Récolte et désagrégation : une étape négligée dans la recherche sur les méthodes de biofilm

L’objectif global de ces procédures est de récolter et de désagréger les biofilms de manière optimale afin d’augmenter la reproductibilité. Trois techniques seront démontrées dans cette vidéo, chacune se concentrant sur la récolte et la désagrégation à partir d’un type de surface différent. Cette vidéo démontrera les techniques appropriées pour un, vortex et sonication du biofilm sur une surface dure non poreuse telle qu’un coupon en polycarbonate du réacteur de biofilm cdc.

Deuxièmement, le raclage et l’homogénéisation du biofilm de la surface dure en verre borosilicate non poreux que l’on trouve couramment dans le réacteur à écoulement goutte à goutte. Et troisièmement, le grattage, le vortex et la sonication du biofilm d’une surface de tube en silicone poreuse que l’on trouve couramment dans le modèle de cathéter. Bonjour, je m’appelle Kelly Buckingham-Meyer ici au Laboratoire des méthodes normalisées du biofilm.

Dans notre laboratoire, nous décomposons les méthodes de biofilm en quatre composantes : la croissance, le traitement, l’échantillonnage et l’analyse. Dans la littérature évaluée par des pairs, les détails sur la façon dont les biofilms sont échantillonnés ou récoltés et désagrégés à partir d’une surface sont généralement rares. C’est la raison de cette vidéo.

Étant donné que notre laboratoire développe et teste des méthodes normalisées de biofilm, nous avons effectué une analyse approfondie de la littérature où les trois méthodes de récolte et de désagrégation de biofilm les plus courantes ont été identifiées. Ces méthodes consistent à vortexer et à soniquer le biofilm à partir d’un coupon en polycarbonate, à gratter et à homogénéiser le biofilm à partir d’un coupon en verre borosilicate, et à gratter, vortexer et soniquer le biofilm à partir de tubes en silicone. Bien que les méthodes écrites sur papier soient puissantes, nous espérons que la vidéo avec les détails techniques présentés par ma collègue Lindsey Miller et moi vous serons utiles.

Pour commencer, cultivez le biofilm mature pseudomonas aeruginosa 15442 selon la norme ASTM E2562, la méthode d’essai standard pour la quantification du biofilm pseudomonas aeruginosa cultivé avec un cisaillement élevé et un flux continu à l’aide du réacteur de biofilm CDC. À la fin de la période de croissance de 48 heures, préparez-vous à traiter et à échantillonner les coupons conformément à la norme ASTM E2871, la méthode d’essai standard pour déterminer l’efficacité du désinfectant contre le biofilm cultivé dans le réacteur de biofilm du CDC à l’aide de la méthode du tube unique. Ensuite, insérez de manière aseptique des pare-éclaboussures autoclavés dans des tubes coniques stériles de 50 millilitres à l’aide de pinces stérilisées à la flamme.

Répétez l’opération pour tous les tubes qui recevront un traitement. Les tubes pour coupons de contrôle n’ont pas besoin d’un pare-éclaboussures. Retirez de manière aseptique une tige du réacteur à biofilm CDC et rincez-la dans 30 millilitres d’eau de dilution stérile.

Cela éliminera les cellules lâchement attachées du biofilm. Maintenez la tige parallèlement à la paillasse au-dessus des tubes d’échantillonnage avec des pare-éclaboussures. À l’aide d’une clé Allen stérilisée à la flamme, desserrez les vis de réglage pour faire tomber un coupon enduit de biofilm dans le tube.

Répétez l’opération pour le nombre de coupons souhaité. Retirez les pare-éclaboussures et placez-les dans un récipient séparé pour la stérilisation. À l’aide d’une pipette sérologique de cinq millilitres, pipettez lentement quatre millilitres de traitement ou de contrôle dans les tubes afin que le liquide s’écoule à l’intérieur de la paroi du tube.

Faites tourbillonner doucement le fond du tube afin que toutes les bulles d’air sous le coupon soient déplacées. Prévoyez 30 à 60 secondes entre chaque ajout. À la fin du temps de contact spécifié, pipettez 36 millilitres de neutralisant dans les tubes dans le même ordre que le traitement ou le contrôle a été appliqué.

Vortex chaque tube sur le réglage le plus élevé pendant 30 plus ou moins cinq secondes et assurez-vous qu’un vortex complet est atteint. Placez les tubes dans le rack à tubes suspendu dans le sonicateur dégazé de manière à ce que le niveau d’eau dans le bain soit égal au niveau d’eau dans les tubes. Soniquez les échantillons à 45 kilohertz, 100% de puissance et un fonctionnement normal pendant plus ou moins cinq secondes.

Répétez les cycles de vortex et de sonication et terminez par un vortex final, pour un total de cinq cycles. Enfin, diluer l’échantillon en série, plaquer la dilution sur une gélose R2A et incuber les plaques pendant 24 heures à 36 degrés Celsius. Comptez les colonies en fonction de la méthode de placage et enregistrez les données.

Cette prochaine technique de récolte et de désagrégation du biofilm est utile pour les coupons durs non poreux qui sont la norme dans le réacteur à écoulement goutte à goutte. Cultiver un biofilm mature de Pseudomonas aeruginosa 15442 selon la norme ASTM E2647, la méthode d’essai standard pour la quantification du biofilm de Pseudomonas aeruginosa cultivé à l’aide d’un réacteur de biofilm à écoulement goutte à goutte avec un faible cisaillement et un écoulement continu. Configurez la station d’échantillonnage pour inclure une planche d’échantillonnage, de l’éthanol à 95% dans un bécher, un brûleur à alcool, des hémostats, un outil de retrait des coupons, des béchers avec de l’eau de dilution stérile et des tubes de dilution pour rincer les coupons.

Éteignez la pompe, retirez le couvercle du canal et utilisez un outil de retrait de coupon stérile et des hémostats pour retirer le coupon, en prenant soin de ne pas perturber le biofilm. Rincez le coupon en immergeant doucement avec un mouvement fluide dans 45 millilitres d’eau de dilution stérile contenue dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres. Inversez immédiatement le mouvement pour retirer le coupon.

Placez le coupon dans un bécher contenant 45 millilitres d’eau de dilution stérile. Gratter la surface du coupon recouverte de biofilm dans une direction descendante pendant environ 15 secondes à l’aide d’une spatule stérile ou d’un grattoir. Rincez la spatule ou le grattoir en le remuant dans le bécher.

Répétez le processus de raclage et de rinçage trois à quatre fois en assurant une couverture complète de la surface du coupon. Rincez le coupon en le maintenant à un angle de 60 degrés sur le bécher stérile et en pipetant un millilitre d’eau de dilution stérile sur la surface du coupon. Répétez l’opération pour un total de cinq rinçages.

Le volume final dans le bécher est maintenant de 50 millilitres. En travaillant dans l’armoire de biosécurité, homogénéiser l’échantillon de biofilm gratté. Fixez une sonde d’homogénéisateur stérile à l’homogénéisateur.

Placez l’embout de la sonde dans le liquide et allumez l’homogénéisateur et montez jusqu’à 20 500 tr / min. Homogénéiser l’échantillon pendant 30 secondes. Baissez le régime et éteignez l’homogénéisateur.

Désinfecter la sonde entre les échantillons de biofilm en homogénéisant dans un blanc de dilution stérile de neuf millilitres à 20 500 tr / min pendant 30 secondes, comme décrit ci-dessus. Homogénéiser un tube de neuf millilitres d’éthanol à 70% pendant 30 secondes et détacher la sonde et la laisser reposer dans le tube d’éthanol pendant une minute. Homogénéiser deux ébauches de dilution supplémentaires.

En outre, une sonde d’homogénéisateur jetable stérile peut être utilisée pour chaque échantillon. Diluer en série l’échantillon homogénéisé, plaquer les dilutions sur R2A en utilisant la méthode de placage appropriée et incuber les plaques pendant 24 heures à 36 degrés Celsius. Comptez les colonies et enregistrez les données.

Cette technique finale de récolte et de désagrégation du biofilm est utile pour le biofilm cultivé dans des tubes poreux comme le tube en silicone utilisé dans le modèle de cathéter. Pour commencer cette procédure, cultivez un biofilm mature d’E.coli 53498 dans un tube de cathéter en silicone. Préparez les matériaux d’échantillonnage: tubes rincés, un tube de centrifugeuse stérile, une boîte de Petri stérile vide, des hémostats en acier inoxydable stérilisés à la flamme, des ciseaux, une minuterie et une règle.

Lorsque la pompe est en pause, utilisez 70 % d’éthanol pour nettoyer l’extérieur du tube. Mesurez à deux centimètres de l’extrémité, en évitant la zone attachée au connecteur, et marquez le tube pour déterminer les emplacements de coupe. Avec des ciseaux stérilisés à la flamme, coupez le tube sur la marque de deux centimètres.

Rincez le segment de tube pour éliminer les cellules planctoniques. Avec des pinces stérilisées à la flamme, immergez doucement le segment du tube dans 20 millilitres d’eau de dilution stérile, puis retirez-le immédiatement. Placez le segment dans 10 millilitres de neutralisant.

Avec des pinces stérilisées à la flamme, maintenez le segment de tube et grattez avec un bâton applicateur en bois stérile jusqu’à ce que toutes les zones intérieures du tube aient été grattées. Rincez de temps en temps le bâton dans les 10 millilitres de neutralisant et replacez le segment dans le tube d’échantillonnage. Le segment des tubes raclés est maintenant la dilution de 10 à zéro ou zéro.

Vortex chaque tube sur le réglage le plus élevé pendant 30 plus ou moins cinq secondes. Placez les tubes dans le porte-tubes suspendu dans le bain du sonicator, de sorte que le niveau d’eau dans le bain soit égal au niveau de liquide dans les tubes. Sonicate à 45 kilohertz, 100% de puissance et fonctionnement normal pendant 30 plus ou moins cinq secondes.

Répétez ce cycle de vortex et de sonication, puis terminez par le vortex final. Diluer en série les échantillons dans de l’eau tamponnée. Plaquer sur gélose de soja tryptique en utilisant la méthode de placage appropriée, puis incuber les tubes à 36 plus ou moins deux degrés Celsius pendant 24 heures.

Compter les colonies en fonction de la méthode de placage utilisée et enregistrer les données pour calculer la moyenne arithmétique. Ces quatre images prises par Danielle Or et Blaine Fritz contribuent toutes à illustrer l’importance de cette procédure de récolte et de désagrégation. Ces quatre coupons ont été colorés avec du violet cristallin pour aider à visualiser la quantité de biofilm de Pseudomonas aeruginosa présente sur les coupons avant et après le vortex et le processus de sonication.

Le coupon A est complètement recouvert de biofilm, tandis que les coupons B, C et D ont tous beaucoup moins de biofilm à leur surface. Les coupons B, C et D ont tous été soumis au processus de vortex et de sonication décrit précédemment. Ces deux images prises par Lindsey Miller au microscope confocal à un grossissement de 12,5X représentent un biofilm de Pseudomonas aeruginosa qui a été traité avec la tache vivante / morte de contre-jour.

L’image de gauche a été soniquée à 45 kilohertz et 10% de puissance, tandis que l’image de droite a été soniquée à 45 kilohertz et 100% de puissance. De toute évidence, le coupon de gauche a beaucoup plus de biofilm restant à sa surface que le coupon de droite. Cette dernière figure montre comment la manipulation de différents paramètres de sonication affecte la quantité de biofilm de Pseudomonas aeruginosa retirée de la surface du coupon.

Tous ces coupons ont été soniqués à 45 kilohertz, 100% de puissance, et en réglage normal pendant 30 plus ou moins cinq secondes. Ces images ont été prises à un grossissement de 12,5X par Lindsey Miller. Les coupons de la première rangée ont été soniqués dans de l’eau de dilution, tandis que les coupons de la deuxième rangée ont été soniqués dans un bouillon neutralisant DE.

Il semble qu’il reste moins de biofilm sur les coupons qui ont été soniqués dans un bouillon de DE qui contient un tensioactif par rapport à l’eau de dilution. Les coupons A, B, E et F ont tous été soniqués dans un volume de 10 millilitres, tandis que les coupons C, D, G et H ont été soniqués dans 40 millilitres de solution. Il y a nettement moins de biofilm sur les coupons qui ont été soniqués dans les plus petits volumes.

Les coupons A, C, E et G ont été soniqués dans le bain avec trois tubes à la fois, tandis que les coupons B, D, F et H ont été soniqués dans un bain avec 12 tubes à la fois. Il semble que les échantillons soniqués avec moins de tubes présentaient une récolte de biofilm supérieure. En fin de compte, minimiser le volume dans les tubes, réduire le nombre de tubes soniqués à la fois et utiliser du bouillon neutralisant DE semblent tous contribuer à améliorer la récolte du biofilm.

Il n’y a pas de méthode parfaite pour récolter et désagréger le biofilm, mais certaines approches sont meilleures pour différentes surfaces et / ou applications. Les techniques présentées dans cette vidéo sont les trois méthodes les plus courantes selon une revue de la littérature. Ces trois techniques peuvent constituer un point de départ pour les chercheurs.

Il est important de prendre le temps de valider la méthode de récolte et de désagrégation choisie. Tous les équipements sont légèrement différents, donc même si la méthode a été normalisée, il est toujours prudent de confirmer le processus pour l’équipement utilisé. La recherche a démontré que des choix inappropriés peuvent conduire à des résultats de test biaisés.

Après avoir visionné cette vidéo, nous espérons que cette information aidera les chercheurs à prendre des décisions plus éclairées sur la méthode à utiliser et fournira des conseils sur l’amélioration de la reproductibilité pour les trois types de surface et les techniques complémentaires de récolte et de désagrégation.