Name: Observation de la fonction des îlots et des interactions entre les îlots et les cellules immunitaires dans les tranches de tissu pancréatique vivant (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Découvrez l'observation des îlots pancréatiques et leurs interactions avec les cellules immunitaires dans des tranches de tissu vivant. Cette méthode préserve le microenvironnement natif pour étudier la physiologie isulaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été financé par les subventions des NIH R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 et P01 AI042288. Cette recherche a été réalisée avec le soutien du Réseau des donneurs d’organes pancréatiques atteints de diabète (nPOD; RRID:SCR_014641), un projet collaboratif de recherche sur le diabète de type 1 parrainé par FRDJ (nPOD : 5-SRA-2018-557-Q-R) et the Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053). Le contenu et les opinions exprimées relèvent de la responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement le point de vue officiel de nPOD. Les organisations d’approvisionnement en organes (OPO) qui s’associent au nPOD pour fournir des ressources de recherche sont énumérées à http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Merci au Dr Kevin Otto, de l’Université de Floride, d’avoir fourni le vibratome utilisé pour générer des tranches de souris.

<ol><li>Uc, A., Fishman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Pancreatic disorders.</a> Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).</li>
<li>Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics%2C+pathogenesis+and+clinical+interventions+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes.</a> Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).</li>
<li>Taylor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+diabetes%3A+etiology+and+reversibility%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Type 2 diabetes: etiology and reversibility.</a> Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).</li>
<li>Meier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+of+Langerhans+isolation+from+pediatric+and+juvenile+donor+pancreases%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases.</a> Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).</li>
<li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li>
<li>Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+pancreas+tissue+slices+for+the+study+of+islet+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology.</a> Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).</li>
<li>Speier, S., Rupnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+in+situ+characterization+of+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archive%22%5BJournal%5D)">A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells.</a> Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).</li>
<li>Panzer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+tissue+slices+from+organ+donors+enable+in+situ+analysis+of+type+1+diabetes+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis.</a> JCI Insight. 5 (8), 134525(2020).</li>
<li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatitis-induced+depletion+of+syntaxin+2+promotes+autophagy+and+increases+basolateral+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis.</a> Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).</li>
<li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas-specific+SNAP23+depletion+prevents+pancreatitis+by+attenuating+pathological+basolateral+exocytosis+and+formation+of+trypsin-activating+autolysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes.</a> Autophagy. , 1-14 (2020).</li>
<li>Qadir, M. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+human+pancreatic+slices+as+a+model+to+study+real-time+islet+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration.</a> Nature Communications. 11 (1), 3265(2020).</li>
<li>Cohrs, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+persisting+%CE%B2+cells+is+a+key+feature+of+early+type+2+diabetes+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis.</a> Cell Reports. 31 (1), 107469(2020).</li>
<li>Liang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+human+pancreatic+slice+preparations+offer+a+valuable+model+for+studying+pancreatic+exocrine+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).</li>
<li>Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+in+translational+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized mice in translational biomedical research.</a> Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).</li>
<li>Lamont, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+mechanisms+allow+undersized+anchor-deficient+class+I+MHC+ligands+to+mediate+pathogenic+autoreactive+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses.</a> Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Anesthesia+and+analgesia+in+laboratory+animals%22">Anesthesia and analgesia in laboratory animals</a>. Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. , Academic Press. (2011).</li>
<li>Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+and+in+vitro+toxicity+of+dithizone+with+canine%2C+porcine%2C+and+bovine+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets.</a> Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+confocal+assay+to+assess+neuronal+viability+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices.</a> Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).</li>
<li>Gál, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+situ+approach+to+studying+pancreatic+ducts+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice.</a> Frontiers in Physiology. 10, 938(2019).</li>
<li>Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-stimulated+calcium+dynamics+in+islets+of+Langerhans+in+acute+mouse+pancreas+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices.</a> PloS One. 8 (1), 54638(2013).</li>
<li>Stožer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connectivity+in+islets+of+Langerhans+from+mouse+pancreas+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices.</a> PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923(2013).</li>
<li>Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagonotropic+and+glucagonostatic+effects+of+KATP+channel+closure+and+potassium+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization.</a> Endocrinology. 162 (1), 136(2021).</li>
<li>Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+mechanisms+for+sulfonylurea+control+of+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine%22%5BJournal%5D)">New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion.</a> Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).</li>
<li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+oscillations+of+KATP+conductance+in+mouse+pancreatic+islets+provide+support+for+electrical+bursting+driven+by+metabolic+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).</li>
<li>Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+pancreas+tissue+slice+culture+facilitates+long-term+studies+of+exocrine+and+endocrine+cell+physiology+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ.</a> PLoS One. 8 (11), 78706(2013).</li>
<li>Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of the immune system.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12, Unit 12.26 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

L’objectif de ce protocole est d’expliquer la génération de tranches de pancréas et les procédures nécessaires pour utiliser les tranches dans des études fonctionnelles et immunologiques. Il y a de nombreux avantages à utiliser des tranches pancréatiques vivantes. Cependant, plusieurs étapes critiques sont essentielles pour que le tissu reste viable et utile au cours des protocoles d’expérience décrits. Il est impératif de travailler rapidement. Le temps entre l’injection du pancréas et la génération des tranches sur le ...

L’implication du pancréas est pathognomonique à des maladies telles que la pancréatite, le DT1 et le DT21,2,3. L’étude de la fonction dans les îlots isolés implique généralement l’élimination des îlots de leur environnement4. La méthode de la tranche de tissu pancréatique vivant a été développée pour permettre l’étude du tissu pancréatique tout en maintenant des microenvironnements intacts des îlots et en évitant l’utilisation de procédures stressantes d’isolement des îlots5,6,7. Des tranches de tissu pancréatique provenant de tissus de donneurs humains ont été utilisées avec succès pour étudier le DT1 et ont démontré des processus de perte et de dysfonctionnement des cellules bêta en plus de l’infiltration de cellules immunitaires8,9,10,11,12,13. La méthode de la tranche de tissu pancréatique vivant peut être appliquée à la fois au tissu pancréatique de la souris et du tissu pancréatique humain5,6,8. Les tranches de tissu pancréatique humain provenant de tissus de donneurs d’organes sont obtenues grâce à une collaboration avec le Réseau des donneurs d’organes pancréatiques atteints de diabète (nPOD). Les tranches de souris peuvent être générées à partir d’une variété de souches de souris différentes.
Ce protocole se concentrera sur la recombinaison diabétique non obèse activant le gène 1-null (NOD. Rag1-/-) et récepteur transgénique des lymphocytes T (AI4) (NOD. Chiffon1-/-. Souches de souris AI4 α/β). HOCHER. Les souris Rag1-/- sont incapables de développer des lymphocytes T et B en raison d’une perturbation du gène 1 (Rag1)14 activant la recombinaison. HOCHER. Chiffon1-/-. Les souris AI4 α/β sont utilisées comme modèle pour le diabète de type 1 accéléré parce qu’elles produisent un clone de lymphocytes T unique qui cible un épitope d’insuline, ce qui entraîne une infiltration constante des îlots et un développement rapide de la maladie15. Le protocole présenté ici décrit les procédures pour les études fonctionnelles et immunologiques utilisant des tranches pancréatiques humaines et de souris vivantes grâce à l’application d’approches de microscopie confocale. Les techniques décrites ici comprennent les évaluations de la viabilité, l’identification et la localisation des îlots, les enregistrements cytosoliques de Ca2+ , ainsi que la coloration et l’identification des populations de cellules immunitaires.

<table><tbody><tr><td>#3 Style Scalpel Manche</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-163</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-100</td><td>HEPES Buffer, 1M Solution</td></tr><tr><td>10 cm Plat de culture non traité</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Seringue Luer-Lok</td><td>BD</td><td>301029</td><td>Seringue BD avec embouts Luer-Lok</td></tr><tr><td>27 G Aiguille</td><td>BD</td><td>BD 305109</td><td>BD Utilisation générale et PrecisionGlide Aiguilles hypodermiques</td></tr><tr><td>35 mm Couverture Fond de verre Boîte de Pétri</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td>&micro ;-Dish 35 mm,</td></tr><tr><td>haute Seringue de 50 mL</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Couverture à 8 puits</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>&micro ;-Slide 8 Well</td></tr><tr><td>APC anti-souris CD8a anticorps</td><td>Biolegend</td><td>100712</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific</td><td>199898</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>CaCl2 (dihydraté)</td></tr><tr><td>Compact Digital Rocker</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88880020</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>Sténopé&thinsp ;= 1,5-2 unités aérées ; acquis avec des objectifs HC PL APO CS2 dry à ouverture numérique 10x/0,40 et des objectifs HC PL APO CS2 dry à ouverture numérique 20x/0,75 à 512&thinsp ; & fois ; &thinsp ; Résolution de 512 pixels</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>C6H12O6</td></tr><tr><td>ddiH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dithizone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130-10G</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td>Diméthyl sulfoxyde</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 mm Boîte de culture tissulaire</td><td>Corning</td><td>353001</td><td>Falcon Easy-Grip Boîtes de culture</td></tr><tr><td>tissulaire FBS</td><td>Gibco Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Feather No. 10 Lame chirurgicale</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>7204410</td><td></td></tr><tr><td>fluo-4-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td>perméable aux cellules Ca2+ indicateur</td></tr><tr><td>Gel Control Super Glue</td><td>Loctite</td><td>45198</td><td></td></tr><tr><td>Pince Graefe Fine</td><td>Science Tools</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux fins trempés</td> Outils <td>de science fine</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td>Hanks Solution saline équilibrée</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>C8H18N2O4S</td></tr><tr><td>Seau à glace</td><td>Fisherbrand</td><td>03-395-150</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Vétérinaire</td><td>NDC 14043-704-05</td><td></td></tr><tr><td>Johns Hopkins Bulldog Clamp</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-7440</td><td>&nbsp ; Droit; pression de 500 à 900 grammes ; 1,5" de longueur</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34705</td><td>Kimtech Science&trade ; Kimwipes&commerce ; Essuie-glaces Delicate Task, kit de</td></tr><tr><td>viabilité/cytotoxicité LIVE/DEAD</td> 2 plis <td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>Ce kit contient le colorant à cellules vivantes calcein-AM.</td></tr><tr><td>Faible teneur en glucose DMEM</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td>MgCl2 (hexahydraté)</td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium heptahydraté</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td>MgSO4 (heptahydraté)</td></tr><tr><td>Plate-forme chauffée magnétique</td><td>Warner Instruments</td><td>PM-1 Plate-forme</td><td>pour chambre d’imagerie pour stimulation dynamique enregistrements</td></tr><tr><td>Micro-ondes</td><td>GE</td><td>JES1460DSWW</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Seringue Filtre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>726-2520</td><td></td></tr><tr><td>No.4 Pinceau</td><td>Michaels</td><td>10269140</td><td></td></tr><tr><td>Open Diamond Bath Chambre d’imagerie</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td>Chambre d’imagerie pour enregistrements de stimulation dynamique</td></tr><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1-AM</td><td>Invitrogen</td><td>O6807</td><td>Indicateur Ca2+ perméable</td></tr><tr><td>aux cellules Chambre d’imagerie de nuit</td><td>Okolab</td><td>H201-LG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> 20012050 <td>Pour fabriquer de l’agarose pour la génération de tranches</td><td></td></tr><tr><td>Tétramère d’insuline marqué PE</td><td>Emory Tetramer Research Séquence de base</td><td>YAIENYLEL</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de potassium Sigma</td><td>P5405</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Lames de rasoir</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>71998</td><td>Pour vibratome ; Acier inoxydable à double tranchant, non revêtu</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SeaPlaque agarose à bas point de fusion</td><td>Lonza</td><td>50101</td><td>Pour fabriquer de l’agarose pour la génération de tranches</td></tr><tr><td>Ancre</td><td>en tranches Warner Instruments</td><td>64-1421</td><td></td></tr><tr><td>Ancre en tranches (imagerie dynamique)</td><td>Warner Instruments</td><td>640253</td><td>Ancre en tranches pour chambre</td></tr> <tr><td>d’imagerie dynamiqueBicarbonate</td><td>de sodium Sigma</td><td>S5761</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monohydraté</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>NaH2PO4 (monohydrate)</td></tr><tr><td>Inhibiteur de trypsine de soja</td><td>Sigma</td><td>T6522-1G</td><td>Inhibiteur de la trypsine de Glycine max (soja)</td></tr><tr><td>Stade Adaptateur</td><td>Warner Instruments</td><td>SA-20MW-AL</td><td>Pour l’installation d’une chambre d’imagerie pour les enregistrements de stimulation dynamique sur la platine du microscope</td></tr><tr><td>Incubateur de scène</td><td>Okolab</td><td>H201</td><td></td></tr><tr><td>Stéréoscope</td><td>Leica</td><td>IC90 E MSV266</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Blue Dead Cell Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S34857</td><td>Colorant d’acide nucléique bleu-fluorescent</td></tr><tr><td>Pipette de transfert</td><td>Falcon</td><td>357575</td><td>Falcon&trade ; Pipettes de transfert jetables en plastique</td></tr><tr><td>Système de contrôle de soupape</td><td>Warner Instruments</td><td>VCS-8</td><td>Système pour les enregistrements de stimulation dynamique</td></tr><tr><td>Vibratome VT1000 S</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Bain d’eau</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD02</td><td>Fisherbrand Isotemp Bain d’eau de luxe à usage général GPD 02</td></tr></tbody></table>

observation de la fonction des îlots et des interactions entre les îlots et les cellules immunitaires dans les tranches de tissu pancréatique vivant

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Les tranches de tissu pancréatique vivant permettent d’étudier la physiologie et la fonction des îlots dans le contexte d’un microenvironnement intact des îlots. Les tranches sont préparées à partir de tissu pancréatique humain et souris vivant incorporé dans l’agarose et coupées à l’aide d’un vibratome. Cette méthode permet au tissu de maintenir sa viabilité et sa fonction en plus de préserver les pathologies sous-jacentes telles que le diabète de type 1 (DT1) et le diabète de type 2 (DT2). La méthode des tranches permet de nouvelles directions dans l’étude du pancréas grâce au maintien des structures complexes et des diverses interactions intercellulaires qui composent les tissus endocriniens et exocrines du pancréas. Ce protocole montre comment effectuer la coloration et la microscopie en accéléré de cellules immunitaires endogènes vivantes dans des tranches pancréatiques ainsi que des évaluations de la physiologie des îlots. De plus, cette approche peut être affinée pour discerner les populations de cellules immunitaires spécifiques aux antigènes des cellules des îlots à l’aide de réactifs complexes-multimères d’histocompatibilité majeurs.

Ce protocole produira des tranches de tissu pancréatique vivant adaptées à la fois aux études de fonctionnalité et aux enregistrements de cellules immunitaires. L’apparence des tranches en champ clair et sous la lumière réfléchie est illustrée à la Figure 1A,B. Comme nous l’avons vu, les îlots peuvent être trouvés en tranches en utilisant la lumière réfléchie en raison de leur granularité accrue qui se produit en raison de leur teneur en insuline (Figure...

Cette étude présente l’application de tranches de tissu pancréatique vivant à l’étude de la physiologie des îlots et des interactions entre les îlots et les cellules immunitaires.

Observation de la fonction des îlots et des interactions entre les îlots et les cellules immunitaires dans les tranches de tissu pancréatique vivant

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

Notre protocole aidera à répondre à l’impact que les interactions des cellules immunitaires ont sur la fonctionnalité des îlots. La méthode de la tranche de tissu pancréatique vivant permet d’étudier la physiologie et la fonction des îlots tout en maintenant les tissus sous-jacents aux pathologies et au microenvironnement natif. Cette méthode pourrait fournir un aperçu des processus pathologiques des maladies pancréatiques, telles que la pancréatite, le diabète de type I et le diabète de type II.Pour commencer, disposez les blocs sur le porte-échantillon de manière à ce qu’ils ne dépassent pas la largeur de la lame, en veillant à ce que la lame puisse avancer le moins possible lorsque le vibratome se déplace lentement. Appliquez une ligne de super colle sur le porte-échantillon, en faisant une fine couche à l’aide de l’extrémité du distributeur de colle, puis retournez les blocs de tissu sur la colle de sorte que le côté proche du tissu soit orienté vers le haut. Poussez doucement les blocs et laissez la colle sécher pendant trois minutes.Ensuite, fixez la plaque au vibratome avec une vis et ajustez la hauteur de la lame et la distance parcourue de sorte que la lame se déplace sur la longueur des blocs et à peine au-dessus d’eux. Poussez doucement les blocs avec la pince pour vérifier que la colle a séché, puis remplissez le plateau de vibratome avec une solution extracellulaire réfrigérée jusqu’à ce que la lame soit recouverte. Réglez le vibratome pour faire des tranches de 120 micromètres d’épaisseur et démarrez-le, puis observez les tranches qui sortent des blocs de tissu.Soulevez les tranches lorsqu’elles flottent hors du bloc en plaçant un pinceau ou une pince en dessous d’elles et placez les tranches dans un tampon bicarbonate de Krebs-Ringer contenant trois millimolaires de D-glucose et un inhibiteur de la trypsine. Placez les plaques contenant les tranches sur une bascule et incubez à température ambiante pendant une heure à 25 tr/min. Si les tranches doivent être conservées plus longtemps, placez les tranches dans 15 millilitres de milieu de culture en tranches et placez la plaque dans un incubateur.Incuber les tranches préparées à 37 degrés Celsius pour les études du jour même ou transférer les tranches qui sont cultivées à 24 degrés Celsius pendant la nuit à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure avant l’expérience. Allumez le microscope au moins une heure avant l’enregistrement et équilibrez l’incubateur supérieur de la scène à 37 degrés Celsius. Fixez le fond de Petri en verre contenant la tranche sur la scène.Concentrez le microscope en réglant l’objectif 10X en mode champ lumineux et localisez les îlots en utilisant le mode champ lumineux en recherchant des ovales de couleur brun orangé dans la tranche. Basculez le microscope vers l’imagerie confocale en appuyant sur la touche CS du contrôleur à écran tactile du microscope. Pour visualiser les îlots à l’aide de la réflectance, allumez le détecteur laser 638 et le détecteur PMT.Réglez la puissance laser entre un et 2% et éteignez les filtres à encoche. Utilisez le laser de 405 nanomètres et le détecteur PMT pour observer la coloration de l’acide nucléique. Le détecteur hybride pour la détection des anticorps CD8 et le laser de 488 nanomètres et le détecteur hybride pour visualiser le tétramère d’insuline.Centrez l’îlot d’intérêt dans le champ de vision à l’aide des boutons X et Y du contrôleur de scène. Une fois qu’un îlot d’intérêt est localisé, passez à l’objectif 20X et zoomez pour que l’îlot occupe la majeure partie du cadre. Prenez une pile z de l’îlot, puis trouvez les meilleures sections optiques où les cellules sont vivantes et toutes les cellules immunitaires environnantes sont au centre de l’attention.Réglez le microscope pour enregistrer en mode XYZT et optimisez les paramètres pour enregistrer une pile z des étapes sélectionnées toutes les 20 minutes sur une période de plusieurs heures. Les îlots d’une tranche de tissu pancréatique ont été visualisés à l’aide de la microscopie à fond clair et à lumière réfléchie. L’insuline dans les îlots augmente la granularité et provoque l’absorption de grandes quantités de lumière réfléchie, augmentant ainsi la visibilité des îlots.La viabilité d’une tranche de tissu pancréatique humain vivant a été évaluée par coloration. Les cellules vivantes sont indiquées en vert et les cellules mortes en bleu. Un autre indicateur positif de la viabilité est l’activité basale observable.Lorsqu’une tranche pancréatique vivante était chargée d’un indicateur de calcium perméable aux cellules, une stimulation du glucose était observée dans les tranches pancréatiques de souris et d’humains. La fluorescence des cellules individuelles pendant la stimulation du glucose a également été quantifiée. Des îlots intacts et malades ont été observés en utilisant la coloration à la dithizone et la microscopie à lumière réfléchie.Les îlots malades commencent à perdre en granularité en raison de l’infiltration des cellules immunitaires et de la mort cellulaire. Les populations de cellules immunitaires peuvent être identifiées à l’aide d’anticorps CD8 et de la coloration tétramère d’insuline. La co-coloration indique que les cellules sont des lymphocytes T effecteurs qui ciblent spécifiquement l’antigène de l’insuline.La chose la plus critique à retenir dans cette procédure est de garder les tranches dans des solutions d’inhibiteur de protéase à tout moment. Suite à cette procédure, de nombreuses fonctionnalités dans les expériences sur les cellules immunitaires peuvent être effectuées, ce qui permet d’étudier l’effet des interactions entre les cellules immunitaires et la fonction des îlots.

observing-islet-function-islet-immune-cell-interactions-live

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Méthodes assistées par ordinateur du roman achats à grande échelle et d'analyse des échantillons pancréatiques immunohistochimiquement colorées sont décrites: (1) la capture Slice virtuelle de toute la section, l'analyse de masse (2) de données à grande échelle; (3) la reconstruction de la 2D tranches virtuelles (4); cartographie des îlots 3D, et (5) L'analyse mathématique.

Assistée par ordinateur à grande échelle de visualisation et quantification de la messe des îlots pancréatiques, distribution de taille et d&#39;architecture

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des îlots à partir du modèle murin de diabète de type 2, Leprdb et les détails d’un test sur cellules vivantes pour la mesure de la sécrétion d’insuline à partir d’îlots intacts qui utilise la microscopie à 2 photons.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modèle de souris de diabète de type 2: pancréatique isolement des îlots et des cellules vivantes 2-Photon Imaging d&#39;îlots intacts

Ce protocole d'isolement d'îlots a décrit une nouvelle voie d'injection de collagène pour digérer le tissu d'exocrine et une procédure simplifiée de gradient pour purifier les îlots des souris. Il s'agit de la digestion enzymatique, de la séparation/purification des gradients et de la cueillette manuelle des islets. L'isolement réussi peut donner 250-350 îlots de haute qualité et entièrement fonctionnels par souris.

Un protocole simple à haut rendement pour l'isolement des îlettes pancréatiques des souris

Des études ex vivo îlots pancréatiques sont importants pour la recherche sur le diabète. Les techniques existantes pour étudier des îlots cultivés dans leur architecture 3D natif sont chronophages, inefficace et rarement utilisés. Cet ouvrage décrit une méthode nouvelle, simple et efficace pour générer des sections de paraffine de haute qualité des îlots cultivés ensemble.

Îlots pancréatiques, enrobage pour les Sections de paraffine

Ce protocole décrit une méthode pour l'analyse quantitative de la formation complexe de protéine de mitophagie spécifiquement dans les cellules bêta des échantillons humains primaires d'islet. Cette technique permet ainsi l'analyse de la mitophagie à partir de matériel biologique limité, qui sont cruciaux dans les échantillons précieux de cellules bêta pancréatiques humaines précieuses.

Visualisation des complexes mitophatonus endogènes in situ dans les cellules bêta pancréatiques humaines utilisant l'analyse de la ligation de proximité

Ici, nous présentons un protocole pour la formation image et la quantification de la dynamique du calcium dans les populations cellulaires hétérogènes, telles que les cellules des isfètes pancréatiques. Les reporters fluorescents sont livrés dans la couche périphérique des cellules dans l'înet, qui est alors immobilisé et image, et l'analyse par cellule de la dynamique de l'intensité de fluorescence est effectuée.

Imagerie de la dynamique du calcium dans les sous-populations de cellules d'islet pancréatique de souris

Le but de ce protocole est de surveiller en permanence la dynamique du processus d’engraftage des îlots pancréatiques humains et des cellules d’hôte par rapport aux donneurs. Ceci est accompli en transplantant des îlots humains dans la chambre antérieure de l’oeil (ACE) d’un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-receveur de souris suivi d’une imagerie répétée à 2 photons.

Imagerie in vivo longitudinale et quantification des îlots pancréatiques humains Greffant et contribution des cellules hôtes dans la chambre oculaire antérieure

Nous présentons la préparation de tranches de tissu pancréatique aigu et leur utilisation en microscopie confocale à balayage laser pour étudier simultanément la dynamique du calcium dans un grand nombre de cellules vivantes, sur de longues périodes et avec une résolution spatio-temporelle élevée.

Microscopie confocale à balayage laser de la dynamique du calcium dans les tranches de tissu pancréatique aigu de souris

L’imagerie in vivo à haute résolution du pancréas a été facilitée par la fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique.

Visualisation longitudinale stabilisée au niveau cellulaire in vivo du pancréas dans un modèle murin avec une fenêtre d’imagerie intravitale pancréatique

Ce protocole décrit comment générer des coupes de pancréas humain à partir de donneurs d’organes décédés afin d’étudier la fonction cellulaire dans des conditions quasi physiologiques. Cette approche novatrice permet d’étudier les îlots normaux et structurellement endommagés et l’interaction complexe entre les compartiments endocriniens et exocrines.

Génération de coupes de tissu pancréatique humain pour étudier la physiologie endocrinienne et exocrine du pancréas

Découvrez l'observation des îlots pancréatiques et leurs interactions avec les cellules immunitaires dans des tranches de tissu vivant. Cette méthode préserve le microenvironnement natif pour étudier la physiologie isulaire.

Observation de la fonction des îlots et des interactions entre les îlots et les cellules immunitaires dans les tranches de tissu pancréatique vivant (Vidéo) | JoVE Journal

Observation de la fonction des îlots et des interactions entre les îlots et les cellules immunitaires dans les tranches de tissu pancréatique vivant

Explorer plus de vidéos