Nettoyage des tissus à base de CLARTÉ raffiné pour l’organisation tridimensionnelle des fibroblastes dans les cœurs de souris sains et blessés

Ce nouveau protocole de nettoyage des tissus améliore la technologie existante pour permettre un regard in vivo plus précis sur des types de cellules spécifiques dans le cœur et leur comportement dans des conditions de blessure. Ce protocole est rapide et assez simple. Il permet le maintien de la fluorescence marca avec une interférence minimale de la fluorescence automatique des tissus de fond sans nécessiter de coloration cellulaire ou tissulaire.

Commencez par utiliser un tampon de gaze imbibé d’éthanol à 70% pour nettoyer la surface ventrale de la souris expérimentale. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision transversale de trois centimètres, environ trois mètres en dessous du processus xiphoïde et déglossez la souris de l’abdomen au processus xiphoïde pour séparer la peau du tissu de la paroi abdominale sous-jacente. Faire une incision transversale de deux centimètres dans le tissu de la paroi abdominale sous-cutanée, trois centimètres en dessous du processus xiphoïde et faire une coupe verticale de cette incision jusqu’à la ligne médiane à travers la cage thoracique.

Épinglez la cage thoracique en arrière pour exposer le cœur. Et utilisez une seringue de 10 millilitres équipée d’une aiguille de calibre 27 pour injecter du PBS froid dans la veine cave supérieure et l’aorte. Lorsque tout le sang a été rincé du cœur, livrer 10 millilitres de froid 4% PFA dans la veine cave supérieure et l’aorte pour commencer le processus de fixation.

Lorsque tout le fixateur a été flashé, excisez le cœur et utilisez un scalpel à lame droite pour séparer les oreillettes, le ventricule droit et le septum et le ventricule gauche. Placez le cœur dans un tube conique de 15 millilitres de froid 4% PFA pour une incubation de nuit à quatre degrés Celsius sur un nutator. Le lendemain matin, ajoutez une solution d’initiateur photo à 0,25% à une solution d’hydrogels fraîchement préparée et transférez le cœur dans l’hydrogel.

Envelopper le tube conique dans du papier d’aluminium pour une incubation de nuit à quatre degrés Celsius sans perturbation physique. Le lendemain matin, réchauffez le tube dans un bain de perles de 37 degrés Celsius pendant 2,5 heures avant d’utiliser une pince pour transférer soigneusement le cœur dans un tube de 15 millilitres de PBS. Lavez le cœur trois fois en PBS pendant une heure par lavage à 37 degrés Celsius sur un nutator et transférez le cœur dans le panier d’une machine d’électrophorèse active.

Fixez le couvercle en place et remplissez le réservoir de la chambre d’électrophorèse active avec une solution de nettoyage par électrophorèse. Une fois la chambre pleine, plongez le panier dans la solution et serrez le bouchon de la machine d’électrophorèse en place. Ensuite, faites fonctionner la machine d’électrophorèse à 1,5 a et 37 degrés Celsius pendant 1,5 heure.

Après l’électrophorèse, vérifiez visuellement le cœur pour vous assurer qu’il ne reste aucun tissu opaque. Lavez le cœur dégagé trois fois dans un deux millilitres de 15 millilitres pendant une heure dans du PBS frais à 37 degrés Celsius par lavage sur un nutator. Avant d’immerger le cœur en agent décolorant pour réduire la fluorescence automatique de l’hème.

Après 48 heures, lavez le cœur trois fois dans du PBS comme démontré et équilibrez le cœur dans un RIMS fraîchement préparé pendant 48 heures avant l’imagerie. Pour l’imagerie 3D du cœur dégagé, placez d’abord une fine couche de graisse sous vide sur le fond d’un réservoir inférieur imprimé en 3D, à la même hauteur que l’échantillon stratéisé. Remplissez le réservoir avec rims et utilisez une pointe de pipette pour enlever les bulles.

Placez soigneusement le cœur dans le RIMS avec la paroi ventriculaire gauche vers le haut, en prenant soin qu’aucune bulle ne soit introduite dans la solution. Utilisez de la graisse sous vide pour fixer un glissement de couvercle en verre à la surface inférieure d’une pièce supérieure du réservoir imprimée en 3D et placez la glissière de couverture du réservoir supérieur sur les réservoirs inférieurs, en prenant soin d’éviter les bulles. Remplissez ensuite les réservoirs supérieurs avec du glycérol.

Utilisez un microscope confocal pour imager les cœurs dégagés. La combinaison d’un nettoyage raffiné des tissus cardiaques avec l’imagerie 3D permet une visualisation détaillée avancée des fibroblastes cardiaques. En utilisant cette technique d’imagerie, on observe que les fibroblastes sont densément emballés et ont une morphologie fusiforme dans les cœurs non blessés.

Après des dommages de ré-perfusion d’ischémie, une perte de fibroblastes cardiaques est vue dans la région ischémique pendant les trois premiers jours après des dommages. Aux jours sept et 14, les fibroblastes ont migré ou proliféré pour repeupler la région blessée de tissu. Au jour 28, la population de fibroblastes cardiaques entourant les zones blessées du cœur est à leur plus grande densité.

Un jour et demi après des dommages d’infarctus du myocarde, peu de fibroblastes restent dans le ventricule gauche blessé. Au troisième jour cependant, les fibroblastes se dilatent et sont présents dans la majeure partie du ventricule gauche. Contrairement à la chirurgie ischémique, l’infusion de l’angiotensine deux et de la phénoléfrine sur plusieurs semaines n’a pas comme conséquence la perte de tissu cardiaque et l’amincissement de mur.

Au lieu de cela, le fibroblaste s’alignent le long de l’axe du modèle droitier de contraction d’hélice comme vu en utilisant le raffiné au protocole de dégagement de tissu. En outre, après l’angiotensine deux et le traitement de phénolefrin, les fibroblastes semblent petits et arrondis par opposition à la forme d’axe observée dans les modèles de la réprofusion d’ischémie et des dommages d’infarctus du myocarde. Le nettoyage électrophorétique doit être effectué avec soin, en particulier lorsque vous travaillez avec des cœurs qui ont subi des protocoles de blessures.

Ce protocole peut être employé pour évaluer comment les fibroblastes cardiaques réagissent aux dommages in vivo. Différents marqueurs fluorescents peuvent également être utilisés pour comprendre comment le cœur réagit aux blessures au niveau cellulaire.