophysical Journal. 94, 14-16 (2008).</li>
<li>Liang, Z., Lou, J., Scipioni, L., Gratton, E., Hinde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+nuclear+wide+chromatin+compaction+by+phasor+analysis+of+histone+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+%28FRET%29+in+frequency+domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+%28FLIM%29+data%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Quantifying nuclear wide chromatin compaction by phasor analysis of histone Förster resonance energy transfer (FRET) in frequency domain fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) data.</a> Data in Brief. 30, 105401(2020).</li>
<li>Grimm, J. B., Heckman, L. M., Lavis, L. D. The chemistry of small-molecule fluorogenic probes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGrimm%2C+JB+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22">Progress in Molecular Biology and Translational Science</a>. 113, Elsevier Inc. (2013).</li>
<li>Li, L., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+Generation+of+Small-Molecule+Fluorogenic+Probes+for+Bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Next Generation of Small-Molecule Fluorogenic Probes for Bioimaging.</a> Biochemistry. 59, 216-217 (2020).</li>
<li>Yao, R., Ochoa, M., Yan, P., Intes, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Net-FLICS%3A+fast+quantitative+wide-field+fluorescence+lifetime+imaging+with+compressed+sensing+-+deep+learning+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Light%3A+Science+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Net-FLICS: fast quantitative wide-field fluorescence lifetime imaging with compressed sensing - deep learning approach.</a> Light: Science and Applications. 8, 1-7 (2019).</li>
<li>Smith, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+fit-free+analysis+of+fluorescence+lifetime+imaging+via+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fast fit-free analysis of fluorescence lifetime imaging via deep learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116, 24019-24030 (2019).</li>
<li>Yao, R., Ochoa, M., Intes, X., Yan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+compressive+macroscopic+fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+-+International+Symposium+on+Biomedical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Deep compressive macroscopic fluorescence lifetime imaging.</a> Proceedings - International Symposium on Biomedical Imaging. 2018, 908-911 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

FLIM-FRET offre certains avantages clés par rapport à l’imagerie FRET basée sur l’intensité. La durée de vie de fluorescence est un paramètre intrinsèque du fluorophore. Par conséquent, elle ne dépend pas des concentrations locales de fluorophores ni de l’intensité de l’excitation lumineuse. La durée de vie de fluorescence est en outre également mal affectée par le photo-blanchiment. Il est particulièrement intéressant de mettre en évidence les IPP dans les cellules où les concentrations de protéines locales peuvent être...

Les interactions protéine-protéine (IPP) contrôlent divers processus clés dans les cellules1. Les rôles des IPP diffèrent en fonction de la composition protéique, des fonctions d’affinités et des emplacements dans lescellules 2. Les IPP peuvent être étudiés au moyen de différentes techniques3. Par exemple, la co-immunoprécipitation est un outil relativement simple, robuste et peu coûteux couramment utilisé pour identifier ou confirmer les IPP. Toutefois, l’étude des IPP peut s’avérer difficile lorsque les protéines en interaction ont de faibles niveaux d’expression ou lorsque les interactions sont transitoires ou pertinentes uniquement dans des environnements spécifiques. L’étude des IPP se produisant entre les différentes enzymes de la voie de pyoverdine dans P. aeruginosa exige que la répression du répresseur général fer-co-factorisé Fur soit soulagée pour permettre l’expression de toutes les protéines de la voie de pyoverdine pour être exprimée dans la cellule4,5,6. Cette régulation commune pour toutes les protéines de la voie entraîne des expressions opportunes dans la cellule qui devrait favoriser leurs interactions. La diversité en termes de taille, de nature, de niveaux d’expression et le nombre de protéines de cette voie métabolique rendent difficile l’étude dans les systèmes reconstitués6. Il est donc essentiel d’explorer les IPP dans leur environnement cellulaire pour mieux comprendre les fonctions biologiques des protéines dans leur contexte natal.
Seules quelques méthodes, y compris la fluorescence, permettent d’explorer les IPP dans les cellulesvivantes 7. Parmi les différents paramètres de fluorescence qui peuvent être mesurés, la durée de vie de fluorescence (c.-à-d. le temps moyen qu’un fluorophore reste dans son état excité avant d’émettre un photon) est probablement l’un des paramètres les plus intéressants à explorer dans les cellules vivantes. La durée de vie de fluorescence d’un fluorophore est très sensible à son environnement et FLIM peut donc fournir des informations chimiques ou physiques concernant l’environnement fluorophore8. Cela inclut la présence d’un transfert d’énergie par résonance Förster (FRET) qui peut se produire en présence d’un « accepteur » de fluorescence situé à une courte distance d’un « donneur » de fluorescence. Le transfert d’énergie entraîne un raccourcissement important de la durée de vie de fluorescence du donneur (figure 1A), faisant de la microscopie d’imagerie à vie de fluorescence (FLIM) une approche puissante pour explorer les interactions protéine-protéine directement dans les cellules vivantes. FLIM peut en outre fournir des informations spatiales sur l’endroit où les interactions ont lieu dansles cellules 7,8. Cette approche est extrêmement puissante pour étudier les IPP dans les situations où l’étiquetage avec les fluorophores des deux partenaires en interaction est possible.
Pour fret de se produire - conditions critiques sur la distance entre deux fluorophores sont nécessaires8,9. Les deux fluorophores ne doivent pas être éloignés l’un de l’autre de plus de 10 nm. Par conséquent, il faut faire preuve de prudence lors de la conception d’expériences FLIM-FRET pour s’assurer que le donneur et l’accepteur de fluorescence ont une chance d’être situés l’un près de l’autre dans le complexe en interaction. Bien que cela puisse sembler contraignant, il s’agit en fait d’un véritable avantage, car la dépendance à distance du FRET fait en sorte que deux protéines étiquetées subissant fret doivent interagir physiquement (Figure 1A). Les difficultés à obtenir des réponses claires sur l’IPP dans les expériences de colocalisation (deux protéines colocalisées peuvent ne pas nécessairement interagir) ne sont donc pas un problème à l’aide de FLIM-FRET.
<img alt="Diagramme FRET ; spectroscopie de fluorescence ; donateur-accepteur ; courbes d’excitation-émission ; chevauchement spectral." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61602/61602fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 : Principe d’analyse FLIM-FRET. Chaque pixel de l’image multidimensionnelle FLIM-FRET contient des informations sur la désintégration de fluorescence enregistrée à cet endroit particulier (#counts = nombre de photons détectés dans le canal t). (R) La représentation classique de l’image FLIM est généralement une image 2D codée à vie en fausse couleur (à gauche). Une diminution de la durée de vie moyenne de fluorescence du donneur - comme en voit un changement dans l’échelle des couleurs - peut être observée en présence de FRET et est instructive sur la présence d’IPP dans cette zone spatiale. ( B )Unchevauchement entre le spectre des émissions des donneurs et le spectre d’absorption de l’accepteur est nécessaire pour que le FRET se produise. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61602/61602fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Une deuxième exigence du FRET est que le spectre d’émission du donneur et les spectres d’absorption de l’accepteur sechevauchent 8 (figure 1B). L’excitation de fluorescence du donneur doit être à des longueurs d’onde qui contribuent très peu à l’excitation directe de fluorescence de l’accepteur. Toutes les combinaisons de fluorophores ne sont pas possibles et nous recommandons en outre d’utiliser préférentiellement les donneurs ayant des désintégrations monoexponentielles de fluorescence pour faciliter les interprétations flim-FRET10. Plusieurs couples de protéines de fluorescence répondent à ces exigences, y compris le populaire couple eGFP-mCherry11 (pour un examen sur la palette de protéines fluorescentes disponibles fret pairesvoir 12,13).
FLIM-FRET permet de mesurer la désintégration à vie par fluorescence d’un donneur fret à chaque pixel d’une image FLIM (Figure 1A). Il existe deux techniques majeures pour déterminer la durée de vie de la fluorescence qui diffèrent dans l’acquisition et l’analyse : le domaine de fréquence (FD)14 et le domaine du temps (TD). TD FLIM est plus répandue et est effectuée à l’aide d’un éclairage pulsé combiné avec différentes configurations de détection possibles, y compris les méthodes de gating15,strie caméra 16 ou en corrélation avec le temps simple comptage des photons (TCSPC) techniques8. Tant pour les techniques de DF que pour les techniques de DT, la durée de vie de la fluorescence n’est pas mesurée directement, mais nécessite une analyse des données mesurées pour estimer la durée de vie ou la présence d’interactions. Pour les techniques tcspc, l’analyse la plus largement utilisée repose sur l’ajustement des désintégrations avec des fonctions exponentielles simples ou multiples en utilisant les reconvolutions itératives les moins carrées qui minimisent la somme pondérée des résidus.
Enfin, FLIM-FRET peut être effectué à la fois en utilisant un seul photon ou excitations multiphoton. Les derniers ont plusieurs avantages comme la réduction de l’autofluorescence et photodamage hors du plan focal. Les excitations multiphoton permettent également une plus longue profondeur d’excitation si l’on travaille dans des échantillons 3Dépais 8. Au contraire, l’excitation simple de photons est habituellement plus efficace car les sections transversales d’absorption de deux photons des protéines fluorescentes sontlimitées 17.
Ici, nous proposons un protocole pour les mesures FLIM-FRET des IPP en direct P. aeruginosa dans le cas particulier de deux protéines en interaction (PvdA et PvdL) exprimées avec un nombre très différent de copies pour démontrer la qualité et la robustesse de la technique à révéler les caractéristiques critiques des IPP. Les protéines PvdA et PvdL sont impliquées dans la biosynthèse de la pyoverdine. PvdA est un L-ornithine N5-oxygenase et synthétise le L-N5-formyl-N5-hydroxyornithine de L-ornithine par hydroxylation (PvdA) et formylation (PvdF)18. Le PvdL est une enzyme de synthèse peptidique non ribosomique (NRPS) composée de quatre modules. Le premier module catalyse l’acylation de l’acide myristique. Le deuxième module catalyse l’activation de L-Glu et sa condensation vers le myristic-coA. Ensuite, le troisième module condense un acide aminé L-Tyr qui est ensuite isomérisé en D-Tyr. Enfin, le quatrième module lie un acide aminé L-Dab (acide diaminobutyrique) pour former le tripepide acylé L-Glu/D-Tyr/L-Dab6. PvdL est donc responsable de la synthèse des trois premiers acides aminés du précurseur de la pyoverdine. L’interaction de la protéine PvdA avec le PvdL est surprenante car le PvdL, au contraire du PvdI et du PvdJ, ne porte pas de module spécifique à la L-N5-formyl-N5-hydroxyornithine. Cette interaction suggère que toutes les enzymes responsables de la biosynthèse précurseur de la pyoverdine sont disposées dans de grands complexes multi-enzymatiques transitoires etdynamiques 19,20.
Dans ce rapport, nous expliquons en détail comment construire les souches bactériennes exprimant nativement les deux protéines étiquetées eGFP et mCherry en interaction. Nous décrivons également la préparation de l’échantillon et les conditions d’imagerie cellulaire FLIM-FRET efficace. Enfin, nous proposons un didacticiel étape par étape pour l’analyse d’images, y compris un outil récemment développé offrant des possibilités avancées de visualisation pour une interprétation simple des données complexes FLIM-FRET. Avec ce rapport, nous tenons à convaincre non seulement les aventuriers, mais la plupart des biologistes que FRET-FLIM est une technique accessible et puissante capable de répondre à leurs questions sur les IPP directement dans l’environnement cellulaire natif.

<table><tbody><tr><td>Filtre passe-bande 525/50 nm</td><td>F37-516, AHF, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-court 680 nm</td><td>F75-680, AHF, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td>Sulfate d’ammonium</tr><tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq ADN polymérase 5U/&mu ; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EP0714</td><td></td></tr><tr><td>E. coli TOP10</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td></td></tr><tr><td>Photodiode d’avalanche couplée à la fibre</td><td>SPCM-AQR-14- FC, lamelles en verre Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Epaisseur n° 1,5, 20&fois ; 20mm</td><td>Knitel verre</td><td>MS0011</td><td></td></tr><tr><td>ADN polymérase haute fidélité Phusion 2U/&mu ; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon de lysogénie (LB)</td><td>Millipore</td><td>1.10285</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4 . 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope (25&fois ; 75mm)</td><td>Verre Knitel</td><td>MS0057</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel et nettoyage PCR</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.50</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Plasmide</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740588.10</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium dibasique (K2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES20765</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Succinate (disodique)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14160</td><td></td></tr><tr><td>SPCImage, logiciel SPCM</td><td>Becker & Hickl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boucle d’inoculation stérile</td><td>Nunc</td><td>7648-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligase 1U/&mu ; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15224017</td><td></td></tr><tr><td>module TCSPC</td><td>SPC830, Becker & Hickl, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti :Sapphire laser</td><td>Insight DeepSee, Spectra Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes 50mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr></tbody></table>

mesures flim-fret des interactions protéines-protéines chez les bactéries vivantes.

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

Les interactions protéine-protéine (IPP) contrôlent divers processus clés dans les cellules. La microscopie d’imagerie à vie par fluorescence (FLIM) combinée au transfert d’énergie par résonance Förster (FRET) fournissent des informations précises sur les IPP dans les cellules vivantes. FLIM-FRET s’appuie sur la mesure de la désintégration à vie par fluorescence d’un donneur fret à chaque pixel de l’image FLIM, fournissant des informations quantitatives et précises sur les IPP et leurs organisations cellulaires spatiales. Nous proposons ici un protocole détaillé pour les mesures FLIM-FRET que nous avons appliqué pour surveiller les IPP en direct Pseudomonas aeruginosa dans le cas particulier de deux protéines en interaction exprimées avec des numéros de copie très différents pour démontrer la qualité et la robustesse de la technique à révéler les caractéristiques critiques des IPP. Ce protocole décrit en détail toutes les étapes nécessaires à la caractérisation ppi - à partir de constructions mutantes bactériennes jusqu’à l’analyse finale à l’aide d’outils récemment développés offrant des possibilités avancées de visualisation pour une interprétation simple des données complexes FLIM-FRET.

Les fonctions cumulatives empiriques de distribution (ecdf) des durées de vie de fluorescence mesurées pour les différentes souches bactériennes sont indiquées à la figure 8. Si fret se produit, les ecdfs sont déplacés vers les durées de vie plus courtes(figure 8A,8B). Notez que lorsque l’interaction des deux protéines entraîne une longue distance entre les deux fluorophores, aucun FRET ne peut se produire (Figure 8C</strong...

Nous décrivons ici un protocole pour caractériser les interactions protéine-protéine entre deux protéines fortement exprimées différemment dans pseudomonas aeruginosa vivants utilisant des mesures de FLIM-FRET. Le protocole comprend les constructions de souches bactériennes, l’immobilisation des bactéries, l’imagerie et les routines d’analyse des données post-imagerie.

Mesures FLIM-FRET des interactions protéines-protéines chez les bactéries vivantes.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...

FILM-FRET est une technique puissante qui permet de confirmer les interactions protéine-protéine suspectées ou prévues. Dans ce protocole, nous présentons un moyen d’analyser les données dans des cas particuliers de donneurs déséquilibrés et de quantités d’accepteur. FILM-FRET est en mesure de fournir des informations sur les interactions protéine-protéine directement dans les cellules vivantes.Il est important d’étudier les interactions personal-protéine dans l’environnement cellulaire indigène, en particulier lorsque les protéines fluorescentes sont exprimées au niveau endogène. Commencez par cultiver des bactéries P.aeruginosa, E.coli TOP10 et E.coli dans cinq millilitres de LB sans antibiotique à 30 degrés Celsius tout en secouant pendant la nuit. Le lendemain, mesurez la densité optique des cultures et mélangez une quantité égale d’aide P.aeruginosa, E.coli TOP10 et E.coli dans un microtube de 1,5 millilitre.Centrifuger le tube pendant cinq minutes à 9300 fois G pour pelleter les bactéries, puis jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans 50 microlitres de LB. Plaquez une tache du mélange sur une agar LB préchauffée et incubez-la pendant cinq heures à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, racler l’endroit avec une boucle stérile d’inoculation et le résusquer en un millilitre de LB. Plaque 100 microlitres de cette suspension bactérienne sur l’agar LB contenant 10 microgrammes par millilitre de chloramphéniphéniol et 30 microgrammes par géntamycine millilitre et incuber deux jours à 37 degrés Celsius pour éliminer les bactéries E.coli TOP10 et E.coli helper. Resuspendez une colonie en un millilitre de LB et incubez-la à 37 degrés Celsius avec des secousses orbitales pendant quatre heures, puis centrifugez le tube pendant trois minutes à 9 300 fois G et jetez 950 microlitres de supernatant.Resuspendez la pastille dans 50 microlitres de LB et isolez le mélange sur l’agar LB contenant du saccharose et pas de chlorure de sodium. Incuber la plaque pendant la nuit à 30 degrés Celsius. Repérons les colonies isolées sur l’agar LB et l’agar LB contenant 15 milligrammes par géntamycine millilitre afin de vérifier la sensibilité à la géntamycine.Placez une glissière en verre microscope sur une surface horizontale plane et disposez deux glissières en verre surmontées de deux couches de ruban adhésif autour d’elle. Pipette une gouttelette de 70 microlitres de 1% d’agarose fondue sur la glissière de verre et placez une quatrième glissière sur le dessus pour aplatir la gouttelette d’agarose. Appuyez doucement pendant environ une minute.Enrôez la glissière supérieure et déposez environ trois microlitres de bactéries en trois à quatre endroits à différents endroits sur la garniture d’agarose. Couvrez le tampon d’agarose d’un couvercle en verre microscopie et fixez-le avec de la paraffine fondue pour le sceller sur la glissière de verre en commençant par les quatre coins. Placez la diapositive de microscopie sur la scène avec le coverslip face à l’objectif.Tournez la tourelle du cube filtrant pour sélectionner le cube eGFP et ouvrez l’obturateur de la lampe de fluorescence, puis envoyez la lumière de fluorescence vers l’oculaire du microscope. Concentrez l’objectif sur les bactéries à l’aide du bouton microscope. Sélectionnez une région d’intérêt pour l’échantillon à l’aide du joystick qui contrôle l’étape motorisée.Renvoyez le chemin d’émission de fluorescence vers le détecteur, puis tournez en arrière la tourelle du cube de filtre pour sélectionner le cube dichroïque pour le laser de 930 nanomètres et réglez la puissance laser à 20 milliwatts. Réglez la taille de la région d’intérêt à 30 micromètres qui ajuste la tension de fonctionnement des miroirs galvo et définit la gamme de leurs mouvements. Allumez le détecteur et commencez à scanner l’échantillon.Choisissez le champ de vision pour l’imagerie en déplaçant finement la scène de l’interface de l’ordinateur. Cela peut être fait sur la configuration en déplaçant la croix sur l’image dans le logiciel de contrôle du microscope qui définira le nouveau centre de l’image et en appuyant sur l’étape de déplacement. Un bon champ de vision pour l’acquisition devrait contenir 10 à 30 bactéries immobiles toutes au point.Si vous êtes intéressé à extraire des cellules individuelles FILM-FRET données, assurez-vous que les bactéries sont bien individualisées. Ouvrez le logiciel d’imagerie et vérifiez que le taux de comptage des photons n’est pas trop élevé pour éviter un effet de carambolage qui peut influencer les mesures à vie. Si nécessaire, abaissez l’intensité du laser pour maintenir le taux de nombre de photons bas.Ajuster les paramètres d’acquisition, y compris le temps de collecte des acquisitions. Appuyez sur le bouton de démarrage et attendez la fin de l’acquisition. Pour analyser les données, ouvrez RStudio et créez un nouveau projet.Créez un nouveau dossier dans le dossier de projet principal et nommez-le, puis déplacez toutes les analyses demandez des fichiers dans ce dossier. Ouvrez un nouveau fichier script ou le script supplémentaire flim_analysis.r. Installez le package FlimDiagRam dédié pour l’analyse des données de film et appelez le paquet dans l’espace de travail.Les fonctions cumulatives empiriques de distribution des durées de vie de fluorescence mesurées pour les différentes souches bactériennes sont montrées ici. Si fret se produit, les fonctions sont déplacées vers les durées de vie plus courtes. Il est important de noter que fret ne peut pas se produire lorsque l’interaction des deux protéines se traduit par une longue distance entre les deux flurophores, qui ne peut pas être distingué de l’absence d’interaction.Par conséquent, il peut être nécessaire d’étiqueter les protéines à différentes positions pour maximiser les chances de sonder l’interaction. En raison de la grande différence dans les expressions protéiques entre PvdA et PvdL, le même complexe n’entraîne pas de données FILM-FRET similaires. Les stoichiometries déséquilibrées conduisent à des différences dans la contribution du libre par rapport aux protéines lbellisée par donneur liées dans la distribution à vie de fluorescence enregistrée.L’intrigue du diagramme peut être utilisée pour fournir des informations critiques sur la stoichiométrie. Dans le mutant PvdA-eGFP mCherry-PvdL, la quantité de PvdA étiqueté par donneur est beaucoup plus élevée que la quantité de mCherry-PvdL. Parmi tous les donneurs présents dans l’échantillon, seuls quelques-uns d’entre eux interagissent avec le PvdL.La seule valeur tau one centrée à environ 2,3 nanosecondes suggère que chaque donneur PvdA-eGFP ne peut transférer qu’avec un accepteur mCherry-PvdL. Lorsque l’étiquetage est inversé, la plupart des protéines eGFP-PvdL devraient interagir avec PvdA-mCherry, ce qui est confirmé par les valeurs alpha-un plus élevées. Les valeurs tau one sont devenues plus distribuées suggérant que plusieurs protéines PvdA peuvent se lier à une seule protéine PvdL.La configuration FLIM est de plus en plus disponible dans un nombre croissant d’installations d’imagerie. Les échantillons d’imagerie dans un FILM-FRET ne sont pas plus compliqués que l’imagerie en microscopie vidéo.

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