Name: Hi-C dans le noyau dans les cellules de la drosophile (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Découvrez le protocole Hi-C in-nucleus pour profiler les interactions chromatiniennes à haute résolution chez Drosophila. Cette méthode permet d'étudier l'organisation du génome et les fonctions des éléments architecturaux.

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Ce travail a été soutenu par le programme d’appui à l’innovation technologique et à la recherche de l’UNAM (PAPIIT) numéro de subvention IN207319 et le numéro de subvention du Conseil national de la science et de la technologie (CONACyT-FORDECyT) 303068. A.E.-L. est un étudiant à la maîtrise soutenu par le Conseil national des sciences et de la technologie (CONACyT) CVU numéro 968128.

1. Fixation
<ol><li>Commencez avec 10 millions de cellules de la ligne 2 plus (S2R+) de Schneider pour préparer 17,5 mL d’une suspension cellulaire en milieu Schneider contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS) à température ambiante (RT).</li>
	<li>Ajouter le formaldéhyde sans méthanol pour obtenir une concentration finale de 2 %. Mélanger et incuber pendant 10 min à TA, en prenant soin de mélanger chaque minute. REMARQUE: Le formaldéhyde est un produit chimique dangereux. Respectez les règles de santé et de sécurité appropriées et travaillez dans la hotte.</li>
	<li>Éteindre la réaction en ajoutant de la glycine pour obtenir une concentration finale de 0,125 M et mélanger. Incuber pendant 5 min à TA, suivi de 15 min sur glace.</li>
	<li>Centrifuger pendant 400 × g à RT pendant 5 min puis pendant 10 min à 4 °C ; jeter le surnageant. Resuspendez soigneusement la pastille dans 25 mL de solution saline froide 1x tamponnée au phosphate.</li>
	<li>Centrifuger à 400 × g pendant 10 min à 4 °C, puis jeter le surnageant. REMARQUE: Si vous continuez avec le protocole, passez à l’étape 2.1 pour la lyse; sinon, congeler la pastille dans un liquideN2 et la conserver à -80 °C.</li>
</ol>2. Lyse
<ol><li>Resuspendez les cellules dans 1 mL de tampon de lyse glacé (10 mM de Tris-HCl, pH 8 ; 0,2 % de tensioactif non ionique (voir la Table des matériaux); 10 mM de NaCl ; 1x inhibiteurs de protéase), et ajustez le volume à 10 mL avec un tampon de lyse glacé. Régler le volume pour obtenir une concentration de 1 × 106 cellules/mL. Incuber sur de la glace pendant 30 min, en mélangeant toutes les 2 min en inversant les tubes.</li>
	<li>Centrifuger les noyaux à 300 × g pendant 5 min à 4 °C, puis jeter soigneusement le surnageant. Lavez la pastille 1x avec 1 mL de tampon de lyse à froid et transférez-la dans un tube de microcentrifugation. Lavez la pastille 1x avec 1 mL de tampon de restriction froid de 1,25x et ressuspendez chaque pastille de cellule dans 360 μL de tampon de restriction 1,25x.</li>
	<li>Ajouter 11 μL de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 10 % par tube (concentration finale de 0,3 %), mélanger soigneusement par pipetage et incuber à 37 °C pendant 45 min, en agitant à 700-950 tr/min. Pipet de haut en bas pour perturber les touffes plusieurs fois pendant l’incubation.</li>
	<li>Trempez la FDS en ajoutant 75 μL de tensioactif non ionique (solution à 10 %, voir le tableau des matériaux)par tube (concentration finale de 1,6 %), puis incubez à 37 °C pendant 45 min, en agitant à 950 tr/min. Pipet de haut en bas plusieurs fois pour perturber les touffes pendant l’incubation. REMARQUE: Si les amas sont gros et difficiles à perturber, diminuez la vitesse de rotation à 400 tr / min pendant les traitements SDS et tensioactifs. Si les amas sont difficiles à désagréger par pipetage, divisez l’échantillon en deux; ajuster les volumes du tampon de restriction, de la FDS et du tensioactif; et procéder à la perméabilisation. Ensuite, faites tourner les noyaux à une vitesse minimale (200 × g),jetez soigneusement le surnageant, mettez les échantillons ensemble dans un tampon de restriction 1X et procédez à la digestion. Prendre une aliquote de 10 μL comme échantillon non digéré (UD).</li>
</ol>3. Digestion enzymatique
<ol><li>Digérer la chromatine en ajoutant 200 unités (U) de Mbo I par tube, et incuber à 37 °C pendant une période allant de 4 h à la nuit en rotation (950 tr/min).</li>
	<li>Le lendemain, ajoutez 50 U de Mbo I supplémentaires par tube et incubez à 37 °C pendant 2 h en tournant (950 tr/min).</li>
	<li>Inactiver l’enzyme en incubant les tubes à 60 °C pendant 20 min. Placez les tubes sur de la glace. REMARQUE : Prendre une aliquote de 10 μL comme échantillon digéré (D).</li>
</ol>4. Biotinylation des extrémités de l’ADN
<ol><li>Pour remplir les surplombs de fragments de restriction et étiqueter les extrémités de l’ADN avec de la biotine, ajoutez 1,5 μL chacun de 10 mM dCTP, dGTP, dTTP, 20 μL de 0,4 mM de biotine dATP, 17,5 μL de tampon Tris low-EDTA (TLE) [10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0], et 10 μL de 5 U/μL de Klenow (gros fragment d’ADN polymérase I) à tous les tubes. Mélanger soigneusement et incuber pendant 75 min à 37 °C. Agiter à 700 tr/min toutes les 10 s pendant 30 s. Placez tous les tubes sur de la glace pendant la préparation du mélange de ligature.</li>
</ol>5. Ligature
<ol><li>Transférer chaque mélange de chromatine digéré dans un tube séparé de 1 mL avec mélange de ligature (100 μL de tampon de ligature 10x, 10 μL d’albumine sérique bovine de 10 mg/mL, 15 U d’ADN ligase T4 et 425 μL d’eau double distillée [ddH2O]). Bien mélanger par pipetage doux et incuber toute la nuit à 16 °C.</li>
</ol>6. Inversion de la réticulation et purification de l’ADN
<ol><li>Dégrader les protéines en ajoutant 50 μL de 10 mg/mL de protéinase K par tube, et incuber à 37 °C pendant 2 h. Inverser les réticulations en augmentant la température à 65 °C et incuber pendant la nuit.</li>
	<li>Dégrader l’ARN en ajoutant 20 μL de 10 mg/mL de RNase A, et incuber à 37 °C pendant 1 h.</li>
	<li>Effectuer une extraction phénol:chloroforme suivie d’une précipitation d’éthanol.<ol>
<li>Ajouter 1 volume de phénol-chloroforme, et bien mélanger par inversion pour obtenir une phase blanche homogène. REMARQUE: Le phénol est un produit chimique dangereux. Respectez les règles de santé et de sécurité appropriées. Travailler dans la hotte.</li>
		<li>Centrifuger à 15 000 × g pendant 15 min. Transférer la phase aqueuse dans un tube de microcentrifugation frais de 2 mL. Effectuer une rétro-extraction de la couche inférieure avec 100 μL de tampon TLE et transférer la phase aqueuse dans le même tube de 2 mL.</li>
		<li>Précipiter l’ADN en ajoutant 2 volumes d’alcool éthylique à 100 % (EtOH), 0,1 volume d’acétate de sodium 3 M et 2 μL de glycogène 20 mg/mL. Incuber à -20 °C pendant une période allant de 2 h à toute la nuit.</li>
		<li>Tourner à 15 000 × g pendant 30 min à 4 °C, et laver les granulés 2x avec de l’EtOH glacé à 70 %. Sécher les granulés à RT et les mettre en service dans 100 μL de tampon TLE. Quantifier l’ADN à l’aide d’un colorant fluorogénique qui se lie sélectivement à l’ADN et d’un fluoromètre selon les instructions du fabricant (Table des matériaux). REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Conserver les produits de ligature à 4 °C à court terme ou à -20 °C à long terme. Utilisez une aliquote (100 ng) du matériau comme échantillon ligaturé (L) pour le contrôle de la qualité.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Évaluez la qualité du modèle Hi-C
<ol><li>Contrôles qualitatifs de la digestion et de la ligature<ol>
<li>Purifier l’ADN des aliquotes UD et D en inversant les réticulations et effectuer l’extraction phénol:chloroforme et la précipitation de l’éthanol comme décrit ci-dessus.</li>
		<li>Chargez 100 ng d’échantillons UD, D et L dans un gel d’agarose à 1,5%. Recherchez un frottis centré autour de 500 pb dans l’échantillon D par rapport à une bande de poids moléculaire élevé pour l’échantillon L (voir les résultats représentatifs).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Contrôle quantitatif de l’efficacité de la digestion REMARQUE: Pour évaluer l’efficacité de la digestion avec plus de précision, utilisez les échantillons UD et D comme modèles pour effectuer des réactions en chaîne quantitatives par polymérase (qPCR) à l’aide d’amorces conçues comme suit.<ol>
<li>Concevoir une paire d’amorces qui amplifie un fragment d’ADN contenant le site de restriction de l’ADN pour l’enzyme utilisée pour la digestion (Mbo I dans le présent protocole), appelée R dans la formule de l’étape 7.2.3.</li>
		<li>Concevoir une paire d’amorces qui amplifie un fragment d’ADN témoin qui ne contient pas le site de restriction de l’enzyme utilisée pour la digestion (Mbo I pour le présent protocole), appelé C dans la formule de l’étape 7.2.3.</li>
		<li>Utilisez les valeurs seuils de cycle (valeurs Ct) de l’amplification pour calculer l’efficacité de restriction selon la formule ci-dessous : % Restriction = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD} Où CtR fait référence à la valeur Ct du fragment R, et CtC se réfère à la valeur Ct du fragment C pour l’échantillon D et l’échantillon UD. REMARQUE: Le pourcentage de restriction reflète l’efficacité de l’enzyme de restriction clivant le fragment d’ADN restreint (R) par rapport à un fragment d’ADN témoin (C) qui ne contient pas le site d’ADN de restriction. Une efficacité de restriction de ≥ 80% est recommandée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Détection des interactions connues<ol>
<li>Effectuer une PCR pour amplifier un contrôle de ligature interne afin d’examiner les interactions à courte portée et/ou à moyenne ou longue portée (voir les résultats représentatifs).</li>
		<li>Alternativement, concevez des amorces pour amplifier un produit de ligature dans lequel les amorces sont en orientation avant-avant ou arrière-arrière dans des fragments de restriction adjacents.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Contrôle du remplissage et de l’étiquetage de la biotine<ol>
<li>Vérifier le marquage Hi-C et l’efficacité de la ligature par amplification et digestion d’une interaction connue ou d’un produit de ligature entre des fragments de restriction adjacents dans le génome, comme décrit ci-dessus. REMARQUE: Le remplissage et la ligature réussis du site Mbo I (GATC) génèrent un nouveau site pour l’enzyme de restriction Cla I (ATCGAT) à la jonction de ligature et régénèrent le site Mbo I.</li>
		<li>Digérez le produit PCR avec Mbo I, Cla I ou les deux. Après avoir exécuté les échantillons sur un gel de 1,5 à 2%, estimer le nombre relatif de jonctions de ligature 3C et Hi-C en quantifiant l’intensité des bandes coupées et non coupées26. NOTE: Une efficacité de > 70% est souhaitée (voir les résultats représentatifs).</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Sonication
<ol><li>Soniquer les échantillons pour obtenir des fragments d’ADN de 200 à 500 bp. Pour l’instrument utilisé dans ce protocole (voir le Tableau des matériaux),diluer l’échantillon (de 5 à 10 μg) dans 130 μL de ddH2O par tube, et régler l’instrument sur soniquer à 400 pb : niveau de remplissage : 10 ; facteur de droit: 10%; puissance incidente de crête (w) : 140; cycles par rafale: 200; temps(s): 80.</li>
</ol>9. Élimination de la biotine / réparation finale
REMARQUE: Les étapes ci-dessous sont ajustées pour 5 μg d’ADN Hi-C.
<ol><li>Pour éliminer la biotine, transférer l’échantillon (130 μL) dans un tube de microcentrifugation frais. Ajouter 16 μL de tampon de ligature 10x, 2 μL de 10 mM dATP, 5 μL d’ADN polymérase T4 (15U) et 7 μL de ddH2O (160 μL de volume total). Incuber à 20 °C pendant 30 min.</li>
	<li>Ajouter 5 μL de dNTP de 10 mM, 4 μL de tampon de ligature 10x, 5 μL de polynucléotide kinase T4 (10 U/μL), 1 μL de Klenow et 25 μL de ddH2O (200 μL de volume total). Incuber à 20 °C pendant 30 min.</li>
</ol>10. Sélection de la taille
<ol><li>Pour sélectionner des fragments principalement dans la plage de taille 250-550 bp, effectuez d’abord la sélection séquentielle de la taille d’immobilisation réversible en phase solide (SPRI) avec 0,6x, suivie de 0,90x selon les instructions du fabricant, et éluez l’ADN en utilisant 100 μL de TLE.</li>
</ol>11. Biotine pulldown / A-tailing / ligature de l’adaptateur
REMARQUE: Effectuez les lavages en resusmettant les billes magnétiques par vortex, faites pivoter les échantillons pendant 3 minutes sur une roue rotative, puis faites tourner brièvement l’échantillon et placez-le sur le support magnétique. Laissez les perles coller à l’aimant, jetez le surnageant et passez à l’étape de lavage suivante. Effectuez les lavages à 55 °C sur un thermob bloc avec rotation au lieu de la roue rotative.
<ol><li>Augmentez le volume final à 300 μL par échantillon avec TLE pour le pull-down. Préparez les tampons de lavage des billes : 1x tampon d’interpolation (TB) (TB : 5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,05 % Tween), 0,5x TB, 1x tampon No-Tween (NTB) (5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.</li>
	<li>Utilisez 150 μL de billes magnétiques liées à la streptavidine (voir la Table des matériaux)par bibliothèque. Lavez les perles 2x avec 400 μL de 1x TB. Ensuite, resuspendez les billes dans 300 μL 2x NTB.</li>
	<li>Mélanger les billes avec le matériau Hi-C de 300 μL et incuber à RT pendant 30 minutes sur une roue rotative pour permettre à la biotine de se lier aux billes de streptavidine.</li>
	<li>Lavez les billes avec 400 μL de 0,5 t.c. et coubez à 55 °C pendant 3 min, en tournant à 750 tr/min. Lavez les billes dans 200 μL de tampon de restriction 1x.</li>
	<li>Resuspendez les billes dans 100 μL de mélange de résidus dATP (5 μL de 10 mM dATP, 10 μL de tampon de restriction 10x, 5 μL d’exo- Klenow et 80 μL de ddH2O). Incuber à 37 °C pendant 30 min.</li>
	<li>Retirez le surnageant, lavez les billes 2x avec 400 μL de 0,5x To en incubant à 55 °C pendant 3 min et en tournant à 750 tr/min.</li>
	<li>Lavez les billes avec 400 μL de 1x NTB puis avec 100 μL de 1x tampon de ligature.</li>
	<li>Resuspendez les billes dans 50 μL de tampon de ligature 1x et transférez la suspension dans un nouveau tube. Ajouter 4 μL d’adaptateurs PE pré-recuits (15 μM de stock) et 2 μL de ligase T4 (400 U/μL, soit 800 U/tube); incuber à RT pendant 2 h. REMARQUE: Pré-recuit les adaptateurs en ajoutant des volumes égaux d’adaptateurs PE 1.0 et PE 2.0 (stock de 30 μM) et en incubant pendant 10 minutes à RT (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Recapturez les perles en retirant le surnageant et en lavant les perles 2x avec 400 μL de TB. Lavez les billes avec 200 μL de 1x NTB, puis avec 100 μL de tampon de restriction 1x, et resuspendez les billes dans 40 μL de 1x tampon de restriction.</li>
</ol>12. Amplification PCR
<ol><li>Configurez des PCR de 25 μL de volume avec 5, 6, 7 et 8 cycles. Pour chaque PCR, utilisez :<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Recette de réaction</td>
			</tr>
<tr>
<td>Perles Hi-C</td>
				<td>2,5 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>Amorce PCR PE 10 μM (Table des matériaux)</td>
				<td>0,75 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>Amorce PCR PE 10 μM 2 (Table des matériaux)</td>
				<td>0,75 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>10 mM dNTP</td>
				<td>0,6 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>5x tampon de réaction</td>
				<td>5 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>ADN polymérase</td>
				<td>0,3 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
				<td>14,65 μL</td>
			</tr>
<tr>
<td>Total</td>
				<td>25 μL</td>
			</tr>
</tbody></table>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Cycles</td>
				<td>Température</td>
				<td>Heure</td>
			</tr>
<tr>
<td>1</td>
				<td>98 °C</td>
				<td>30 s</td>
			</tr>
<tr>
<td rowspan="3">n cycles</td>
				<td>98 °C</td>
				<td>10 s</td>
			</tr>
<tr>
<td>65 °C</td>
				<td>30 s</td>
			</tr>
<tr>
<td>72 °C</td>
				<td>30 s</td>
			</tr>
<tr>
<td>1</td>
				<td>72 °C</td>
				<td>7 min</td>
			</tr>
</tbody></table>
</li>
</ol>13. Amplification PCR finale
<ol><li>Effectuez l’amplification PCR finale en utilisant les mêmes conditions que celles décrites ci-dessus et le nombre de cycles sélectionnés. Divisez l’échantillon en utilisant 5 μL de billes Hi-C comme modèle dans des réactions de 50 μL.</li>
	<li>Recueillir toutes les réactions de PCR et les transférer dans un tube frais. Utilisez l’aimant pour retirer les billes de streptavidine et récupérer le surnageant (produits PCR). Transférer les billes dans un tube frais, laver les perles comme indiqué à l’étape 11.2.9 et les stocker dans un tampon de restriction 1x à 4 °C en guise de sauvegarde.</li>
	<li>Purifier les produits PCR en utilisant 0,85x le volume des billes SPRI selon les instructions du fabricant. Éluez avec 30 μL de tampon TLE.</li>
	<li>Quantifier la bibliothèque Hi-C à l’aide d’un instrument fluorométrique et confirmer la qualité de la bibliothèque par électrophorèse capillaire sur puce.</li>
	<li>Comme dernier point de contrôle de qualité, utilisez 1 μL de la bibliothèque Hi-C comme modèle pour effectuer une réaction PCR en utilisant 10 cycles en utilisant les mêmes conditions décrites à l’étape 12.1. Divisez le produit PCR en deux tubes de microcentrifugation : digérez l’un avec Cla I et laissez l’autre non digéré comme témoin. Exécutez les produits dans un gel d’agarose à 1,5-2% (voir les résultats représentatifs).</li>
	<li>Passez au séquençage par paires de 50 pb ou 75 pb sur une plate-forme de séquençage appropriée.</li>
</ol>

<ol><li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+territories%2C+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).</li>
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<li>Ulianov, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+chromatin+and+transcription+play+a+key+role+in+chromosome+partitioning+into+topologically+associating+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains.</a> Genome Research. 26, 70-84 (2016).</li>
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<li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disclosure+of+a+structural+milieu+for+the+proximity+ligation+reveals+the+elusive+nature+of+an+active+chromatin+hub%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub.</a> Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).</li>
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<li>Philip, E., Måns, M., Sverker, L., Max, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiQC%3A+Summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 10, 1093(2016).</li>
<li>Wingett, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiCUP%3A+pipeline+for+mapping+and+processing+Hi-C+data%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+Research%22%5BJournal%5D)">HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data.</a> F1000 Research. 4, 1310(2015).</li>
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<li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> Nature Communications. 9, 189(2018).</li>
<li>Ando-Kuri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+and+promoter-centric+3D+genome+organization+temporally+resolved+during+a+circadian+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Cuellar-Partida, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+priors+for+identifying+active+transcription+factor+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites.</a> Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9, 137(2008).</li>
<li>Ong, C. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribosyl%29ation+regulates+insulator+function+and+intrachromosomal+interactions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila.</a> Cell. 155 (1), 148-159 (2013).</li>
<li>Fresán, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulator+protein+CTCF+regulates+Drosophila+steroidogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis.</a> Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).</li>
<li>Quinodoz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+promotes+the+formation+of+spatial+compartments+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus.</a> Cell. 174, 744-757 (2018).</li>
<li>Olivares-Chauvet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+pairwise+and+multi-way+chromosomal+conformations+using+chromosomal+walks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks.</a> Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).</li>
<li>Beagrie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+multi-enhancer+contacts+captured+by+genome+architecture+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping.</a> Nature. 543, 519-524 (2017).</li>
<li>Redolfi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DamC+reveals+principles+of+chromatin+folding+in+vivo+without+crosslinking+and+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).</li>
<li>Maxwell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiChIP%3A+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13, 919-922 (2016).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-BERST%3A+Defining+subnuclear+proteomic+landscapes+at+genomic+elements+with+dCas9-APEX2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2.</a> Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

La méthode Hi-C dans le noyau présentée ici a permis une exploration détaillée de la topologie du génome de la drosophile à haute résolution, fournissant une vue des interactions génomiques à différentes échelles génomiques, des boucles de chromatine entre les éléments régulateurs tels que les promoteurs et les amplificateurs aux TAM et à l’identification des grands compartiments25. La même technologie a également été appliquée efficacement aux tissus de mammifères avec quelques modifications<sup ...

Chez les eucaryotes, le génome est divisé en chromosomes qui occupent des territoires spécifiques dans l’espace nucléaire pendant l’interphase1. La chromatine formant les chromosomes peut être divisée en deux états principaux: l’un de chromatine accessible qui est transcriptionnellement permissive, et l’autre de chromatine compacte qui est transcriptionnellement répressive. Ces états de chromatine se séparent et se mélangent rarement dans l’espace nucléaire, formant deux compartiments distincts dans le noyau2. À l’échelle des sous-mégabases, les limites séparent les domaines des interactions de la chromatine à haute fréquence, appelés TAM, qui marquent l’organisation chromosomique3,4,5. Chez les mammifères, les limites TAD sont occupées par la cohésine et le facteur de liaison CCCTC (CTCF)6,7,8. Le complexe de cohésine extrude la chromatine et s’arrête aux sites de liaison CTCF qui sont disposés dans une orientation convergente dans la séquence génomique pour former des boucles de chromatine stables9,10,13,14. La perturbation génétique du site de liaison à l’ADN CTCF aux limites ou la réduction de l’abondance des protéines CTCF et cohésine entraîne des interactions anormales entre les éléments régulateurs, une perte de formation de TAD et une dérégulation de l’expressiongénique 9,10,11,13,14.
Chez la drosophile, les limites entre les TAD sont occupées par plusieurs AP, y compris le facteur 32 kDa associé aux éléments limites (BEAF-32), la protéine de liaison motif 1 (M1BP), la protéine centrosomale 190 (CP190), le suppresseur d’aile velue (SuHW) et le CTCF, et sont enrichis en modifications actives des histones et en polymérase II16,17,18. Il a été suggéré que chez la drosophile, les TAD apparaissent à la suite de la transcription13 , 17,19, et le rôle exact des PO indépendants dans la formation des limites et les propriétés d’isolation est encore à l’étude. Ainsi, il reste à déterminer si les domaines de la drosophile sont la seule conséquence de l’agrégation de régions d’états transcriptionnels similaires ou si les AP, y compris le CTCF, contribuent à la formation des limites. L’exploration des contacts génomiques à haute résolution a été possible grâce au développement de technologies de capture de conformation chromosomique couplées à un séquençage de nouvelle génération. Le protocole Hi-C a été décrit pour la première fois avec l’étape de ligature effectuée « en solution »2 dans le but d’éviter les produits de ligature fallacieux entre les fragments de chromatine. Cependant, plusieurs études ont montré que le signal utile dans les données provenait de produits de ligature formés à des noyaux partiellement lysés qui n’étaient pas en solution20,21.
Le protocole a ensuite été modifié pour effectuer la ligature à l’intérieur du noyau dans le cadre de l’expérience Hi-C unicellulaire22. Le protocole Hi-C dans le noyau a ensuite été incorporé dans la population cellulaire Hi-C pour produire une couverture plus cohérente sur toute la gamme des distances génomiques et produire des données avec moins de bruit technique23,24. Le protocole, décrit en détail ici, est basé sur le protocole Hi-C de population dans le noyau23,24 et a été utilisé pour étudier les conséquences de l’élimination génétique des motifs de liaison à l’ADN pour CTCF et M1BP d’une limite de domaine au locus du gène Notch chez Drosophila25. Les résultats montrent que la modification des motifs de liaison à l’ADN pour les AP à la limite a des conséquences drastiques sur la formation du domaine Notch, des défauts topologiques plus importants dans les régions entourant le locus Notch et une dérégulation de l’expression génique. Cela indique que les éléments génétiques aux limites du domaine sont importants pour le maintien de la topologie du génome et de l’expression des gènes chez Drosophila25.

<table><tbody><tr><td>16 % (vol/vol) solution de paraformaldéhyde</td><td>Agar Scientific</td><td>R1026</td><td></td></tr><tr><td>Biotine-14-dATP</td><td>Invitrogen</td><td>CA1524-016</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme ClaI</td><td>NEB</td><td>R0197S</td><td></td></tr><tr><td>COVARIS Ultrasoniseur</td><td>Covaris</td><td>LE220-M220</td><td></td></tr><tr><td>Cut</td><td>Smart NEB</td><td>B72002S</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td><td>Life Technologies</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptabidin C1</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS) stérile filtré</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Dna PolI grand fragment</td><td>NEB</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Klenow exo(-)</td><td>NEB</td><td>M0210S</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de ligature</td><td>NEB</td><td>B020S</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme MboI</td><td>NEB</td><td>R0147M</td><td></td></tr><tr><td>NP40-Igepal</td><td>SIGMA</td><td>CA-420</td><td>Tensioactif non ionique à ajouter dans le tampon de lyse</td></tr><tr><td>Adaptateur PE 1.0</td><td>Illumina</td><td>5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3'PE</td><td></td></tr> <tr><td>adaptateur 2.0</td><td>Illumina</td><td>5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3'PE</td><td></td></tr> <tr><td>PCR amorce 1.0</td><td>Illumina</td><td>5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3'PE</td><td></td></tr> <tr><td>Amorce PCR 2.0</td><td>Illumina</td><td>5'-CAAGCAAGACGGCATACGAG ATCGGTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3'Phénol</td><td></td></tr> <tr><td>: Chloroforme :Alcool isoamylique 25:24:1</td><td>SIGMA</td><td>P2069</td><td></td></tr><tr><td>Amorce 1 (interaction connue, Figure 2A)</td><td>Sigma</td><td>5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'Amorce</td><td></td></tr> <tr><td>2 (interactions connues, Figure 2A)</td><td>Sigma</td><td>5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'Comprimé cocktail inhibiteur de</td><td></td></tr> <tr><td>protéase</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33327</td><td></td></tr><tr><td>ARNase</td><td>Roche</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>SPRI Perles</td><td>Beckman</td><td>B23318</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligase</td><td>Invitrogen</td><td>15224-025</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN polymérase</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 polynucléotide kinase (PNK)&nbsp ;</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>TaqPhusion</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>ADN polymérase</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>Tensioactif non ionique pour l’extinction des SDS</td></tr></tbody></table>

hi-c dans le noyau dans les cellules de la drosophile

In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells

Le génome est organisé en domaines topologiquement associants (TAD) délimités par des limites qui isolent les interactions entre les domaines. Chez la drosophile, les mécanismes sous-jacents à la formation et aux limites du TAD sont encore à l’étude. L’application de la méthode Hi-C dans le noyau décrite ici a permis de disséquer la fonction des sites architecturaux de liaison aux protéines (AP) aux limites TAD isolant le gène Notch. La modification génétique des limites de domaine qui cause la perte de points d’accès entraîne la fusion tad, des défauts transcriptionnels et des altérations topologiques à longue portée. Ces résultats ont fourni des preuves démontrant la contribution des éléments génétiques à la formation des limites du domaine et au contrôle de l’expression génique chez la drosophile. Ici, la méthode Hi-C dans le noyau a été décrite en détail, ce qui fournit des points de contrôle importants pour évaluer la qualité de l’expérience avec le protocole. Sont également indiqués le nombre requis de lectures de séquençage et de paires Hi-C valides pour analyser les interactions génomiques à différentes échelles génomiques. L’édition génétique des éléments régulateurs médiée par CRISPR/Cas9 et le profilage à haute résolution des interactions génomiques à l’aide de ce protocole Hi-C dans le noyau pourraient être une combinaison puissante pour l’étude de la fonction structurelle des éléments génétiques.

Vous trouverez ci-dessous les résultats d’un protocole Hi-C réussi (voir un résumé du flux de travail du protocole Hi-C à la Figure 1A). Il existe plusieurs points de contrôle de la qualité pendant l’expérience Hi-C dans le noyau. Les aliquotes de l’échantillon ont été prélevées avant (UD) et après (D) l’étape de restriction de la chromatine ainsi qu’après la ligature (L). Les réticulations ont été inversées et l’ADN a été purifié et exécuté sur un gel d’agarose. Un frottis de 200-1000 bp a ...

Le génome est organisé dans l’espace nucléaire en différentes structures qui peuvent être révélées par les technologies de capture de conformation chromosomique. La méthode Hi-C dans le noyau fournit une collection à l’échelle du génome d’interactions de la chromatine dans les lignées cellulaires de la drosophile, qui génère des cartes de contact qui peuvent être explorées à la résolution de la mégabase au niveau du fragment de restriction.

Hi-C dans le noyau dans les cellules de la drosophile

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, ...

Les protocoles Hi-C du noyau permettent l’exploration de la confirmation chromosomique à différentes résolutions pour la caractérisation des boucles de chromatine, des domaines et des compartiments organisant le génome. Ce protocole fournit un profilage à haute résolution des interactions génomiques à différentes échelles, ce qui permet une couverture plus cohérente sur toute la gamme des distances et des données génomiques avec moins de bruit technique. La combinaison de ce protocole avec l’édition génétique est une stratégie puissante pour tester la fonction structurelle des éléments génétiques.Il peut également être appliqué à la caractérisation des variations structurelles qui conduisent à la maladie. Le protocole Hi-C du noyau peut être appliqué pour explorer l’organisation du génome de tout génome eucaryote. Le traitement SDS et Triton désagrège tout amas nucléaire par pipetage, car les agrégats interfèrent avec l’efficacité de la réaction enzymatique et assurez-vous d’effectuer les contrôles de qualité appropriés avant le séquençage.Commencez par ajouter du formaldéhyde sans méthanol à une fois 10 des sept cellules de la drosophile de la ligne 2 Plus de Schneider dans 17,5 millilitres de milieu Schneider complétés par 10% FBS à une concentration finale de 2% Incuber les cellules pendant 10 minutes à température ambiante en mélangeant toutes les 60 secondes ou sur une roue tournante, et ajoutez de la glycine à une concentration finale de 0,125 molaire avec mélange. Après cinq minutes à température ambiante et 15 minutes sur glace, prélever les cellules par centrifugation et ressuspender soigneusement la pastille dans 25 millilitres de PBS froid et prélever les cellules avec une autre centrifugation. À la fin de la centrifugation, ressuspendez les cellules dans un millilitre de tampon de lyse glacée pour le comptage et ajustez les cellules à une fois 10 à la concentration de six cellules par millilitre.Incuber les cellules sur de la glace pendant 30 minutes, en inversant le tube toutes les deux minutes pour mélanger et recueillir les cellules avec une autre centrifugation. Resuspendez la pastille dans un millilitre de tampon de lyse glacée fraîche. Après centrifugation, laver le lysate avec un millilitre de tampon de restriction 1,25X.Centrifuger à nouveau pour recueillir le lysate. Resuspendez la pastille dans 360 microlitres de tampon de restriction frais et 11 microlitres de FDS à 10% avec un pipetage soigneux et incubez pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius et 7 à 950 tours par minute avec pipetage occasionnel. À la fin de l’incubation, arrêtez la perméabilisation avec 75 microlitres de tensioactif non ionique et retournez le tube dans l’incubateur pendant 45 minutes supplémentaires en agitant à 950 tours par minute avec pipetage occasionnel.Pour la digestion de la chromatine, ajoutez 200 unités de Mbo1 au tube pour une incubation de quatre à 16 heures à 37 degrés Celsius avec rotation. À la fin de l’incubation, inactivez l’enzyme avec une incubation de 20 minutes à 60 degrés Celsius. Pour remplir les surplombs de fragments de restriction et étiqueter les extrémités de l’ADN avec de la biotine, ajoutez 1,5 microlitre chacun de 10 millimolaires dCTP, dGTP, dTTP, 20 microlitres de 0,4 millimolaire biotine dATP, 17,5 microlitres de tampon tris low EDTA et 10 microlitres de cinq unités par microlitre d’ADN polymérase un gros fragment au tube avec un mélange soigneux.Incuber la réaction pendant 75 minutes à 37 degrés Celsius en secouant à 700 tours par minute toutes les 10 secondes pendant 30 secondes. À la fin de l’incubation, ajoutez le mélange de ligature à la chromatine et ajustez-le à un millilitre de volume de réaction final avec un mélange doux et approfondi et incubez pendant la nuit à 16 degrés Celsius. Pour dégrader les protéines de l’échantillon, ajoutez 50 microlitres de 10 milligrammes par millilitre de protéinase K au tube pour une incubation de deux heures à 37 degrés Celsius.À la fin de l’incubation, augmentez la température à 65 degrés Celsius pendant la nuit pour inverser la réticulation de l’échantillon. Le lendemain matin, dégradez l’ARN avec 10 microlitres de 10 milligrammes par millilitre ARNi A.Après une heure à 37 degrés Celsius, ajoutez un volume de chloroforme phénolique au tube et mélangez soigneusement par inversion pour obtenir une phase blanche homogène. Après avoir précipité l’ADN selon des protocoles standard, quantifiez l’ADN à l’aide d’un colorant fluorogénique qui se lie sélectivement à l’ADN et d’un fluoromètre selon les instructions du fabricant.Pour purifier l’ADN des aliquotes non digérées et digérées, chargez 100 nanogrammes d’échantillons non digérés, digérés et ligaturés sur un gel d’agarose à 1,5% et recherchez un frottis centré autour de 500 paires de bases dans l’échantillon digéré par rapport à une bande de poids moléculaire élevé pour l’échantillon ligaturé. Pour vérifier le marquage Hi-C et l’efficacité de la ligature par amplification et digestion d’une interaction connue, après PCR, digérer les produits avec Mbo1, Cla1 ou les deux, et exécuter les échantillons sur un nouveau gel de 1,5 à 2% pour permettre l’estimation du nombre relatif de jonctions de ligature 3C et Hi-C. Après avoir soniquer l’échantillon pour obtenir 200 à 500 fragments d’ADN de paire de bases, transférer 130 microlitres avec cinq microgrammes d’ADN de chaque échantillon dans de nouveaux tubes de microcentrifugation contenant 16 microlitres de tampon de ligature 10X, deux microlitres de dATP de 10 millimolaires, cinq microlitres d’ADN polymérase T4 et sept microlitres d’eau double distillée pour une incubation de 30 minutes à 20 degrés Celsius.À la fin de l’incubation, ajouter cinq microlitres de dNTP de 10 millimolaires, quatre microlitres de tampon de ligature 10X, cinq microlitres de polynucléotide kinase T4, un microlitre d’ADN polymérase, un gros fragment et 25 microlitres d’eau double distillée aux tubes pour une deuxième incubation de 30 minutes à 20 degrés Celsius. Pour sélectionner des fragments principalement dans la gamme de taille de paire de bases 250 à 550, effectuez une sélection séquentielle de la taille de la phase solide réversible et de la mobilisation avec 0,6X, puis 0,9X selon les instructions du fabricant et éluez l’ADN avec 100 microlitres de tris low EDTA. Pour le retrait de la biotine pour chaque bibliothèque, lavez deux fois 150 microlitres de billes magnétiques liées à la streptavidine avec 400 microlitres de tampon 1X Tween et faites pivoter les échantillons pendant trois minutes sur une roue rotative.À la fin de l’incubation, remettez en caisse les billes dans 300 microlitres de 2X sans tampon Tween et mélangez-les avec 300 microlitres de matériau Hi-C pour une rotation de 30 minutes sur une roue rotative. À la fin de l’incubation, lavez les billes avec 400 microlitres de tampon d’interpolation 0,5X pour une incubation de trois minutes à 55 degrés Celsius et 750 tours par minute, suivie de deux lavages en 200 microlitres de 1X tampon de restriction par lavage. Après le deuxième lavage, ressuspendez les billes dans 100 microlitres de mélange de résidus dATP pour une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius.À la fin de l’incubation, remettez en suspension les billes dans 50 microlitres de tampon de ligature 1X et transférez la suspension dans un nouveau tube contenant quatre microlitres d’adaptateurs d’extrémité appariés pré-recuits et deux microlitres de ligase T4. Après deux heures à température ambiante, retirez le surnageant et lavez les perles deux fois avec 400 microlitres de tampon Tween, puis lavez les perles une fois avec 200 microlitres sans tampon Tween et une fois avec 100 microlitres de tampon de restriction avant de suspendre à nouveau les perles dans 40 microlitres de tampon de restriction 1X. Un frottis de 200 à 1 000 paires de bases est observé lorsque la restriction avec Mbo1 est réussie.Si la ligature réussit, une bande de poids moléculaire élevé est observée au sommet du gel. L’efficacité de la digestion peut également être confirmée par PCR quantitative. Une efficacité de digestion acceptable est de 80% ou plus.Comme illustré, l’amplification d’une interaction connue à moyenne portée dans les produits de ligature Hi-C peut être estimée par digestion du produit PCR récupéré dans l’amplification. Une efficacité de digestion de plus de 70% est recommandée pour éviter d’avoir une grande proportion de lectures inutiles pour les bibliothèques après le séquençage. Le nombre de cycles de PCR pour l’amplification finale doit être inférieur d’un cycle au nombre de cycles pour lesquels le frottis est visible.Le niveau de digestion de la bibliothèque indique l’abondance des paires Hi-C valides et reflète la proportion de lectures utiles qui seront obtenues à partir de la bibliothèque. En utilisant les paires Hi-C valides uniques, une analyse de base de la distribution des paires peut être effectuée. Comme observé dans cet exemple représentatif, le locus du gène NOTCH peut être vu avec les protéines architecturales, les domaines un et deux, et les modifications des histones le long du locus.Lors de la suppression de la région contenant à la fois les sites de liaison à l’ADN CTCF et M1BP, un changement spectaculaire dans les contacts de chromatine peut être observé. Après l’expérience Hi-C, un peut être effectué pour atteindre un ensemble spécifique de contacts, par exemple, à partir de régions promotrices. Ceci est particulièrement utile lors de l’évaluation de grands génomes.Comme démontré, la combinaison du protocole Hi-C avec l’addition génétique peut être utilisée pour évaluer la fonction structurelle et régulatrice des éléments génomiques.

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