Fluorimétrie à balayage nano-différentiel pour le criblage dans la découverte de plomb à base de fragments

Ce protocole est utile pour les campagnes de découverte de leads à base fragmentée en tant qu’outil supplémentaire pour sélectionner des fragments prometteurs comme candidats à la chaleur. Nano DSO pour le criblage de fragments utilise une quantité limitée d’échantillons de protéines non étiquetées et peut être utilisé régulièrement pour presque toutes les cibles protéiques. Cette méthode peut être utilisée pour filtrer toutes les collections de ligands.

ou pour vérifier les chaleurs des autres méthodes. Sortez une plaque de fragment du congélateur à moins 20 ou moins 80 degrés Celsius et laissez-la décongeler à température ambiante en secouant doucement sur un agitateur de paillasse. Centrifugez la plaque à 500 fois G pendant 30 secondes pour recueillir les gouttes qui collent sur le côté des puits.

Prenez une plaque de cristallisation MRC à 2 puits et pipetez 15 microlitres de la solution de protéines dans chaque sous-puits à l’aide d’une pipette multicanal. Pour vérifier les définitions des fragments et des plaques protéiques sur le Mosquito, allumez le nano distributeur et assurez-vous qu’il n’y a pas d’obstacles autour des composants en mouvement. Ouvrez l’interface utilisateur graphique, cliquez sur l’onglet Configuration et sous Configuration du pont vérifiez si le type de plaque dans laquelle les composés sont fournis et celle dans laquelle la protéine est transférée sont déjà présents dans la liste des plaques disponibles.

Si ce n’est pas le cas, cliquez sur Options, puis sur Plaques et créez une nouvelle définition de plaque en renseignant les valeurs correctes pour le type de propriété. Sous l’onglet Configuration, spécifiez les positions des plaques sous Configuration du pont. À l’aide du menu déroulant, choisissez la plaque inférieure Grainier U pour la position un et la plaque MRC 2-well pour la position deux et enregistrez le protocole.

Placez la plaque de fragment à la position un et la plaque protéique à la position deux du pont. Dans l’onglet protocole, cliquez sur Fichier et choisissez le protocole enregistré à l’étape précédente pour distribuer les fragments. Définissez le volume des fragments à distribuer comme 0,3 microlitre.

Pour une plaque typique où les colonnes un et 12 ne contiennent pas de fragments, définissez l’emplacement de début à la colonne deux et l’emplacement de fin à la colonne 11. Dans certaines plaques, si les colonnes deux ou 11 sont vides, utilisez les colonnes trois et 10 comme valeurs de début et de fin. Cliquez sur Exécuter pour démarrer le programme.

Une fois la distribution terminée, qui prend environ deux minutes, retirez la protéine et les plaques de fragments du robot et scellez-les avec un film d’étanchéité adhésif. Centrifugez brièvement la plaque protéique à 500 fois G pendant 30 secondes pour recueillir toute goutte collant sur les côtés des puits avant de passer à l’étape suivante. Inspectez visuellement les puits de la plaque protéique à la recherche de précipitations qui auraient pu se produire en raison de l’ajout de fragments.

Si des précipitations sont observées dans de nombreux puits, réduisez la concentration des fragments et répétez l’expérience. Allumez l’instrument Prometheus. Sur l’écran tactile, appuyez sur Ouvrir le tiroir pour accéder au module de chargement capillaire de l’instrument.

Retirez la bande magnétique du module de chargement et nettoyez le miroir avec de l’éthanol pour éliminer les particules de poussière. Pour transférer une solution de la plaque de fragments de protéines aux capillaires, placez la plaque protéique et les capillaires à côté de l’instrument pour un accès facile au module de chargement capillaire. Prenez un capillaire en le tenant à une extrémité et touchez la solution dans la plaque protéique avec l’autre extrémité du capillaire pour transférer l’échantillon.

Portez toujours des gants et assurez-vous de ne pas toucher le capillaire au milieu, car les impuretés des gants affecteraient la mesure. Placez le capillaire dans la position désignée du support, en vous assurant qu’il est correctement aligné et centré, répétez ces étapes pour remplir toutes les positions du module de chargement. À la fin, placez la bande magnétique sur le dessus des capillaires pour les maintenir en place et appuyez sur Fermer le tiroir pour démarrer l’expérience Nano-DSF.

Ouvrez l’application Prometheus PR. ThermControl et créez un nouveau projet en cliquant sur Démarrer une nouvelle session. Tout d’abord, faites un balayage de découverte pour détecter la fluorescence des échantillons. Modifiez le signal fluorescent des échantillons en ajustant la puissance d’excitation du laser.

Pour une dénaturation thermique, cliquez sur l’onglet Analyse de fusion, réglez la température de début à 20 degrés Celsius, la température de fin à 95 degrés Celsius et la pente de température à un degré Celsius par minute. Cliquez ensuite sur Démarrer la mesure. La distribution de fréquence du décalage et de la température de fusion pour la protéine externe, cinétique ou fortement exprimée dans le cancer, le domaine répétitif du tétratricopeptide régulateur de la kinase monopolaire 1 et la protéase de type SARS-CoV-2 3c sont montrés ici.

Les valeurs négatives indiquent une réduction de la température de fusion en présence d’un fragment, tandis qu’une valeur positive indique une augmentation de la température de fusion. Pour Nsp5, tous les fragments ont un effet déstabilisateur, tandis que pour Hec1 et Mps1, des coups stabilisateurs et déstabilisateurs sont observés. Il s’agit d’une méthode peu coûteuse et rapide pour filtrer les bibliothèques de fragments.

D’autres méthodes telles que la RMN ou la cristallographie aux rayons X peuvent montrer la liaison exacte des fragments et elles sont également disponibles grâce à la découverte INX. Les résultats avec la protéase du coronavirus ont aidé à proposer de nouveaux composés qui peuvent être développés en médicaments contre covid-19.