Applications de l’immobilisation des tissus drosophiles avec caillots de fibrine pour l’imagerie en direct

Ce protocole décrivait l’immobilisation d’échantillons à l’aide de caillots de fibrine. Les échantillons sont transférés dans une goutte de milieu de culture contenant du fibrinogène à la surface d’une lamelle, après quoi la polymérisation est induite par l’ajout de thrombine. Sous un microscope de dissection, utilisez une brosse pour transférer les larves L3 dans une boîte en verre borosilicate à neuf puits contenant du PBS.

Remuez pour détacher la majeure partie de la nourriture contre les mouches des larves et transférez-la dans un autre milieu de culture contenant bien le but. À l’aide d’une pince, saisissez une larve sur tout son diamètre au milieu de sa longueur corporelle et transférez-la dans un autre puits de la plaque de borosilicate contenant 200 microlitres de milieu de culture frais. Ne libérez pas la larve.

Pour couper la larve en deux sur tout son diamètre, broyez la zone saisie avec un mouvement latéral des pointes de la pince, ou glissez une pointe d’une autre paire de pinces entre les deux pointes de pince qui maintiennent la larve. Utilisez la pince pour tenir la larve par sa cuticule, et une autre paire de pinces pour décoller la cuticule sans tirer sur le cerveau. Répétez cette opération jusqu’à ce que les nerfs provenant du cerveau soient visibles et que les organes reliant le cerveau aux pièces buccales puissent être accessibles.

Tout en tenant les nerfs provenant du cerveau avec une pince, coupez la connexion entre le cerveau et les pièces buccales avec l’autre paire de pinces, séparant le cerveau du reste de la cuticule. Tenez le cerveau par les axones sortant du cordon nerveux ventral et épilez les organes environnants en les éloignant doucement du cerveau. Ensuite, saisissez la connexion entre les disques imaginaux de l’œil et le cerveau avec l’autre paire de pinces, et coupez cette connexion sans tirer sur le cerveau.

Assurez-vous que le cerveau est correctement débarrassé des autres tissus et qu’il n’est pas endommagé. Jetez le cerveau s’il montre des signes de dommages. Pipetez la solution d’enrobage avec un P20 pour enrober la pointe de la pipette, puis aspirez le cerveau avec la pointe enrobée avec trois microlitres de milieu, et pipetez-la dans un autre puits contenant 200 microlitres de milieu de culture propre.

Répétez ce processus jusqu’à ce qu’un nombre suffisant de cerveaux soient disséqués, en remplaçant parfois le milieu de culture du puits dans lequel les dissections sont effectuées. À l’aide d’une pipette P20 avec une pointe enrobée, transférez les cerveaux disséqués dans un autre puits de la plaque de borosilicate contenant 200 microlitres de milieu de culture et de fibrinogène. Aspirez un cerveau avec neuf microlitres de milieu de culture et de fibrinogène.

Avec l’extrémité de l’embout touchant presque le fond en verre de la boîte de culture cellulaire, pipetez le contenu de sorte que le milieu de culture touche la lamelle immédiatement après être sorti de l’embout de la pipette. À l’aide de l’une des pointes d’une paire de pinces ou d’une paire de pinces fermées, on pousse doucement le cerveau et on le positionne dans le milieu de culture et la goutte de fibrinogène. Si la partie ventrale du cerveau doit être imagée, induisez la coagulation du fibrinogène pour orienter correctement le cerveau à l’intérieur du caillot.

Poussez le cerveau d’un côté de la chute. Touchez le bord de la goutte du côté opposé du cerveau avec la pointe de la pipette et ajoutez un microlitre de thrombine. Attendez une à deux minutes pour que le fibrinogène commence à polymériser, ce qui entraîne la formation d’un précipité trouble d’un côté de la goutte, puis poussez doucement et rentrez le cerveau dans le caillot de fibrine, en vous assurant que la face ventrale est aussi proche que possible de la lamelle sans déformer le cerveau.

Pipetez un microlitre de solution de thrombine près du côté du cerveau qui n’est pas rentré dans le caillot de fibrine. Attendez deux à trois minutes que le deuxième caillot de fibrine se forme, puis appuyez sur les bords du caillot pour le faire adhérer plus fortement à la lamelle, en prenant soin de ne pas déformer le cerveau. Si le cerveau semble être trop loin de la lamelle, rapprochez-le en appuyant sur le caillot de fibrine plus près du cerveau.

Pour induire le caillot de fibrine pour l’imagerie de la partie dorsale du cerveau, positionnez le cerveau au centre de la goutte, la partie dorsale face à la lamelle. À l’aide d’une pipette P2, touchez le bord de la goutte du côté opposé du cerveau avec la pointe de la pipette et pipetez un microlitre de thrombine. Attendez deux à trois minutes que le fibrinogène commence à polymériser, ce qui entraîne la formation d’un précipité fibreux trouble, puis appuyez sur les bords du caillot pour le faire adhérer plus fortement à la lamelle, en prenant soin de ne pas déformer le cerveau.

Avec l’extrémité de la pointe positionnée à environ 0,5 centimètre au-dessus du caillot, pipetez doucement 390 microlitres de milieu de culture sans fibrinogène goutte à goutte sur le caillot. N’ajoutez pas le milieu de culture sur les côtés du caillot, car cela pourrait le détacher de la lamelle. Pour éliminer l’excès de thrombine, retirez 300 microlitres de la boîte, puis ajoutez 300 microlitres de milieu de culture propre, en vous assurant que les caillots restent complètement immergés.

Pour éviter que les changements de température ne provoquent des changements de foyer, maintenez la solution avec les réactifs à la même température que la boîte de culture. Retirez le couvercle de la boîte de culture sans déplacer la boîte elle-même. Pour un retrait plus facile, placez le couvercle de la parabole de 35 millimètres à l’envers sur le dessus de la parabole avant l’imagerie.

Placez la pointe d’une pipette P1000 près de la surface du milieu à l’intérieur de la boîte de culture et libérez doucement le volume adéquat de solution réactive sur celle-ci, sans générer de flux forts qui pourraient détacher les caillots. Pour homogénéiser la solution dans la boîte de culture, utilisez une pipette P200 pour pipeter lentement une petite quantité de solution à l’intérieur et à l’extérieur cinq fois. Remettez le couvercle sans déplacer la boîte de culture et reprenez l’imagerie.

Lorsqu’un NAPP1 a été ajouté à de la fibrine, des cerveaux larvaires immobilisés exprimant du Bazooka marqué à la GFP, les cerveaux porteurs d’une mutation sensible analogue de l’aPKC ont montré une contraction de l’épithélium neural, ainsi que des amas brillants de Baz dans les neuroblastes et leur descendance. Les neuroblastes ont continué à se diviser tout au long du laps de temps, indiquant que le tissu restait sain. Et les cerveaux ont montré peu de dérive malgré le changement de milieu de culture.

De même, l’application d’un NAPP1 à des ovaires exprimant un Bazooka marqué à la GFP a induit la contraction de cellules folliculaires mutantes aPKC sensibles aux analogues, mais pas de témoins. Une hyper-pile présentant à la fois une dérive latérale et une dérive focalisée a d’abord été corrigée pour la dérive latérale, puis la dérive de focale, ce qui a entraîné une réduction substantielle des mouvements observés dans l’hyper-pile d’origine. Lors de la tentative de ce protocole, il est important de rentrer le cerveau dans le caillot de fibrine partiellement polymérisé pendant que le caillot est encore malléable mais suffisamment solide pour maintenir le cerveau de manière stable.

Expérimentez la manipulation de caillots vides et sondez doucement le caillot pendant qu’il polymérise pour vérifier sa solidité.