Name: Essai d’imagerie quantitative in vitro pour la phagocytose des cellules mortes du neuroblastome par iPSC-Macrophages (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Découvrez un protocole d'imagerie in vitro rapide et évolutif pour quantifier l'efferocytose microgliale utilisant des macrophages iPSC et des cellules SH-SY5Y marquées. Cette méthode permet l'analyse détaillée de la fonction phagocytaire dans les maladies neurodégénératives.

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Les auteurs remercient le Dr Val Millar et le Dr Sohaib Nizami pour leur aide en microscopie à haut contenu, et le Dr Daniel Ebner pour l’accès aux microscopes à haute teneur. De plus, les auteurs remercient la Dre Emma Mead pour ses conseils en matière de développement d’essais et Mme Cathy Browne pour son soutien à l’iPSC. Ce travail a été soutenu par l’Alzheimer’s Research UK Oxford Drug Discovery Institute (ARUK ODDI, référence de subvention ARUK-2020DDI-OX), avec un soutien supplémentaire au James Martin Stem Cell Facility Oxford (S.A.C.) de l’Oxford Martin School LC0910-004; Monument Trust Discovery Award de Parkinson’s UK (J-1403); la MRC Dementias Platform UK Stem Cell Network Capital Equipment MC_EX_MR/N50192X/1, Partnership MR/N013255/1 et Momentum MC_PC_16034 Awards.

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<li>Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+macrophages+share+ontogeny+with+MYB-independent+tissue-resident+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages.</a> Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).</li>
<li>Hall-Roberts, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM2+Alzheimer%27s+variant+R47H+causes+similar+transcriptional+dysregulation+to+knockout%2C+yet+only+subtle+functional+phenotypes+in+human+iPSC-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">TREM2 Alzheimer's variant R47H causes similar transcriptional dysregulation to knockout, yet only subtle functional phenotypes in human iPSC-derived macrophages.</a> Alzheimer's Research & Therapy. 12, 151(2020).</li>
<li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+brain+myeloid+expression+profiles+reveal+distinct+microglial+activation+states+and+aspects+of+Alzheimer%27s+disease+not+evident+in+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li>
<li>Aziz, M., Yang, W. L., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current Protocols in Immunology. 100, 1-8 (2013).</li>
<li>Atmaramani, R., Pancrazio, J. J., Black, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+robust+Z%27+factor+for+assay+quality+assessment+in+microelectrode+array+based+screening+using+adult+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Adaptation of robust Z' factor for assay quality assessment in microelectrode array based screening using adult dorsal root ganglion neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 339, 108699(2020).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les microglies ont des fonctions importantes qui affectent l’initiation et la progression des maladies neurodégénératives, y compris la phagocytose des neurones apoptotiques. Une phagocytose microgliale altérée et une phagocytose inappropriée des synapses ont toutes deux été associées à des maladies neurodégénératives, bien que les mécanismes sous-jacents et la causalité ne soient pas bien compris4,23. Cet article décrit un test de phagocytose pour mesurer la phagocytose des cellules apoptotiques par les macrophages iPSC, avec une lecture d’imagerie time-lapse de cellules vivantes ou une microscopie à haute teneur à cellules fixes, ou une combinaison des deux sur un seul essai. Cette polyvalence signifie que le test peut être utilisé pour étudier des événements phagocytaires individuels au fil du temps dans quelques puits ou utilisé pour un dépistage à haute teneur avec plusieurs conditions ou traitements. Étant donné que le test à haute teneur est fixé à un seul point temporel, plusieurs plaques de dosage peuvent être préparées simultanément. Le test à haute teneur a une utilité potentielle pour caractériser les macrophages / microglies avec des variantes génétiques associées à la maladie ou le dépistage des inhibiteurs de petites molécules pour les changements de phagocytose. Le test peut également être facilement adapté pour étudier la phagocytose d’autres modèles de microglies, ou potentiellement d’astrocytes. Le test de phagocytose peut potentiellement être multiplexé avec des taches d’imagerie de cellules vivantes, par exemple des indicateurs de mitochondries, de calcium ou de ROS, et une coloration immunofluorescente post-fixation pour les protéines d’intérêt peut être effectuée. Par rapport aux tests de phagocytose existants qui utilisent des cellules neuronales apoptotiques, les principaux avantages conférés par ce protocole sont que la préparation de la cargaison phagocytaire est relativement simple et rapide, et aboutit à un produit uniforme. D’autres tests induisent l’apoptose des neurones ou SH-SY5Y avec la S-nitroso-L-cystéine pendant 2 h25,l’acide okadaïque pendant 3 h22,la staurosporine pendant 4-16 h26,27,28,29 ou l’irradiation UV pendant 24 h30,et peuvent entraîner des cellules à différents stades d’apoptose. En outre, l’imagerie sur cellules vivantes et les lectures d’imagerie à haut contenu n’ont pas encore été décrites, à la connaissance des auteurs. La principale limitation de l’utilisation de la fixation au paraformaldéhyde pour préparer la cargaison phagocytaire est qu’elle ne récapitule pas complètement le processus d’apoptose, car la fixation empêche les cellules de se diviser en corps apoptotiques, qui sont susceptibles d’être phagocytosés plus rapidement en raison de leur plus petite taille. On ne sait pas quel effet la fixation a sur la sécrétion de signaux nucléotidiques « trouvez-moi » (par exemple, ATP, UDP) de la cellule cible qui attirent les phagocytes. Semblables aux cellules apoptotiques, les SH-SY5Y fixes présentent une certaine perméabilité membranaire à l’iodure de propidium. La perméabilité membranaire est associée à la libération de signaux « trouvez-moi »; cependant, cela n’a pas été étudié dans les SH-SY5Y fixes, et si les nucléotides sont libérés trop rapidement, ils seront emportés avant que les SH-SY5Y ne soient ajoutés aux macrophages iPSC.
La première étape critique du protocole est la coloration des SH-SY5Y morts avec un ester STP d’un colorant fluorescent rouge sensible au pH. Ce colorant réagit rapidement et de manière covalente avec les amines primaires libres à la surface des SH-SY5Y morts. La durée de la coloration n’a pas besoin d’être optimisée; cependant, il faut prendre soin de manipuler le colorant avant l’étiquetage. La réaction de étiquetage ne doit pas être effectuée dans des tampons contenant des amines libres. De plus, il existe un risque de précipitations si le stock de DMSO est dilué dans un tampon aqueux froid ou à une concentration finale élevée. Les précipités apparaîtront comme des objets sombres denses au microscope. De plus, la solution de colorant sensible au pH adhère aux tubes de centrifugeuse en plastique ordinaires et se lave lentement; par conséquent, des tubes à faible liaison sont recommandés pour l’étape d’étiquetage. L’utilisation d’un colorant sensible au pH, au lieu d’un colorant fluorescent permanent, aide à identifier les particules englouties, par rapport aux particules qui se voisinent de la membrane plasmique. Comme il y a une certaine fluorescence à pH neutre, la densité de la cargaison phagocytaire et des macrophages iPSC doit être maintenue suffisamment faible pour une segmentation précise, bien que suffisamment élevée pour que de nombreux événements phagocytaires soient capturés. La microscopie à haute teneur était capable d’identifier avec précision la phagocytose avec une densité moyenne de cargaison dans le puits (plus de 2 SH-SY5Ys par macrophage iPSC). Inversement, en raison de la sensibilité plus faible du microscope dans le spectre rouge profond, la segmentation des macrophages iPSC dans les données d’imagerie time-lapse des cellules vivantes était moins fiable et il était nécessaire d’utiliser une très faible densité de cargaison pour réduire la probabilité de faux positifs (1 SH-SY5Y pour deux macrophages iPSC). La validation de la segmentation et de la densité de la cargaison appropriées doit être effectuée avec des comparaisons entre les puits non traités et les puits traités à la cytochalasine D. Dans un test bien optimisé, la cytochalasine D devrait réduire le nombre moyen de taches par cellule de 90% par rapport aux échantillons non traités.
Une autre étape critique du protocole est la coloration des macrophages iPSC, qui permet d’identifier et de segmenter la cellule dans l’analyse d’image afin que tous les SH-SY5Y externes soient exclus du comptage. Le colorant recommandé est perméable aux cellules, converti en un produit fluorescent insoluble dans le cytoplasme, réparable et non toxique (voir Tableau des matériaux). L’étape de coloration a été optimisée pour l’utilisation de macrophages iPSC avec le test de phagocytose d’imagerie à haute teneur, et nous suggérons qu’elle devrait être ré-optimisée si d’autres types de cellules sont utilisés. La durée de la coloration cellulaire peut être augmentée pour améliorer le dépôt du produit fluorescent insoluble dans les cellules. Si la concentration de colorant est optimisée, il faut veiller à éviter les niveaux toxiques du solvant organique.
Le troisième facteur critique pour le succès du test est l’analyse des données. Les pipelines d’analyse fournis sont destinés à être indicatifs plutôt que normatifs, car les différences d’intensité de coloration ou de morphologie cellulaire peuvent réduire l’efficacité de la segmentation des pipelines telle qu’elle est écrite. Certaines optimisations seront donc nécessaires, avec des tests du pipeline sur des contrôles positifs et négatifs appropriés, et les paramètres qui devraient être optimisés sont indiqués dans le texte du protocole. Les témoins négatifs doivent inclure une condition où les macrophages iPSC sont prétraités avec un puissant inhibiteur de phagocytose tel que la cytochalasine D avant l’ajout de SH-SY5Ys. Un autre contrôle négatif possible est l’ajout des SH-SY5Y à des puits de macrophages iPSC non traités auparavant à la fin du test, 10 minutes avant la fixation, ce qui permet un certain tassement de la cargaison mais est trop court pour qu’une quantité appréciable de phagocytose se produise. Un événement de phagocytose est défini comme un objet fluorescent rouge dans les limites d’un macrophage iPSC, défini par l’algorithme du logiciel à l’aide du canal de fluorescence rouge profond. Si la segmentation des cellules est médiocre(Figure 2),de nombreux SH-SY5Y non phagocytosés à proximité des macrophages iPSC peuvent être inclus par erreur dans l’analyse, c’est-à-dire des faux positifs. Le facteur le plus important pour obtenir une bonne segmentation est la délimitation rigoureuse des macrophages iPSC. La segmentation pour les deux analyses est automatisée, il n’est donc pas possible d’obtenir une segmentation parfaite pour chaque cellule; cependant, quelques paramètres peuvent être ajustés pour rendre la segmentation plus optimale, en utilisant quelques images de test comme référence. Le contrôle de la cytochalasine D est important pour évaluer la segmentation optimale car un nombre élevé d’événements phagocytaires détectés dans cette condition indique que la segmentation est sous-optimale. L’optimisation du pipeline d’analyse des données devrait idéalement être répétée jusqu’à ce que le nombre d’événements phagocytaires par cellule soit inférieur de 80% à 90% dans la condition de cytochalasine D par rapport à l’absence d’inhibiteur.
Les problèmes avec le test de phagocytose qui sont les plus susceptibles de se produire sont: (1) une faible fluorescence sensible au pH chez les témoins positifs, (2) une distribution clairsemée ou inégale des macrophages à la fin du test, ou (3) un nombre élevé de faux positifs dans l’analyse à partir de SH-SY5Y non phagocytosés. Le dépannage de la fluorescence sensible au pH faible doit d’abord vérifier que la coloration des SH-SY5Y a donné une pastille cellulaire avec une forte couleur magenta. Si la couleur est faible, assurez-vous qu’un colorant frais est utilisé, assurez-vous que le tampon d’étiquetage est exempt d’amine, ajoutez un lavage supplémentaire aux SH-SY5Y avant la coloration, vérifiez si le nombre correct de SH-SY5Ys a été coloré, assurez-vous qu’aucun précipité de colorant n’est en évidence et optimisez la concentration d’étiquetage du colorant. Si les SH-SY5Y sont fortement colorés, vérifiez si la concentration ajoutée à la plaque d’essai est correcte et assurez-vous que les macrophages iPSC sont sains et pas trop vieux. Le deuxième type de problème, la distribution inégale des macrophages, peut résulter de la perte de cellules pendant le pipetage et des mesures doivent être prises pour réduire les forces de pipetage subies par les cellules, en évitant les pointes à alésage étroit. Si le problème persiste, réduisez le temps d’incubation du chargement des macrophages iPSC avec un colorant perméant aux cellules. Le troisième problème, concernant l’inclusion erronée de particules non phagocytosées dans l’analyse, indique qu’une plus grande optimisation du pipeline d’analyse est nécessaire. Le dépannage doit d’abord se concentrer sur la segmentation des cellules et sur la question de savoir si le logiciel inclut des objets adjacents. Les paramètres spécifiques qui peuvent être ajustés sont suggérés dans les notes ci-dessous les étapes pertinentes (étapes 6.1.11-6.1.15 pour l’analyse time-lapse sur cellules vivantes et étapes 6.2.4-6.2.8 pour l’analyse à haute teneur). Si la segmentation cellulaire ne peut pas être encore améliorée, l’analyse à haute teneur comporte une étape supplémentaire (étape 6.2.8) qui exclut les macrophages iPSC mal segmentés. En outre, le module qui filtre les taches acceptées de fluorescence sensibles au pH dans les macrophages iPSC peut être optimisé, en augmentant l’intensité seuil des objets acceptés, ce qui devrait aider à exclure les SH-SY5Y non phagocytosés (étape 6.1.17 pour l’analyse time-lapse des cellules vivantes et étape 6.2.11 pour l’analyse à haute teneur).
Nous avons développé deux types de lecture microscopique pour le test de phagocytose qui présentent chacun des avantages et des limites. L’imagerie time-lapse à cellules vivantes a le mérite de fournir des informations supplémentaires sur la cinétique de la phagocytose et est plus largement disponible que les plates-formes d’imagerie à haut contenu. Le logiciel open source recommandé est agnostique à la source du microscope et pourrait être utilisé avec n’importe quel microscope fluorescent de bonne qualité, avec ou sans capacité time-lapse à cellules vivantes. La principale limite de l’imagerie des cellules vivantes est la sensibilité et l’optique limitées, ce qui rend plus difficile la détection et la bonne segmentation des macrophages iPSC. Cette limitation pourrait être atténuée soit en augmentant la durée de la coloration des macrophages iPSC, soit en passant à un microscope plus sensible, le cas échéant. Le test de phagocytose d’imagerie à haute teneur est la lecture recommandée si un système d’imagerie à haute teneur est disponible. Les systèmes d’imagerie à haut contenu permettent un débit plus élevé et des données plus fiables, ce qui permet d’utiliser ce test pour le criblage, dans lequel un Z' robuste de ≥0,7 serait attendu pour la sortie « nombre de taches par cellule »20. Par rapport à la méthode time-lapse à cellules vivantes, la lecture microscopique à haut contenu a une sensibilité plus élevée, un degré plus élevé d’automatisation et de vitesse, plus de puits et de champs d’imagerie peuvent être traités et des images confocales haute résolution sont produites. La segmentation cellulaire est plus efficace avec de bonnes images, et la segmentation est également facilitée par le logiciel d’analyse d’imagerie à haut contenu fournissant plus de méthodes de segmentation cellulaire adaptées aux cellules de forme très irrégulière. Le logiciel d’analyse d’imagerie à haut contenu a également calculé plus de paramètres de phagocytose, par rapport au logiciel open source, tels que le pourcentage de cellules phagocytaires. La principale limite du test de phagocytose à haute teneur est le coût et l’accessibilité du système d’imagerie et du logiciel d’analyse.
En conclusion, le test quantitatif de phagocytose présenté dans cet article est un outil utile pour modéliser la phagocytose microglie des neurones morts in vitro. Les microglies sont modélisées par des macrophages iPSC et les neurones morts sont modélisés par des SH-SY5Ys fixés au paraformaldéhyde. Bien qu’ils ne soient pas les modèles de microglies et de neurones morts/apoptotiques les plus authentiques publiés, ils sont faciles à préparer et évolutifs. Le test lui-même est très polyvalent, avec deux types de lecture d’imagerie détaillée, et il a le potentiel d’être adapté pour une utilisation avec différents modèles de monoculture de microglies / macrophages, ou un type de cellule différent pour agir comme la cargaison phagocytaire. La lecture d’imagerie à haut contenu est avantageuse pour obtenir des données quantitatives et peut être mise à l’échelle pour essayer les modulateurs de petites molécules de la phagocytose, ou les variantes génétiques de dépistage dans les macrophages iPSC. Cependant, étant donné que les systèmes d’imagerie à haut contenu sont coûteux et riches en données, une lecture d’imagerie alternative a été incluse dans le protocole à l’aide d’un microscope accéléré à cellules vivantes, qui pourrait être substitué à tout microscope à fluorescence conventionnel de bonne qualité, si nécessaire.

Les microglies sont des macrophages résidents du tissu cérébral et leurs fonctions comprennent la surveillance immunitaire, la coordination des réponses inflammatoires aux blessures / infections, le remodelage synaptique et la phagocytose des cellules mortes, de la myéline, des agrégats de protéines et des agents pathogènes. La phagocytose est le processus par lequel les microglies reconnaissent la cargaison avec les récepteurs de surface et réorganisent leur cytosquelette pour engloutir l’objet dans un phagosome, qui fusionne ensuite avec des lysosomes pour la dégradation de la cargaison. Microglia phagocytose saine des cellules cérébrales apoptotiques pour les éliminer avant qu’elles ne deviennent nécrotiques1. La phagocytose des cellules apoptotiques est également connue sous le nom d’efférocytose, et nécessite l’affichage d’un signal de phosphatidylsérine « mange-moi » par la cellule mourante2. De nombreux récepteurs de microglies se lient directement à la phosphatidylsérine, notamment TIM-4, BAI1, Stabilin-2 et TREM2. Les récepteurs TAM microgliaux (p. ex. MERTK) et les intégrines se lient indirectement à la phosphatidylsérine, en utilisant respectivement les protéines accessoires GAS6 ou MFG-E8. D’autres signaux « mangez-moi » peuvent être nécessaires pour la reconnaissance des cellules mourantes, notamment des modifications de la glycosylation ou de la charge de protéines de surface; expression des protéines intracellulaires ICAM3, calréticuline, annexine-I à la surface de la cellule; LDL oxydé; ou revêtement de la cellule apoptotique par un complément produit par microglie C1q1,2.
Les maladies neurodégénératives, y compris la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer, la démence frontotemporale et la sclérose latérale amyotrophique ont été associées à une altération de la fonction microgliale, y compris une accumulation de déchets cérébraux tels que des cellules mortes, des fragments de myéline et des agrégats de protéines, et des réponses inflammatoires exagérées à ces stimuli3. La phagocytose peut être altérée dans les maladies neurodégénératives et contribuer à la pathologie, en raison d’une combinaison de vieillissement, d’inflammation ou de variantes de risque génétique spécifiques4,5. D’autre part, il existe également des preuves provenant de modèles animaux de maladies neurodégénératives que la microglie peut phagocytose inappropriée des neurones viables ou des synapses6,7,8. Le mécanisme est susceptible d’être provoqué par l’affichage de la phosphatidylsérine de neurites endommagées, qui est directement détectée par les récepteurs de phagocytose microgliale TREM2 ou GPR56, ou indirectement détectée par le complément soluble C1q recouvrant la membrane enrichie en phosphatidylsérine, conduisant à une phagocytose médiée par CR39,10,11.
Les essais in vitro de la fonction phagocytose, par exemple pour évaluer l’impact phénotypique d’une variante de risque génétique dans la microglie, sont fréquemment effectués à l’aide de cargaisons non physiologiques telles que des perles de latex4. Des bactéries et du zymosan marqués par fluorescence sont également utilisés, qui sont physiologiques mais non pertinents pour les maladies neurodégénératives. Les cargaisons phagocytaires non physiologiques peuvent être utilisées pour détecter des défauts dans la machinerie de base de l’engloutissement phagocytaire, mais ne parviennent pas à modéliser avec précision la première étape de « reconnaissance » de la phagocytose des neurones apoptotiques. La taille, la forme, la rigidité et le type de cargaison dictent également les voies de signalisation intracellulaires qui sont activées, conduisant à différents résultats de l’état d’activation de la microglie. Par exemple, les bactéries E. coli sont petites et rigides, contrairement aux cellules humaines, et les lipopolysaccharides à leur surface sont reconnus par le récepteur de type Toll 4 (TLR4) qui active la phagocytose et les voies de signalisation pro-inflammatoires2,12.
Dans le contexte des études sur les maladies neurodégénératives, une cargaison phagocytaire plus pertinente aurait un affichage de phosphatidylsérine sur les membranes plasmiques des mammifères, et serait idéalement humaine et neuronale, pour inclure des signaux que la microglie est susceptible de rencontrer. Pour ce protocole de phagocytose, la lignée cellulaire de neuroblastome humain SH-SY5Y a été choisie comme modèle de neurone facile à mettre en culture. L’affichage permanent de la phosphatidylsérine de surface a été induit artificiellement par le paraformaldéhyde, dont il a déjà été démontré qu’il provoquait l’affichage de la phosphatidylsérine des plaquettes13. Pour le modèle cellulaire de la microglie, des macrophages iPSC humains ont été utilisés, qui imitent l’ontogenèse et le profil transcriptionnel de la microglie humaine, et sont phagocytairement compétents14,15,16,17. Les macrophages iPSC ne sont pas le modèle de microglie le plus authentique disponible, par exemple, ils n’imitent pas la morphologie des microglies; cependant, on peut le substituer à un modèle de microglie iPSC en monoculture plus authentique si l’on le souhaite, tel que Haenseler et al.15. Les modèles iPSC humains sont préférables à la microglie primaire des rongeurs pour l’étude de la neurodégénérescence, en raison des préoccupations concernant le chevauchement limité des modules transcriptionnels de la microglie observés dans les tissus de maladies neurodégénératives humaines par rapport à la souris18. Les SH-SY5Y morts sont colorés avec un colorant sensible à l’acide qui fluoresce faiblement à pH neutre et plus fortement à l’intérieur des phagolysosomes des macrophages iPSC après phagocytose. L’utilisation d’un colorant sensible à l’acide améliore la précision de la détection des événements phagocytaires, avec une polyvalence pour différentes lectures de macrophages vivants et fixes19. Ce protocole décrit à la fois l’imagerie time-lapse à cellules vivantes de la phagocytose et un test d’imagerie fixe à haute teneur pour la phagocytose, avec les mêmes étapes de préparation cellulaire avant la lecture (Figure 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2.jpg"> Figure 1: Schéma de méthodologie. Contour du test de phagocytose, où la préparation des SH-SY5Y et la coloration des macrophages iPSC sont effectuées en parallèle, puis les SH-SY5Y sont pipetés sur les macrophages iPSC. Soit l’imagerie time-lapse des cellules vivantes est effectuée immédiatement, soit les cellules sont incubées à 37 °C/5 % de CO2 pendant la durée requise et fixées avant d’effectuer une microscopie à haute teneur. PFA: paraformaldéhyde, HBM: milieu tamponné HEPES sans phénol, pHr: colorant fluorescent rouge sensible au pH SOLUTION D’ester STP, PRFMM: milieux macrophages sans phénol rouge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig1v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Tube à centrifuger conique de 15 mL</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td>Pour la centrifugation des cellules</td></tr><tr><td>2-20 & micro ; L, 20-200 et micro ; L, 100-1000 et micro ; L Micropipettes</td><td></td><td></td><td></td>monocanal</tr><tr><td>2-mercaptoéthanol 50 mM</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td>Composant du milieu d’usine</td></tr><tr><td>4 % de paraformaldéhyde dans PBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61899</td><td>Pour la fixation de cellules</td></tr><tr><td>Plaque 6 puits, culture tissulaire traitée</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AggreWell-800 Plaque 24 puits</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>34815</td><td>Plaque à 24 puits à faible adhérence pour la formation de corps embryoïdes Kit de</td></tr><tr><td>coloration / détection de l’apoptose de l’annexine V-FITC</td><td>Abcam</td><td>ab14085</td><td>Kit de coloration de l’annexine V-FITC , en tant que test pour le contrôle de la qualité des SH-SY5Y fixes. Le kit contient un tampon de liaison à l’annexine, de l’annexine V-FITC et de l’iodure de propidium.</td></tr><tr>Compteur <td></td><td></td><td></td><td>de cellules automatisé</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td></td><td></td><td></td>de paillasse</tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td></td><td></td><td></td>de paillasse</tr><tr><td>CellCarrier-96 Ultra, traitées pour culture tissulaire, noires, 96 puits avec couvercle</td><td>Perkin Elmer</td><td>6055302</td><td>Microplaque traitée par culture tissulaire (TC) à 96 puits avec parois noires et fond optiquement transparent, pour le dosage de</td></tr> <tr><td>la phagocytoseLogiciel</td><td></td><td></td><td>open-source pour l’analyse d’images de phagocytose obtenues par microscope time-lapse sur cellule vivante. Téléchargez-le gratuitement sur le site (http://cellprofiler.org/), ce protocole utilisé en version 2.2.0.</td></tr><tr><td>Colorant CellTracker Deep Red</td><td>Thermo Fisher</td><td>C34565</td> Colorant réactif à <td>l’ester succinimidylique, fluorescent rouge foncé, perméable aux cellules, pour la coloration du cytoplasme des macrophages iPS. Dissoudre le colorant CellTracker Deep Red dans du DMSO à 2 mM (1,4 mg/mL). Utilisation à 1 &mu ; M, par dilution d’une souche de DMSO avec un milieu de macrophages.</td></tr><tr>Armoire <td></td><td></td><td></td><td>de sécurité à flux d’air laminaire de classe 2</td></tr><tr><td>Bouteille</td><td></td><td></td> de gaz CO2 <td>Accessoire pour incubateur EVOS FL Auto</td></tr><tr><td>CO2, réglé à 37&deg ; C et 5 % CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Columbus Système de stockage et d’analyse de données d’images</td><td>Perkin Elmer</td><td>Columbus</td><td>Plate-forme de stockage et d’analyse de données pour Opera Phenix. Prend en charge tous les principaux instruments de criblage à haut contenu.</td></tr><tr><td>Cytochalasine D</td><td>Cayman</td><td>11330</td><td>Traitement de contrôle négatif pour le dosage de la phagocytose. Reconstituer dans le DMSO à 10 mM et stocker les aliquotes à -20&deg ; C, évitez d’autres cycles de gel-dégel. Utilisation à la concentration finale 10 & micro ;M.</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320074</td><td>Composant du média SH-SY5Y</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Solvant pour colorants CellTracker et pHrodo</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto Imaging System</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMF4300</td><td>Microscope d’imagerie time-lapse Live-cell</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube CY5</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMEP4656</td><td>Accessoire pour EVOS FL Auto</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMEP4650</td><td>Accessoire pour EVOS FL Auto</td></tr><tr><td>EVOS Light Cube RFP</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMEP4652</td><td>Accessoire pour EVOS FL Auto</td></tr><tr><td>EVOS Onstage Incubator</td><td>Thermo Fisher</td><td>AMC1000</td><td>pour EVOS FL Auto</td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>Composant du milieu SH-SY5Y</td></tr><tr><td>Cytomètre en flux Cytométrie</td><td></td><td></td><td></td></tr> en <tr><td>flux logiciel</td><td></td><td></td><td></td>d’analyse</tr><tr><td>Geltrex sans LDV, qualifié hESC, facteur de croissance réduit Matrice de membrane basale</td><td>Invitrogen</td><td>A1413302</td><td>Matrice de membrane basale qualifiée hESC pour la culture iPSC</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplément</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td>Composant du milieu d’usine et du milieu macrophage</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Lonza</td><td>BE 10-547F</td><td>Hank' solution saline équilibrée pour les étapes de lavage</td></tr><tr><td>Recombinant humain BMP4</td><td>Gibco</td><td>PHC9534</td><td>Composant du milieu corporel embryoïde</td></tr><tr><td>Recombinant humain IL-3</td><td>Gibco</td><td>PHC0033</td><td>Composant du milieu d’usine et du milieu macrophage</td></tr><tr><td>Recombinant humain SCF</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-096-695</td><td>Composant du milieu corporel embryoïde</td></tr><tr><td>Recombinant humain VEGF</td><td>Gibco</td><td>PHC9394</td><td>Composant d’un milieu corporel embryoïde</td></tr> Solution <tr><td>d’imagerie de cellules vivantes</td><td>Thermo Fisher</td><td>A14291DJ</td><td>Milieu tamponné HEPES sans rouge de phénol pour l’étiquetage des tubes morts SH-SY5Ys</td></tr><tr><td>Low protein binding Tubes de 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108.132</td><td>Pour la coloration SH-SY5Ys</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHC9501</td><td>Composant des milieux d’usine et de macrophage</td></tr><tr><td>mTeSR1 Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>Média iPSC</td></tr><tr>Pipette <td></td><td></td><td>multicanaux 20-200 uL</td><td>Pour la manipulation de liquides de plaques à 96 puits</td></tr><tr><td>NucBlue Live ReadyProbes Réactif</td><td>Thermo Fisher</td><td>R37605</td><td>Hoechst 33342 formulation dans un flacon compte-gouttes pour la coloration des noyaux de macrophages iPS, utilisez 0,5 gouttes/mL dans un milieu de macrophages.</td></tr><tr><td>Système de dépistage à haut contenu Opera Phenix</td><td>Perkin Elmer</td><td>HH14000000</td><td>Microscope d’imagerie à haut contenu, utilisé avec la version 4.9 du logiciel Harmony.</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Composant du milieu d’usine, de macrophage et de SH-SY5Y</td></tr><tr><td>pHrodo iFL Red STP-Ester</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36011</td><td>Colorant fluorescent rouge sensible au pH pour l’étiquetage des SH-SY5Y morts. Reconstituer la poudre d’ester rouge STP pHrodo iFL dans du DMSO à une concentration de 5 mg/mL. Pour chaque 1 million de SH-SY5Ys, ajoutez 2,5 &mu ; L (12,5 &mu ; g) de la souche d’esters rouges STP pHrodo iFL dans des cellules préchauffées en suspension dans une solution d’imagerie de cellules vivantes.</td></tr><tr><td>Remplisseuse de pipette sérologique Fiole</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T175, traitée</td><td></td><td></td> pour culture tissulaire <td>Récipient pour différenciation des précurseurs iPSC-macrophages, connu sous le nom de « Usines"</td></tr><tr><td>Fiole</td><td></td><td></td> T75 <td>Récipient pour la culture SH-SY5Y</td></tr><tr><td>Scelleuses de plaques transparentes</td><td>Greiner Bio-One</td><td>676001</td><td>Pour le stockage et le transport des plaques d’essai</td></tr><tr><td>TrypLE Express (1X), sans rouge de phénol Gibco</td><td></td><td>12604013</td><td>Tampon de dissociation cellulaire contenant des enzymes recombinantes de type trypsine et 1,1 mM d’EDTA, utiliser pur.</td></tr><tr><td>Bain-marie, réglé à 37&deg ; </td><td></td><td></td><td></td>C</tr><tr><td>X-VIVO 15 Milieu avec L-glutamine, gentamicine et rouge de phénol</td><td>Lonza</td><td>BE04-418F</td><td>Composant d’un milieu d’usine et de macrophage</td></tr><tr><td>X-VIVO 15 Milieu avec L-glutamine, sans gentamicine ni rouge de phénol</td><td>Lonza</td><td>04-744Q</td><td>Milieu de macrophages sans rouge de phénol, pour une utilisation en phagocytose sans additifs ni facteurs de croissance</td></tr></tbody></table>

essai d’imagerie quantitative in vitro pour la phagocytose des cellules mortes du neuroblastome par ipsc-macrophages

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Les microglies orchestrent les réponses neuroimmunes dans plusieurs maladies neurodégénératives, dont la maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer. La microglie élimine les neurones morts et mourants grâce au processus d’efférocytose, une forme spécialisée de phagocytose. La fonction de phagocytose peut être perturbée par des facteurs de risque environnementaux ou génétiques qui affectent la microglie. Cet article présente un protocole de microscopie in vitro rapide et simple pour étudier l’efférocytose microgliale dans un modèle de microglie de cellules souches pluripotentes induites (iPSC), en utilisant une lignée cellulaire de neuroblastome humain (SH-SY5Y) étiquetée avec un colorant sensible au pH pour la cargaison phagocytaire. La procédure entraîne un rendement élevé de cellules mortes du neuroblastome, qui présentent de la phosphatidylsérine de surface, reconnue comme un signal « mangez-moi » par les phagocytes. Le test sur plaque à 96 puits convient à l’imagerie accélérée de cellules vivantes, ou la plaque peut être fixée avec succès avant un traitement ultérieur et quantifiée par microscopie à haute teneur. La microscopie à haute teneur à cellules fixes permet d’étendre le test pour le dépistage d’inhibiteurs de petites molécules ou l’évaluation de la fonction phagocytaire des lignées génétiques iPSC. Bien que ce test ait été développé pour étudier la phagocytose de cellules de neuroblastome mortes entières par des macrophages iPSC, le test peut être facilement adapté à d’autres cargaisons pertinentes pour les maladies neurodégénératives, telles que les synaptosomes et la myéline, et d’autres types de cellules phagocytaires.

L’imagerie time-lapse de cellules vivantes a été réalisée à l’aide du protocole décrit précédemment, avec des macrophages iPSC de type sauvage ensemencés à 20 000 cellules par puits. Différentes quantités de SH-SY5Y ont été appliquées (10 000-30 000 par puits, selon les estimations du nombre de cellules à l’étape 3.1), et l’inhibiteur de la phagocytose cytochalasine D a été pré-incubé (1 h) avec certains puits, agissant comme un contrôle pour inhiber la phagocytose pour chaque quantité de SH-SY5Ys. L’imagerie a commencé 40 minutes après l’ajout de SH-SY5Y et les images ont été capturées à des intervalles de 5 minutes pendant les 3 heures suivantes (les données incluent le délai initial de 40 minutes). Une vidéo time-lapse représentative est incluse dans les données supplémentaireset les données quantitatives analysées illustrées à la figure 3. Avec la quantité de 10 000 SH-SY5Ys par puits, le nombre de particules phagocytosées (taches) par cellule a augmenté linéairement avec le temps, et a été inhibé d’environ 50% par la cytochalasine D. L’inhibition par la cytochalasine D a été plus faible que prévu, probablement causée par des répliques techniques ou biologiques insuffisantes, car un seul puits par condition a été imagé avec trois champs d’image. Avec des quantités plus élevées de SH-SY5Y par puits (20 000 et 30 000), la phagocytose présentait une faible linéarité, probablement en raison d’une mauvaise segmentation des macrophages iPSC et des SH-SY5Y dans un champ de vision plus encombré.
L’imagerie à haute teneur en cellules fixes a été réalisée à l’aide du protocole décrit précédemment, avec des macrophages iPSC de type sauvage à 20 000 cellules par puits, plusieurs quantités différentes de SH-SY5Y (10 000 à 80 000 par puits), et la plaque d’essai a été fixée et imagée après 5 h. Une image représentative de la phagocytose est présentée à la figure 4A, et les données analysées montrées à la figure 4B17. L’augmentation de la quantité de SH-SY5Y a entraîné un nombre plus élevé de particules phagocytosées (taches) par cellule; cependant, un doublement de la quantité de SH-SY5Y n’entraîne qu’une augmentation de 1,5 fois du nombre de taches par cellule. Cela indique que les quantités testées ne limitent pas le taux de phagocytose. Par la suite, le test de phagocytose d’imagerie à haute teneur a été validé à l’aide de plusieurs inhibiteurs de la phagocytose (Figure 4C)17. Les inhibiteurs de la polymérisation de l’actine cytochalasine D et jasplakinolide ont significativement inhibé la phagocytose de 91% et 90%, respectivement, lorsqu’ils ont été pré-incubés pendant 1 h avant la phagocytose. Le Z' robuste du test lorsque la cytochalasine D ou le jasplakinolide sont utilisés comme témoins négatifs est calculé comme 0,7 et 0,8, respectivement20. L’inhibiteur de l’acidification des lysosomes, la bafilomycine A1, a significativement réduit la phagocytose de 31%, lorsqu’il est incubé 1 h avant la phagocytose. L’effet plus faible de l’inhibiteur d’acidification du lysosome par rapport aux inhibiteurs de l’actine suggère que la détection de la cargaison internalisée peut ne pas nécessiter une acidification complète du phagosome. L’annexine V recombinante a été utilisée comme témoin pour bloquer spécifiquement la phosphatidylsérine exposée à la surface des SH-SY5Y, empêchant les récepteurs phagocytaires d’accéder au ligand, un signal important de « manger-moi ». L’ajout d’annexine V recombinante a considérablement réduit la phagocytose de 30 %, lorsqu’elle est ajoutée aux puits immédiatement avant l’ajout de SH-SY5Y. Il a été confirmé que les SH-SY5Y fixes exposaient la phosphatidylsérine à l’aide d’une sonde fluorescente annexine V, tandis que les SH-SY5Y vivants étaient négatifs pour la coloration à l’annexine V(figure 4D).
Le récepteur microglial de la phagocytose TREM2 s’est déjà avéré important pour la phagocytose des neurones apoptotiques21. La mutation R47H de TREM2 est un gène de risque d’apparition tardive de la maladie d’Alzheimer et est supposée réduire la liaison au ligand de TREM223. Dans le but d’évaluer la fonction phagocytaire de R47H TREM2 et TREM2 KO, le test de phagocytose à haute teneur en cellules fixes a été réalisé à l’aide de lignées isogéniques de macrophages iPSC avec WT/R47H/KO TREM217. Plusieurs longueurs de durée de phagocytose de 1 à 5 h ont été testées, en utilisant une addition échelonnée de cargaison phagocytaire (40 000 SH-SY5Ys). Le signal résultant augmente linéairement jusqu’à 4 h, se stabilisant légèrement à 5 h (Figure 5)17. Une réduction du taux et de la capacité de phagocytose (% de cellules positives ponctuelles) était évidente dans le TREM2 KO par rapport à WT, tandis que le mutant R47H TREM2 n’a pas montré de phagocytose altérée. Le défaut phagocytaire dans les cellules TREM2 KO n’est pas phénocopié par la mutation R47H TREM2, apparemment parce que la fonction TREM2 est suffisante pour soutenir une phagocytose normale.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2.jpg"> Figure 3: Exemples de données pour le test de phagocytose time-lapse à cellules vivantes. Absorption des SH-SY5Y morts par les macrophages iPSC de type sauvage BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) imagés à des intervalles de 5 minutes pendant 3 h. Les temps affichés sur le graphique sont à partir de l’initiation de la phagocytose, y compris les 40 premières minutes sans mesure. Le nombre moyen de taches par cellule provenant de trois puits répliqués est tracé. La phagocytose de 10 000 SH-SY5Ys est inhibée par 10 μM de cytochalasine D avec 1 h de prétraitement, tandis que des quantités plus élevées de SH-SY5Y (20 000 et 30 000) ont une quantification sous-optimale de la phagocytose. Moyenne ± écart-type (ET), N = 1 expérience. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig3v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2.jpg"> Figure 4: Optimisation et validation du test de phagocytose à haute teneur à cellules fixes. (A) Image microscopique représentative à haute teneur de SH-SY5Ys phagocytosé par des macrophages iPSC de type sauvage BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). Un point temporel de 3 h avec 40 000 SH-SY5Ys est affiché. Les canaux de fluorescence sont fusionnés, avec la coloration des macrophages iPSC en rouge, les noyaux en bleu et les SH-SY5Y en jaune. Le panneau en médaillon est une section de l’image agrandie de 3x. (B) Le nombre de taches par cellule de SH-SY5Y morts phagocytosés après 5 h, en utilisant différentes quantités de cargaison ajoutées aux macrophages iPSC de type sauvage. Moyenne ± erreur-type de la moyenne (SEM), pour N = 3 récoltes. (C) La phagocytose (3 h) est inhibée avec 10 μM de cytochalasine D (Cyt), 1 μM de bafilomycine A1 (Baf), 1 μM de jasplakinolide (avec 1 h de prétraitement; Jas), et 13 μg/mL d’annexine V recombinante (ajoutée simultanément aux SH-SY5Y morts; Ann). Les macrophages iPSC sans SH-SY5Y ajoutés ont été utilisés comme témoin négatif (-ve), et le contrôle positif (+ve) est des macrophages iPSC non traités avec SH-SY5Y ajoutés. Les données ont été normalisées à la moyenne pour la répétition de l’expérience. Moyennes ± SEM, pour N = 3-6 récoltes et avec deux lignées cellulaires de type sauvage (SFC840-03-03, la caractérisation de cette lignée est décrite dans (Fernandes et al.21 et BIONi010-C). ANOVA 1 voie avec le test post-hoc de Dunnett, comparaisons avec des cellules non traitées. *p &lt; 0,05, ***p &lt; 0,001. (D) Les SH-SY5Y fraîchement fixés se colorent uniformément pour l’affichage de la phosphatidylsérine (annexine V-FITC) et ont une perméabilité cellulaire limitée (iodure de propidium). Les SH-SY5Y vivants ne tachent pas l’annexine V-FITC ou l’iodure de propidium, à l’exception de la coloration focale présente sur les quelques cellules mortes en culture. Les chiffres sont reproduits avec la permission d’Alzheimer’s Research &amp; Therapy17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig4v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2.jpg"> Figure 5: La phagocytose est réduite dans TREM2 KO mais pas chez les macrophages R47H TREM2 iPSC. Test de phagocytose à haute teneur effectué avec 40 000 SH-SY5Ys par puits avec des ajouts échelonnés. Les moyennes ont été quantifiées pour les paramètres : nombre de taches par cellule, somme des zones ponctuelles (μm2)par cellule et pourcentage de cellules contenant des particules phagocytosées par champ. Les données ont été normalisées pour signifier pour chaque génotype par expérience. Moyenne ± SEM, pour N = 3 récoltes. ANOVA à 2 voies à mesures répétées, test post-hoc de Dunnett, comparaisons par paires avec le WT pour chaque fois: *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01, ***p &lt; 0,001. Les chiffres sont reproduits avec la permission d’Alzheimer’s Research &amp; Therapy17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/62217fig5v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire S1 : Exemple de CQ pour la préparation de SH-SY5Ys. Les SH-SY5Y dissociés ont été fixés pendant 10 minutes avec 0% (cellules vivantes), 1% et 2% de paraformaldéhyde (PFA), puis lavés. Les cellules ont été colorées avec de l’annexine V-FITC et de l’iodure de propidium (IP) et immédiatement mesurées par cytométrie en flux. Des diagrammes de points de densité de couleur ont été créés dans un logiciel d’analyse de cytométrie en flux, en utilisant les commandes à un seul point coloré et non coloré pour placer une porte quadrant. Les quadrants sont annotés avec le pourcentage d’événements dans ce quadrant. Les cellules vivantes sont principalement au Q4, et les cellules fixes sont principalement au Q2. Q1 = annexine V-/PI-, Q2 = annexine V+/PI+, Q3 = annexine V+/PI-, Q4 = annexine V-/PI- (cellules vivantes). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Figure%20S1.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Vidéo supplémentaire : Phagocytose time-lapse à cellules vivantes. Vidéo time-lapse représentative des SH-SY5Y phagocytosés par les macrophages iPSC de type sauvage BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). Les images ont été prises toutes les 5 minutes pendant 3 h. La vidéo est recadrée et s’exécute à 3 images par seconde, montrant les dernières 1,5 heure du test. Les SH-SY5Y colorés aux colorants sensibles à l’acide sont représentés en rouge, l’intensité du signal augmentant avec l’acidification des phagosomes. Les noyaux cellulaires colorés avec Hoechst 33342 sont représentés en bleu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62217/Supplementary%20Video.avi" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.</a>

Les maladies neurodégénératives sont associées à des fonctions microgliales dérégulées. Cet article décrit un test in vitro de phagocytose des cellules de neuroblastome par les macrophages iPSC. Les lectures de microscopie quantitative sont décrites à la fois pour l’imagerie time-lapse sur cellules vivantes et l’imagerie à haut contenu à cellules fixes.

Essai d’imagerie quantitative in vitro pour la phagocytose des cellules mortes du neuroblastome par iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Ce test d’imagerie in vitro permet de quantifier l’effet de différents traitements cellulaires ou de différents génotypes sur la phagocytose microgliale. En utilisant deux types de cellules pertinentes pour les maladies neurodégénératives, nous utilisons des cellules de neuroblastome mortes pour la cargaison phagocytaire, qui sont préparées d’une manière qui peut être facilement et à moindre coût mise à l’échelle par de grands écrans d’imagerie à haut contenu. Dans une armoire de sécurité biologique de classe 2, dissocier les SH-SY5Y en aspirant le milieu.Ajouter 4 ml de tampon de dissociation cellulaire et retirer immédiatement le tampon afin qu’il reste moins de 1 ml sous forme de film mince recouvrant les cellules. Incuber pendant 2 à 3 minutes à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Puis à 10 ml de HBSS dans la fiole T-75.Et pipettez les SH-SY5Ys dans un tube de centrifugeuse conique de 15 ml. Centrifuger à 400xG pendant 5 minutes. Aspirer le surnageant et re-suspendre les cellules dans 2 ml de milieu tamponné HEPES sans phénol rouge, en veillant à briser les amas avant la fixation.Fixez les cellules en ajoutant 2 ml de formaldéhyde de puissance 4% au tube et en incubant pendant 10 minutes à température ambiante avec une agitation douce occasionnelle. Ajouter 10 ml de HBSS dans le tube. Ensuite, centrifugez à 1200xG pendant 7 minutes.Aspirer le surnageant et suspendre à nouveau la pastille cellulaire dans 2 ml de milieu tamponné HEPES sans rouge de phénol. Compter et retirer 1 million de cellules HS-SY5Y dans un tube de 2 ml à faible teneur en protéines. Porter le volume total à 300 à 500 microlitres avec des milieux tamponnés HEPES sans phénol rouge.Ensuite, réchauffez brièvement le tube dans un bain-marie de 37 degrés Celsius. Reconstituer l’ester STP du colorant fluorescent rouge sensible au pH conformément aux instructions du fabricant. Ajoutez ensuite 12,5 microgrammes de colorant par million de cellules SH-SY5Y.Mélanger doucement en agitant le tube. Et incuber le tube à température ambiante pendant 30 minutes, à l’abri de la lumière. Ajouter 1 ml de HBSS et centrifuger à 1200xG pendant 7 minutes et 4 degrés Celsius.Jetez le surnageant. Et laver avec 2 ml de HBSS. Ressuscez la pastille cellulaire dans un milieu de macrophages sans phénol à une concentration de 0,2 à 1,2 million de cellules par ml, de sorte que 50 microlitres contiennent 10 000 à 60 000 cellules.Dans une armoire de sécurité biologique, préparer une solution de colorant réactif succinimidyl ester-réactif aux cellules fluorescentes rouge foncé dans des milieux macrophages. Ajouter Hoechst 33342 et réchauffer la solution de travail à 37 degrés Celsius au bain-marie. Aspirer doucement le milieu macrophage iPSC en pipetant le surnageant de la cellule avec une pipette multicanal dans un réservoir stérile.Ajouter 70 microlitres par puits de la solution de colorant aux macrophages iPSC à l’aide d’une pipette multicanal. Incuber pendant 1 heure à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Réparer les traitements expérimentaux dans des milieux macrophages sans phénol rouge.Après l’incubation, aspirer très doucement le milieu macrophage iPSC avec une pipette multicanal et ajouter 100 microlitres de HBSS par puits. Retirez immédiatement hbSS par pipetage doux. Ajoutez ensuite 100 microlitres de milieux de macrophages sans phénol rouge, ainsi que des traitements expérimentaux dans des puits séparés.Incuber pendant 10 minutes à 1 heure à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Utilisez une pipette multicanal pour ajouter 50 microlitres des SH-SY5Y étiquetés par puits sur les côtés de chaque puits au bord du liquide. Ensuite, incubez à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 3 à 5 heures.Après l’incubation de la phagocytose, aspirer doucement les surnageants cellulaires en pipetant avec une pipette multicanal et les jeter. Laver une fois avec 100 microlitres de PBS. Ensuite, fixez les cellules en ajoutant 100 microlitres de formaldéhyde à 2% de puissance et en incubant pendant 15 minutes à température ambiante.Aspirez les puits et ajoutez 100 microlitres de PBS. Passez directement à l’imagerie avec le microscope à haut contenu, ou couvrez avec un scellant à plaque et une feuille, et stockez la plaque à 4 degrés Celsius, jusqu’à ce que cela soit nécessaire. Allumez le microscope d’imagerie à haut contenu et ouvrez le logiciel de capture d’image.Chargez la plaque d’essai dans le microscope en cliquant sur l’icône LOAD en haut de l’écran. Sélectionnez l’onglet SETUP ». Dans les menus déroulants en haut à gauche, sélectionnez le type de plaque approprié.L’option autofocus: deux pics"L’objectif: 40x Eau, NA 1.1 « Mode confocal » et Binning de 1. Rincez l’objectif Eau 40x avant utilisation via le menu des paramètres. Dans la zone de sélection des canaux, utilisez l’icône plus pour ajouter les canaux DAPI, Alexa 647 et Alexa 568.Réglez-les pour qu’ils mesurent à un seul plan d’un micromètre. Optimisez les réglages de temps et de puissance pour l’efficacité de coloration de la plaque d’essai. Assurez-vous que les canaux ne sont pas mesurés simultanément, en cliquant sur la séquence de canaux pour séparer les canaux.Sous Navigation et définition de la disposition, sélectionnez les puits de mesure et sélectionnez 9 à 12 champs par puits. Pendant la configuration, cliquez sur un champ représentatif sur la carte des plaques. Et vérifiez chaque canal de mesure à tour de rôle pour vous assurer que la coloration est présente et que les images sont mises au point en ajustant le décalage du canal.Pour télécharger les données sur un serveur pour une analyse à distance, cliquez sur la case des tâches en ligne et sur le nom d’écran correspondant. Enregistrez le protocole de test en cliquant sur le bouton « enregistrer », puis cliquez sur l’onglet Exécuter l’expérience en haut. Nommez la plaque d’expérience, puis cliquez sur démarrer"Un test de phagocytose de temps de vie de cellule vivante a montré qu’avec 10 000 SH-SY5Ys par puits, le nombre de particules de phagocytose par cellule augmentait linéairement avec le temps et était inhibé d’environ 50% par la cytochalasine D.Avec des quantités plus élevées de SH-SY5Y par puits, la phagocytose présentait une faible linéarité, probablement en raison d’une mauvaise segmentation de l’iPSC, macrophages et SH-SY5Y dans un champ de vision plus encombré.Les résultats suivants ont été obtenus en effectuant une imagerie à haute teneur en cellules fixes, y compris cette image représentative de la phagocytose. L’augmentation de la quantité de SH-SY5Y a entraîné un nombre plus élevé de particules phagocytosées par cellule. Le test de phagocytose a été validé à l’aide de plusieurs inhibiteurs de la phagocytose.La cytochalasine D et le jasplakinolide ont inhibé de manière significative la phagocytose de 91 et 90% respectivement. Et la bafilomycine A1 a significativement réduit la phagocytose de 31% lorsqu’elle est pré-incubée pendant 1 heure avant la phagocytose. L’ajout d’annexine 5 recombinante a considérablement réduit la phagocytose de 30 % lorsqu’elle est ajoutée aux puits immédiatement avant l’ajout de SH-SY5Y.Il est confirmé que nous avons corrigé les SH-SY5Ys pour exposer la phosphatidylsérine à l’aide d’une sonde fluorescente Annexin 5. Alors que les SH-SY5Y vivants étaient négatifs pour la coloration annexine 5. Plusieurs longueurs de durée de phagocytose, de 1 à 5 heures, ont été testées en utilisant l’ajout échelonné de cargaison phagocytaire.La longueur totale de ce protocall peut être raccourcie en préparant la cargaison phagocytaire et en colorant les macrophages iPSC en parallèle. Si vous voulez le faire, travaillez à l’avance sur les horaires et utilisez vos incubations pour préparer des solutions pour les étapes futures.

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