Profilage de la modification H3K4me3 dans les usines à l’aide du clivage sous cibles et de la marquage

L’objectif global de l’expérience était d’identifier des fragments d’ADN affiliés à des protéines dans tout le génome, ce qui reflétait l’état de la chromatine. Pour atteindre cet objectif, trois opérations spéciales ont été effectuées. Tout d’abord, les noyaux intacts des cellules végétales ont été isolés.

Deuxièmement, des modifications de la chromatine ont été reconnues par un anticorps spécifique in situ. Troisièmement, l’anticorps attachant une protéine de fusion A-transposase, la transposase Tn5, clivent la chromatine in situ sous l’activation des ions magnésium. Les fragments d’ADN et les sites de liaison de modification de la chromatine ont ensuite été intégrés à des adaptateurs et préparés pour la préparation de l’ADN.

Enrichissement en chaîne par polymérase séquençage amélioré de la génération. La régulation épigénomique au niveau chromatique, y compris les modifications de l’ADN et des histones, les comportements des facteurs de transcription et les ARN non codants avec leurs protéines recrutées, conduit à un contrôle temporel et spatial de l’expression des gènes. La technologie CUT&Tag développée par Henikoff Lab est une méthode d’attache enzymatique pour le profilage épigénomique de la chromatine à une efficacité élevée.

Ici, nous utilisons les feuilles de coton comme matériaux expérimentaux et effectuons le profilage de la chromatine en utilisant l’anticorps de la triméthylation Histone H3 Lysine-4 à titre d’exemple. Nous fournissons un protocole affiné avec vidéo pour les performances CUT&Tag dans les usines. Pour chaque préparation d’échantillon à l’aide de CUT&Tag, un gramme de tissu de feuilles de coton a été collecté.

La feuille a été broyée en une fine poudre avec de l’azote liquide et transférée dans un tube de faucon de 50 mL contenant 25 mL de tampon d’isolement nucléaire réfrigéré A.La solution tampon a été mélangée doucement et le tube a été incubé sur de la glace pendant cinq minutes avec une agitation douce pour disperser le matériau uniformément. Il a ensuite été filé à une force centrifuge relative de 500 ou rcf, à 4 degrés Celsius, pendant cinq minutes, pour former la pastille cellulaire. Le surnageant a été décanté et la pastille a été remise en suspension avec 20 mL de tampon d’isolement nucléaire réfrigéré B, complété par 0,5 % de triton.

Le tube a été inversé doucement pour remettre complètement en suspension la pastille. Le lysat cellulaire résultant a ensuite été filtré avec une combinaison de deux tamis, un tamis de 500 mailles a été utilisé sur le dessus pour éliminer les plus gros débris tissulaires. Et un tamis de 1000 mailles a été utilisé sur le fond pour collecter les noyaux.

Le choix du maillage approprié des tamis dépend de la taille des noyaux des plantes. Du papier filtre stérile a été utilisé à l’arrière du tamis pour absorber une partie du lysat et des débris de petites cellules. Le lysat contenant les noyaux a été transféré dans un tube de centrifugeuse frais de 1,5 millilitre et filé à 300 rcf pendant quatre minutes, à 4 degrés Celsius Celsius pour recueillir les noyaux.

Après la centrifugation, une pointe de pipette a été utilisée pour enlever autant de surnageant que possible. Une quantité de 800 microlitres, un tampon de lavage nucléaire a été ajouté. Et le tube a été inversé doucement pour remettre en suspension les noyaux.

Le tube a été tourné à nouveau à 300 rcf, pendant quatre minutes à 4 degrés Celsius. Après un total de trois lavages, les noyaux résultants ont été combinés dans un tube de centrifugeuse frais de 1,5 millilitre et filés à 300 rcf, pendant quatre minutes à 4 degrés Celsius. Une pointe de pipette a été utilisée pour enlever autant que possible le tampon restant.

L’étape suivante a été l’incubation de l’anticorps. Une aliquote de 50 microlitres de noyaux a été remise en suspension dans 1 millilitre de tampon d’anticorps complété par EDTA, BSA, cocktail d’inhibiteurs de protéase dans la digitonine. Une aliquote de 150 microlitres de la suspension de noyaux a été placée dans un tube frais de 1,5 millilitre pour une réaction, deux microlitres d’anticorps ont été ajoutés à chaque tube.

Dans ce test, deux répliques biologiques pour les groupes témoins anti-histone-H3-Lysine-4-Triméthylation et immunoglobuline G négatif ont été mis en place après l’ajout d’anticorps. La solution a été mélangée doucement et les tubes ont été laissés sur un agitateur horizontal pour l’hybridation pendant la nuit à quatre degrés Celsius à 12 tr / min. Le lendemain matin, les tubes ont été retirés et les noyaux ont été lavés à l’aide de 800 microlitres de tampon de lavage par immuno précipitation.

Le tube a été inversé doucement pour le mélange et il a été laissé sur un agitateur horizontal pendant cinq minutes à température ambiante à 12 tr / min. Après le lavage, le tube a été tourné à 300 rcf pendant quatre minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, le surnageant a été retiré à l’aide d’une pointe de pipette.

Cela a été répété pour un total de trois lavages. Après le troisième lavage, le tube a été filé à 300 rcf pendant deux minutes à quatre degrés Celsius, et une pointe de pipette a été utilisée pour retirer le tampon restant autant que possible. Préparer le mélange de transposase Tn5 pour l’incubation.

Un microlitre de transposase a été ajouté à chaque 150 microlitres du tampon d’incubation de la transposase. Nous recommandons de préparer d’abord le mélange de solution de transposase en fonction du nombre de réactions. Et puis en ajoutant une aliquote de 150 microlitres à chaque tube.

La solution a été mélangée doucement et laissée sur un agitateur horizontal à température ambiante à 12 tr/min pendant deux heures. Les tubes ont été mélangés doucement toutes les 10 à 15 minutes. Après incubation, les noyaux ont été lavés trois fois à l’aide de 800 microlitres de tampon de lavage par immuno précipitation à température ambiante pour éliminer la transposase Tn5 non liée.

Après le troisième lavage, le tube a été filé à 300 rcf pendant deux minutes à quatre degrés Celsius, et une pointe de pipette a été utilisée pour enlever le tampon restant. Pour l’étape de marquage, 300 microlitres de tampon de marquage ont été ajoutés au tube de réaction. La solution a été bien mélangée et incubée à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Après incubation, 10 microlitres de 0,5 mole par litre d’EDTA à 30 microlitres de FDS à 10% ont été ajoutés pour déterminer la réaction. Ensuite, 300 microlitres de tampon d’extraction d’ADN ont été ajoutés. Une extraction irrégulière de l’ADN a été effectuée.

Les fragments d’ADN ont été dissous dans 25 microlitres d’eau stérile. 24 microlitres ont été utilisés pour l’amplification pcr dans la construction de bibliothèques NGS. Cette figure montre la coloration des noyaux intacts avec DAPI dans l’imagerie, sous un microscope obtenir une quantité adéquate de noyaux intacts et relativement propres est l’étape critique pour CUT&Tag.

Après la PCR, deux microlitres ont été transférés et la taille de l’ADN a été vérifiée sur du gel d’agarose à 1,5%. Cette figure montre que comparer avec le contrôle négatif du gène de l’immunoglobuline. La majeure partie des fragments d’ADN de l’échantillon de triméthylation Histone H3 Lysine 4 devrait varier de 280 à 500 paires de bases.

Les fragments d’ADN peuvent être purifiés puis profilés par séquençage à haut débit. Cette figure montre le séquençage de génération des résultats pour l’anticorps anti-histone H3 Lysine 4 Trimethylation compare avec les groupes témoins immunoglobuline G négatifs. Cette technologie génère les bibliothèques d’ADN à haute résolution et en arrière-plan exceptionnellement faible en utilisant un petit nombre de cellules avec une procédure simplifiée par rapport à ChIP-seq.

CUT&Tag est une nouvelle méthode toujours en cours.