Name: Profilage de la modification H3K4me3 dans les usines à l’aide du clivage sous cibles et de la marquage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Découvrez le protocole CUT&Tag affiné pour le profilage épigénomique des modifications d'histones H3K4me3 dans les plantes. Cette méthode efficace isole les noyaux intacts et permet une analyse précise de la chromatine.

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Ce travail a été soutenu financièrement en partie par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430), et des fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales, Hainan Yazhou Bay Seed Lab (JBGS, B21HJ0403), Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (320LH002) et le projet JCIC-MCP.

1. Préparer la transposase et les solutions mères (Jour 1)
REMARQUE: Dans cette partie, les adaptateurs oligonucléotidiques sont complexés avec la transposase Tn5 pour rendre la transposase active.
<ol><li>Diluez les apprêts (apprêt A, apprêt B et apprêt C) jusqu’à une concentration de 100 μM à l’aide du tampon de recuit (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) (voir le tableau 1 pour les informations de séquence des apprêts et le tableau 2 pour les recettes de solutions de travail). Conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.</li>
	<li>Mettre en place les deux réactions suivantes dans les tubes PCR : Réaction 1 (adaptateur AB), 10 μL d’amorce A de 100 μM, 10 μL d’amorce B de 100 μM ; Réaction 2 (adaptateur AC), 10 μL de 100 μM amorce A, 10 μL 100 μM amorce C.</li>
	<li>Recuit les adaptateurs dans la machine PCR à l’aide du programme suivant: couvercle chauffant (102 °C), 75 °C pendant 15 min, 60 °C pendant 10 min, 50 °C pendant 10 min, 40 °C pendant 10 min, 25 °C pendant 30 min. REMARQUE: Les adaptateurs sont des molécules d’ADN partiellement double brin (concentration = 50 pmol / μL).</li>
	<li>Mettre en place la réaction suivante dans un tube centrifuge de 1,5 mL : 10 μL de transposase pA-Tn5 (500 ng/μL ou 7,5 pmol/μL), 0,75 μL d’adaptateur AB (50 pmol/μL), 0,75 μL d’adaptateur AC (50 pmol/μL), 7 μL de tampon de couplage. Pipette 20x doucement pour bien mélanger et incuber à 30 °C au bain-marie pendant 1 h. Concentration finale de transposase = 4 pmol/μL. Conserver à -20 °C jusqu’à utilisation. REMARQUE: Rapport molaire de l’adaptateur AB: adaptateur AC: transposase = 0,5: 0,5: 1.</li>
	<li>Préparer les solutions mères selon les recettes fournies dans le tableau 2 et autoclaver ou filtrer les solutions mères pour les stériliser.</li>
	<li>Autoclavez et stérilisez des ciseaux, du papier filtre, un tamis en acier inoxydable, un mortier, des pilons, etc.</li>
</ol>2. Isolement des noyaux (Jour 2)
<ol><li>Pré-refroidir la centrifugeuse à 4 °C. Pour chaque 1 g de matière première (feuilles de coton), préparer 25 mL de tampon d’isolement nucléaire A (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 20 mL de tampon d’isolement nucléaire B (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA), 50 mL de tampon de lavage nucléaire (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM de spermidine, cocktail inhibiteur de protéase 0,1 %), 1 mL de tampon anticorps (50 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,5 mM de spermidine, 1 mg/mL BSA, cocktail d’inhibiteurs de protéase 0,1 %, 0,05 % p/v digitonine). Laissez les tubes reposer sur la glace jusqu’à utilisation.</li>
	<li>Broyer les feuilles fraîches (~1 g) dans de l’azote liquide en une poudre fine et les transférer dans un tube de 50 mL contenant 25 mL de tampon d’isolement nucléaire réfrigéré A.</li>
	<li>Mélanger doucement la solution tampon et incuber le tube sur de la glace pendant 5 min en agitant doucement pour disperser le matériau uniformément.</li>
	<li>Centrifuger pendant 5 min à 500 rcf à 4 °C pour former la pastille de cellule.</li>
	<li>Décanter le surnageant et remettre en suspension la pastille avec 20 mL de tampon d’isolement nucléaire réfrigéré B complété par 0,5% de Triton X-100. Inverser doucement le tube pour remettre complètement la pastille en suspension. REMARQUE: Le tampon d’isolement nucléaire B de 20 mL est applicable pour 1 g de matière première, et ce volume peut être mis à l’échelle en conséquence.<ol>
<li>Effectuer un essai pilote pour tester l’effet de la concentration en série de Triton X-100 (p. ex., tampon d’isolement nucléaire B de 2 mL, chacun avec 0,1 %, 0,25 %, 0,5 % et 1 % de Triton X-100 pour 100 mg de tissus broyés). La concentration appropriée de Triton X-100 est indiquée par une accumulation de noyaux blancs/gris au fond et un surnageant vert foncé après lyse et centrifugation à basse vitesse (< 500 rcf pendant 4 min).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filtrer le lysat cellulaire résultant avec une combinaison de deux tamis: un tamis de 500 mailles sur le dessus pour éliminer les plus gros débris tissulaires et un tamis de 1000 mailles sur le fond pour recueillir les noyaux. REMARQUE: Choisissez un maillage approprié pour les tamis en fonction de la taille des noyaux des plantes.</li>
	<li>Utilisez du papier filtre stérile à l’arrière du tamis pour absorber les débris de petites cellules dans le lysat.</li>
	<li>Transférer les noyaux restants contenant du lysat sur la face supérieure du tamis à 1000 mailles dans quatre tubes centrifuges frais de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifuger pendant 4 min à 300 rcf à 4 °C pour recueillir les noyaux.</li>
	<li>Retirez autant de surnageant que possible à l’aide d’une pointe de pipette et lavez la pastille avec un tampon de lavage nucléaire.</li>
	<li>Ajouter 800 μL du tampon de lavage nucléaire et inverser doucement les tubes pour remettre en suspension la pastille. Faire tourner à nouveau le tube pendant 4 min à 300 rcf à 4 °C.</li>
	<li>Effectuez un total de 3 lavages.</li>
	<li>(Facultatif) Imagez les noyaux sous un microscope pour la coloration DAPI.<ol>
<li>Transférer 100 μL de suspension de noyaux dans le tampon de lavage nucléaire à partir de l’étape 2.11. à un nouveau tube de 1,5 mL. Ajouter 900 μL de tampon de lavage nucléaire et 2 μL de solution mère de DAPI (1 mg/mL) pour obtenir une concentration de travail finale de 2 μg/mL pour le DAPI. Incuber le tube dans l’obscurité pendant 30 min à température ambiante.</li>
		<li>Après coloration, centrifuger pendant 4 min à 300 rcf à 4 °C pour recueillir les noyaux.</li>
		<li>Retirez autant de surnageant que possible à l’aide d’une pointe de pipette. Lavez 3 fois avec 800 μL du tampon de lavage nucléaire.</li>
		<li>Retirez autant de surnageant que possible et remettez en suspension les noyaux avec 100 μL de tampon de lavage nucléaire.</li>
		<li>Imagez les noyaux sous un microscope à fluorescence à l’aide du canal DAPI.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Combinez les noyaux de deux tubes (~50 μL de noyaux en volume dans chaque tube de 1,5 mL). Centrifuger pendant 4 min à 300 rcf à 4 °C. Retirez autant que possible le tampon restant à l’aide d’une pointe de pipette.</li>
</ol>3. Incubation d’anticorps
<ol><li>Remettre en suspension chaque 50 μL de noyaux dans un tube de 1,5 mL avec 1 mL de tampon d’anticorps.</li>
	<li>Mettre en place les réactions suivantes dans des tubes de 1,5 mL : deux répliques biologiques de groupes témoins d’IgG avec 150 μL de noyaux (~ 1 μg de chromatine) et 2 μL d’IgG (1 mg/mL) dans chaque tube, deux répliques biologiques de groupes de dosage H3K4me3 avec 150 μL de noyaux et 2 μL d’anticorps anti-H3K4me3 (1 mg/mL) dans chaque tube.</li>
	<li>Mélanger doucement la solution et laisser les tubes sur un agitateur horizontal pour l’hybridation pendant la nuit à 4 °C et 12 tr/min.</li>
	<li>Pré-refroidir la centrifugeuse à 4 °C. Préparer 50 mL frais de tampon de lavage d’immunoprécipitation (IP) (10 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5 mM de spermidine, cocktail d’inhibiteurs de protéase 0,1%, 0,05% p/v digitonine) dans un tube centrifuge de 50 mL. Laissez le tube reposer sur la glace.</li>
	<li>Centrifuger les tubes pendant 4 min à 300 rcf à 4 °C. Retirez le tampon d’anticorps de chaque tube.</li>
	<li>Ajouter 800 μL de tampon de lavage IP à chaque tube et mélanger doucement. Laissez les tubes sur un agitateur horizontal pendant 5 min à température ambiante et à 12 tr/min.</li>
	<li>Après lavage, centrifuger les tubes pendant 4 min à 300 rcf à 4 °C. Retirez le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette. REMARQUE: Pour éviter toute perturbation de la pastille de noyaux, laissez ~ 50-80 μL du tampon avec les noyaux.</li>
	<li>Répétez les étapes 3.6.-3.7. deux fois de plus.</li>
	<li>Après le troisième lavage, centrifuger pendant 2 min à 300 rcf à 4 °C. Retirez le tampon restant autant que possible.</li>
</ol>4. Incubation de la transposase
<ol><li>Préparer 1 mL de tampon d’incubation de transposase (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM de spermidine, cocktail d’inhibiteurs de protéase 0,1 %, 0,05 % p/v digitonine) en mélangeant 1 mL du tampon de lavage IP avec 30 μL de 5 M NaCl.</li>
	<li>Pour préparer le mélange de transposase Tn5 pour l’incubation, ajouter 1 μL de transposase à chaque 150 μL du tampon d’incubation de la transposase. REMARQUE: Préparer d’abord le mélange de solution de transposase en fonction du nombre de réactions, puis ajouter une aliquote de 150 μL à chaque tube.</li>
	<li>Remettre en suspension les noyaux avec 150 μL de solution de transposase.</li>
	<li>Laisser les tubes sur un agitateur horizontal à 12 tr/min pendant 2-3 h à température ambiante et mélanger toutes les 10-15 min.</li>
	<li>Après incubation de la transposase, centrifuger les tubes pendant 4 min à 300 rcf à 4 °C. Retirez le tampon d’incubation de la transposase dans chaque tube.</li>
	<li>Lavez les tubes avec un tampon de lavage IP. Pour ce faire, ajoutez 800 μL de tampon de lavage IP à chaque tube, mélangez doucement et laissez les tubes sur un agitateur horizontal à 12 tr/min pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Centrifuger pendant 4 min à 300 rcf à 4 °C. Retirez le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette.</li>
	<li>Répétez les étapes 4.6.-4.7. deux fois de plus.</li>
	<li>Après le troisième lavage, centrifuger pendant 2 min à 300 rcf à 4 °C. Retirez le tampon restant autant que possible.</li>
</ol>5. Balisage
<ol><li>Préparer fraîchement 2 mL du tampon de marquage (10 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,5 mM de spermidine, cocktail inhibiteur de protéase 0,1 %, 10 mM MgCl2, 0,05 % p/v digitonine) en mélangeant 2 mL de tampon de lavage IP avec 60 μL de 5 M NaCl et 20 μL de 1 M MgCl2.</li>
	<li>Resuspendez les noyaux avec 300 μL de tampon de marquage.</li>
	<li>Mélanger la solution et incuber dans un bain-marie à 37 °C pendant 1 h pour le marquage.</li>
	<li>Arrêter le marquage avec 10 μL de 0,5 M d’EDTA (concentration finale ~15 mM) et 30 μL de FDS à 10 % (concentration finale 1 %).</li>
</ol>6. Extraction de l’ADN et construction de la bibliothèque NGS
<ol><li>Ajouter 300 μL de tampon d’extraction d’ADN CTAB comme décrit7. Incuber les tubes dans un bain-marie à 65 °C pendant 30 min. Inverser pour mélanger toutes les ~10 min.</li>
	<li>Ajouter 600 μL de phénol : chloroforme : alcool isoamylique (25:24:1) dans chaque tube. Mélanger.</li>
	<li>Pré-centrifuger les tubes de gel à verrouillage de phase pendant 2 min à 13 000 rcf à 4 °C. Transférer la solution ci-dessus dans des tubes de gel à verrouillage de phase.</li>
	<li>Centrifuger pendant 10 min à 13 000 rcf à 4 °C.</li>
	<li>Transférer le surnageant (~600 μL) dans un nouveau tube de 1,5 mL.</li>
	<li>Ajouter 600 μL de chloroforme à chaque tube. Mélanger.</li>
	<li>Centrifuger pendant 10 min à 13 000 rcf à 4 °C.</li>
	<li>Transférer le surnageant (~600 μL) dans un nouveau tube de 1,5 ml.</li>
	<li>Ajouter 12 μL d’éthanol à 100 % et 2 μL de coprécipitant GlycoBlue. Bien mélanger et conserver à -20 °C pendant 1 h.</li>
	<li>Centrifuger pendant 10 min à 13 000 rcf à 4 °C.</li>
	<li>Décantez le surnageant. Laver la pastille d’ADN à l’aide d’éthanol à 75 % (v/v) et centrifuger pendant 5 min à 13 000 rcf à 4 °C.</li>
	<li>Décantez le surnageant. Séchez la pastille d’ADN à l’air libre et remettez en suspension l’ADN dans 25 μL de ddH2O.</li>
	<li>Configurez la réaction PCR comme suit. Pour un total de 50 μL de réaction, ajoutez 24 μL d’ADN, 11 μL de ddH2O, 10 μL de tampon TAE 5x, 2 μL d’amorce P5 (10 μM), 2 μL d’amorce P7 (10 μM) et 1 μL d’enzyme TruePrep Amplify. Programme PCR : 72 °C pendant 3 min, 98 °C pendant 30 s ; puis 14 cycles de 98 °C pendant 30 s, 60 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s, suivis de 72 °C pendant 5 min. REMARQUE: Les premiers 72 °C pendant 3 min pour l’extension ne peuvent pas être ignorés. La suramplification de la bibliothèque conduira à un niveau élevé de doublons PCR dans le NGS. Commencez à partir de 12-14 cycles de PCR dans la réaction pcrifique pour H3K4me3 en utilisant ~ 1 μg de chromatine dans chaque réaction.</li>
	<li>Chargez 2 μL des produits PCR sur un gel d’agarose à 1,5% pour l’électrophorèse.</li>
	<li>Purifier les produits pcr à l’aide de billes magnétiques de purification de l’ADN commerciales.</li>
	<li>Quantifiez la bibliothèque avec un fluoromètre et une électrophorèse sur gel d’agarose. REMARQUE: La concentration effective de la bibliothèque doit être >2 nM par qPCR pour assurer une bonne qualité.</li>
	<li>Effectuez le séquençage de nouvelle génération (NGS) et l’analyse des données.</li>
</ol>

<ol><li>Abascal, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+ENCODE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Perspectives on ENCODE.</a> Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).</li>
<li>Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+chromatin+profiling+of+H3K4me3+modification+in+cotton+using+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag.</a> Plant Methods. 16, 120(2020).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+low-cost+chromatin+profiling+with+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag.</a> Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).</li>
<li>Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+CUT%26Tag+profiles+histone+modifications+and+transcription+factors+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues.</a> Nature Biotechnology. , (2021).</li>
<li>Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+extraction+of+cotton+%28Gossypium+spp.%29+genomic+DNA+suitable+for+RFLP+or+PCR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Reporter%22%5BJournal%5D)">A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis.</a> Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).</li>
<li>Haring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> Plant Methods. 3 (1), 11(2007).</li>
<li>Ouyang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+low-input+profiling+of+histone+marks+in+plants+using+nucleus+CUT%26Tag%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 634679(2021).</li>
<li>Swift, J., Coruzzi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+matter+of+time+-+How+transient+transcription+factor+interactions+create+dynamic+gene+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Gene+Regulatory+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+a+method+for+assaying+chromatin+accessibility+genome-wide%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).</li>
</ol>

Tous les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts avec une société négociant l’un des produits mentionnés ci-dessus.

Ici, nous avons décrit CUT&Tag, une technologie permettant de générer des bibliothèques d’ADN à haute résolution et en arrière-plan exceptionnellement faible en utilisant un petit nombre de cellules avec une procédure simplifiée par rapport à l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Notre succès avec le profilage H3K4me3 dans les feuilles de coton suggère que CUT&Tag, qui a d’abord été conçu pour les cellules animales, peut également être utilisé pour les cellules végétales. Le système tampon Tris couramment utilis...

Les sites d’ADN de liaison au facteur de transcription et la chromatine ouverte associée aux marques de modification des histones jouent un rôle fonctionnel essentiel dans la régulation de l’expression des gènes et constituent les principaux axes de recherche épigénétique1. Classiquement, le test d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) couplé au séquençage profond (ChIP-seq) a été utilisé pour l’identification à l’échelle du génome de la modification spécifique de l’histone de la chromatine ou de cibles d’ADN avec des protéines spécifiques, et est largement adopté dans le domaine de l’épigénétique2. La technologie de clivage sous cibles et de marquage (CUT&Tag) a été développée à l’origine par le laboratoire Henikoff pour capturer les fragments d’ADN affiliés aux protéines dans tout le génome5. Par rapport au ChIP, CUT&Tag peut générer des bibliothèques d’ADN à haute résolution et avec un arrière-plan exceptionnellement faible en utilisant un petit nombre de cellules avec une procédure simplifiée3. À ce jour, des méthodes d’analyse des régions de chromatine avec des modifications spécifiques des histones à l’aide de CUT&Tag ont été établies dans des cellules animales4,5. Plus précisément, le CUT&Tag unicellulaire (scCUT&Tag) a également été développé avec succès pour les tissus et cellules humains6. Cependant, en raison de la complexité de la paroi cellulaire et des métabolites secondaires, CUT&Tag est toujours techniquement difficile pour les tissus végétaux.
Auparavant, nous avions signalé un protocole CUT&Tag utilisant des noyaux intacts isolés à partir de feuilles de coton allotétraploïdes4. Pour démontrer l’efficacité de l’isolement des noyaux et de la capture de l’ADN à l’aide de tissus végétaux, la procédure de profilage est présentée ici. Les principales étapes comprennent l’isolement des noyaux intacts, l’incubation in situ avec l’anticorps pour la modification de la chromatine, l’incubation de la transposase, l’intégration de l’adaptateur et la préparation de la bibliothèque d’ADN. Le dépannage se concentre sur la préparation de la bibliothèque CUT&Tag pour l’isolation des noyaux de la plante et le contrôle qualité.
Dans cette étude, nous présentons une stratégie CUT&Tag affinée pour les plantes. Non seulement nous fournissons un protocole étape par étape pour le profilage H3K4me3 dans les feuilles de coton, mais nous fournissons également une méthodologie optimisée pour l’isolement des noyaux végétaux, y compris la stratégie de sélection de la concentration de détergent pour une lyse cellulaire appropriée et la stratégie de filtrage des noyaux. Des étapes détaillées avec des commentaires critiques sont également incluses dans ce protocole mis à jour.

<table><tbody><tr><td>Anticorps <fort></fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-H3K4me3</td><td>Millipore</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>IgG de lapin normal</td><td>Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td><fort>Produits chimiques</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td></td><td></td><td>Préparer 10 mg/ml de solution mère de BSA. Conserver à -20&deg ; C</td></tr><tr><td>digitonine (~50 % (TLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td>Préparez une solution mère de digitonine à 5 % (200 mg de digitonine [~50 % de pureté] pour 2 mL de DMSO). Remarque : Stérilisez à l’aide d’un filtre de 0,22 micron. Conserver à -20&deg ; C</td></tr><tr><td>diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>chloroforme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>éthylènediamineacide tétraacétique (EDTA)</td><td></td><td></td><td>Produire 0,5 M EDTA (pH = 8,5) solution mère. Remarque : Pour fabriquer 100 ml d’EDTA 0,5-M (pH = 8,5), il faut environ 2 g de pastilles d’hydroxyde de sodium (NaOH) pour ajuster le pH de l’éthanol</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coprécipitant GlycoBlue (15 mg/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>chlorure de magnésium (MgCl2)</td><td></td><td></td><td>Make 1 M MgCl2 cocktail</td></tr><tr><td>d’inhibiteurs de protéase</td><td>Calbiochem</td><td>539133-1SET</td><td></td></tr><tr><td>chlorure de potassium (KCl)</td><td></td><td></td><td>Fabriquer 1 M de KCl solution mère</td></tr><tr><td>phénol :chloroforme :alcool isoamylique (25:24:1,v :v :v)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>chlorure de sodium (NaCl)</td><td></td><td></td><td>Faire 5 M NaCl solution mère</td></tr><tr><td>spermidine</td><td></td><td></td><td>Fabriquer 2 M de spermidine solution mère, conserver à -20&deg ;C.</td></tr><tr><td>dodécylsulfate de sodium (SDS)Préparez</td><td></td><td></td> <td>une solution mère SDS à 10 %. Remarque : Ne pas autoclaver ; stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 micron</td></tr><tr>Base<td>Tris</td><td></td><td></td><td>Préparer 1 M de solution mère Tris (pH = 8,0)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>Préparer 20 % de solution mère Triton X-100</td></tr> <tr><td><forte>enzyme</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase pour CUT& Tag</td><td>Vazyme</td><td>S602/S603</td><td>Vérifiez l’affinité des anticorps de la protéine A ou de la protéine G qui est fusionnée avec le Tn5. D’une manière générale, les protéines A et G ont une large affinité pour les anticorps. Cependant, la protéine A a une affinité relativement plus élevée pour les anticorps de lapin et la protéine G a une affinité relativement plus élevée pour les anticorps de souris. Sélectionnez les produits de transposase appropriés qui correspondent à votre anticorps.</td></tr><tr><td>TruePrep Amplify Enzyme</td><td>Vazyme</td><td>TD601</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>PCR</td><td>Machine Applied Biosystems</td><td>ABI9700</td><td></td></tr><tr><td>Vibrateur orbital</td><td>MIULAB</td><td>HS-25</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One&nbsp ; spectrophotomètre</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr></tbody></table>

profilage de la modification h3k4me3 dans les usines à l’aide du clivage sous cibles et de la marquage

Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

La régulation épigénomique au niveau chromatique, y compris les modifications de l’ADN et des histones, les comportements des facteurs de transcription et les ARN non codants avec leurs protéines recrutées, conduisent à un contrôle temporel et spatial de l’expression des gènes. Le clivage sous cibles et marquage (CUT&Tag) est une méthode d’attachement enzymatique dans laquelle la protéine spécifique de chromatine est d’abord reconnue par son anticorps spécifique, puis l’anticorps attache une protéine de fusion A-transposase (pA-Tn5), qui clive la chromatine ciblée in situ par l’activation d’ions magnésium. Ici, nous fournissons notre protocole CUT&Tag précédemment publié en utilisant des noyaux intacts isolés à partir de feuilles de coton allortetraploïdes avec modification. Ce protocole étape par étape peut être utilisé pour la recherche épigénomique chez les plantes. En outre, des modifications substantielles pour l’isolement des noyaux végétaux sont accompagnées de commentaires critiques.

La figure 1 illustre le flux de travail CUT&amp;Tag. La figure 2 montre la coloration DAPI des noyaux intacts. L’objectif de l’étape « isolement des noyaux » était d’obtenir les noyaux intacts en quantité suffisante pour la réaction CUT&amp;Tag ultérieure. La figure 3 montre l’électrophorèse sur gel d’agarose des produits de PCR. Le contrôle négatif IgG est requis en parallèle lors de la mise en place de l’expérience. Par rapport au...

Le clivage sous les cibles et le marquage (CUT&Tag) est une stratégie efficace de profilage épigénomique de la chromatine. Ce protocole présente une stratégie CUT&Tag affinée pour le profilage des modifications des histones chez les plantes.

Profilage de la modification H3K4me3 dans les usines à l’aide du clivage sous cibles et de la marquage

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...

L’objectif global de l’expérience était d’identifier des fragments d’ADN affiliés à des protéines dans tout le génome, ce qui reflétait l’état de la chromatine. Pour atteindre cet objectif, trois opérations spéciales ont été effectuées. Tout d’abord, les noyaux intacts des cellules végétales ont été isolés.Deuxièmement, des modifications de la chromatine ont été reconnues par un anticorps spécifique in situ. Troisièmement, l’anticorps attachant une protéine de fusion A-transposase, la transposase Tn5, clivent la chromatine in situ sous l’activation des ions magnésium. Les fragments d’ADN et les sites de liaison de modification de la chromatine ont ensuite été intégrés à des adaptateurs et préparés pour la préparation de l’ADN.Enrichissement en chaîne par polymérase séquençage amélioré de la génération. La régulation épigénomique au niveau chromatique, y compris les modifications de l’ADN et des histones, les comportements des facteurs de transcription et les ARN non codants avec leurs protéines recrutées, conduit à un contrôle temporel et spatial de l’expression des gènes. La technologie CUT&Tag développée par Henikoff Lab est une méthode d’attache enzymatique pour le profilage épigénomique de la chromatine à une efficacité élevée.Ici, nous utilisons les feuilles de coton comme matériaux expérimentaux et effectuons le profilage de la chromatine en utilisant l’anticorps de la triméthylation Histone H3 Lysine-4 à titre d’exemple. Nous fournissons un protocole affiné avec vidéo pour les performances CUT&Tag dans les usines. Pour chaque préparation d’échantillon à l’aide de CUT&Tag, un gramme de tissu de feuilles de coton a été collecté.La feuille a été broyée en une fine poudre avec de l’azote liquide et transférée dans un tube de faucon de 50 mL contenant 25 mL de tampon d’isolement nucléaire réfrigéré A.La solution tampon a été mélangée doucement et le tube a été incubé sur de la glace pendant cinq minutes avec une agitation douce pour disperser le matériau uniformément. Il a ensuite été filé à une force centrifuge relative de 500 ou rcf, à 4 degrés Celsius, pendant cinq minutes, pour former la pastille cellulaire. Le surnageant a été décanté et la pastille a été remise en suspension avec 20 mL de tampon d’isolement nucléaire réfrigéré B, complété par 0,5 % de triton.Le tube a été inversé doucement pour remettre complètement en suspension la pastille. Le lysat cellulaire résultant a ensuite été filtré avec une combinaison de deux tamis, un tamis de 500 mailles a été utilisé sur le dessus pour éliminer les plus gros débris tissulaires. Et un tamis de 1000 mailles a été utilisé sur le fond pour collecter les noyaux.Le choix du maillage approprié des tamis dépend de la taille des noyaux des plantes. Du papier filtre stérile a été utilisé à l’arrière du tamis pour absorber une partie du lysat et des débris de petites cellules. Le lysat contenant les noyaux a été transféré dans un tube de centrifugeuse frais de 1,5 millilitre et filé à 300 rcf pendant quatre minutes, à 4 degrés Celsius Celsius pour recueillir les noyaux.Après la centrifugation, une pointe de pipette a été utilisée pour enlever autant de surnageant que possible. Une quantité de 800 microlitres, un tampon de lavage nucléaire a été ajouté. Et le tube a été inversé doucement pour remettre en suspension les noyaux.Le tube a été tourné à nouveau à 300 rcf, pendant quatre minutes à 4 degrés Celsius. Après un total de trois lavages, les noyaux résultants ont été combinés dans un tube de centrifugeuse frais de 1,5 millilitre et filés à 300 rcf, pendant quatre minutes à 4 degrés Celsius. Une pointe de pipette a été utilisée pour enlever autant que possible le tampon restant.L’étape suivante a été l’incubation de l’anticorps. Une aliquote de 50 microlitres de noyaux a été remise en suspension dans 1 millilitre de tampon d’anticorps complété par EDTA, BSA, cocktail d’inhibiteurs de protéase dans la digitonine. Une aliquote de 150 microlitres de la suspension de noyaux a été placée dans un tube frais de 1,5 millilitre pour une réaction, deux microlitres d’anticorps ont été ajoutés à chaque tube.Dans ce test, deux répliques biologiques pour les groupes témoins anti-histone-H3-Lysine-4-Triméthylation et immunoglobuline G négatif ont été mis en place après l’ajout d’anticorps. La solution a été mélangée doucement et les tubes ont été laissés sur un agitateur horizontal pour l’hybridation pendant la nuit à quatre degrés Celsius à 12 tr / min. Le lendemain matin, les tubes ont été retirés et les noyaux ont été lavés à l’aide de 800 microlitres de tampon de lavage par immuno précipitation.Le tube a été inversé doucement pour le mélange et il a été laissé sur un agitateur horizontal pendant cinq minutes à température ambiante à 12 tr / min. Après le lavage, le tube a été tourné à 300 rcf pendant quatre minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, le surnageant a été retiré à l’aide d’une pointe de pipette.Cela a été répété pour un total de trois lavages. Après le troisième lavage, le tube a été filé à 300 rcf pendant deux minutes à quatre degrés Celsius, et une pointe de pipette a été utilisée pour retirer le tampon restant autant que possible. Préparer le mélange de transposase Tn5 pour l’incubation.Un microlitre de transposase a été ajouté à chaque 150 microlitres du tampon d’incubation de la transposase. Nous recommandons de préparer d’abord le mélange de solution de transposase en fonction du nombre de réactions. Et puis en ajoutant une aliquote de 150 microlitres à chaque tube.La solution a été mélangée doucement et laissée sur un agitateur horizontal à température ambiante à 12 tr/min pendant deux heures. Les tubes ont été mélangés doucement toutes les 10 à 15 minutes. Après incubation, les noyaux ont été lavés trois fois à l’aide de 800 microlitres de tampon de lavage par immuno précipitation à température ambiante pour éliminer la transposase Tn5 non liée.Après le troisième lavage, le tube a été filé à 300 rcf pendant deux minutes à quatre degrés Celsius, et une pointe de pipette a été utilisée pour enlever le tampon restant. Pour l’étape de marquage, 300 microlitres de tampon de marquage ont été ajoutés au tube de réaction. La solution a été bien mélangée et incubée à 37 degrés Celsius pendant une heure.Après incubation, 10 microlitres de 0,5 mole par litre d’EDTA à 30 microlitres de FDS à 10% ont été ajoutés pour déterminer la réaction. Ensuite, 300 microlitres de tampon d’extraction d’ADN ont été ajoutés. Une extraction irrégulière de l’ADN a été effectuée.Les fragments d’ADN ont été dissous dans 25 microlitres d’eau stérile. 24 microlitres ont été utilisés pour l’amplification pcr dans la construction de bibliothèques NGS. Cette figure montre la coloration des noyaux intacts avec DAPI dans l’imagerie, sous un microscope obtenir une quantité adéquate de noyaux intacts et relativement propres est l’étape critique pour CUT&Tag.Après la PCR, deux microlitres ont été transférés et la taille de l’ADN a été vérifiée sur du gel d’agarose à 1,5%. Cette figure montre que comparer avec le contrôle négatif du gène de l’immunoglobuline. La majeure partie des fragments d’ADN de l’échantillon de triméthylation Histone H3 Lysine 4 devrait varier de 280 à 500 paires de bases.Les fragments d’ADN peuvent être purifiés puis profilés par séquençage à haut débit. Cette figure montre le séquençage de génération des résultats pour l’anticorps anti-histone H3 Lysine 4 Trimethylation compare avec les groupes témoins immunoglobuline G négatifs. Cette technologie génère les bibliothèques d’ADN à haute résolution et en arrière-plan exceptionnellement faible en utilisant un petit nombre de cellules avec une procédure simplifiée par rapport à ChIP-seq.CUT&Tag est une nouvelle méthode toujours en cours.

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JoVE Journal

Biology

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Une approche fiable et utile pour détecter les modifications des histones sur les gènes de plantes spécifiques est décrite. L'approche combine immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et en temps réel de PCR quantitative. Elle permet la détection des modifications des histones sur des gènes spécifiques avec un rôle dans divers processus physiologiques.

Détection des modifications des histones dans les feuilles des plantes

En combinant natif et réticulation immunoprécipitation de la chromatine à haute résolution de spectrométrie de masse, l'approche ChroP permet de disséquer l'architecture protéomique composite de modifications des histones, des variantes et des protéines non-histoniques synergie au domaines de la chromatine fonctionnellement distinctes.

L&#39;approche ChroP Combine puce et la spectrométrie de masse à Disséquer protéomiques paysages Locus spécifiques de la chromatine

Nous fournissons ici un protocole efficace et fiable pour immunologique, hybridation fluorescente in situ, la coloration de l'ADN suivie quantitative, imagerie à haute résolution dans des ovules d'Arabidopsis thaliana l'ensemble du montage. Cette méthode a été utilisée avec succès pour analyser des modifications de la chromatine nucléaire et de l'architecture.

Une méthode efficace pour quantitative, analyse unicellulaire de la chromatine Modification et architecture nucléaire dans l&#39;ensemble du montage ovules dans<em&gt; Arabidopsis</em

Immunoprécipitation de la chromatine est une technique puissante pour l'identification des sites d'ADN d'Arabidopsis protéines de liaison in vivo. Cette procédure comprend la réticulation de la chromatine et la fragmentation, une immunoprécipitation avec des anticorps sélectifs contre la protéine d'intérêt, et l'analyse qPCR de l'ADN lié. Nous décrivons un test simple de ChIP optimisé pour les plantes d'Arabidopsis.

Immunoprécipitation de la chromatine test pour l&#39;identification de Arabidopsis interactions protéine-ADN<em&gt; In Vivo</em

Nous présentons une méthode efficace et reproductible pour isoler et de la culture des cellules progénitrices neurales de tissus du cerveau embryonnaire et postnatale pour l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) de l’histone 3 lysine 79 MBD (H3K79me2) - une marque d’histone agrave la domaine globulaire de l’histone 3.

Isolement et culture des progéniteurs neurones suivie par immunoprécipitation de la chromatine de marque d’Histone 3 Lysine 79 MBD

Le protocole a été développé pour extraire efficacement les histones intactes des matériaux de feuilles de sorgho pour le profilage des modifications post-translationnelles de l’histone qui peuvent servir de marqueurs épigénétiques potentiels pour aider à l’ingénierie des cultures résistantes à la sécheresse.

Isolement de l’histone des tissus foliolaires de Sorgho pour le profilage de spectrométrie de masse top down des marqueurs épigénétiques potentiels

Ici, nous présentons un protocole pour analyser la distribution à l’échelle du génome des modifications des histones, qui peut identifier de nouveaux gènes cibles dans la pathogenèse de M. oryzae et d’autres champignons filamenteux.

Analyse à l’échelle du génome de la distribution des modifications des histones à l’aide de la méthode de séquençage par immunoprécipitation de la chromatine dans Magnaporthe oryzae

Un flux de travail analytique basé sur la chromatographie liquide, la spectrométrie de mobilité des ions piégés et la spectrométrie de masse à temps de vol (LC-TIMS-TOF MS/MS) pour une analyse ascendante hautement fiable et hautement reproductible des modifications et de l’identification des histones en fonction des principaux paramètres (temps de rétention [RT], section efficace de collision [CCS] et rapport masse/charge précis [m/z]).

Criblage de modification des histones par chromatographie liquide, spectrométrie de mobilité des ions piégés et spectrométrie de masse à temps de vol

Les chercheurs novices dans le domaine de l’épigénétique trouveront que CUT&amp;Tag est une alternative beaucoup plus facile aux tests ChIP. CUT&amp;Tag a énormément bénéficié aux études épigénétiques sur des populations de cellules rares et primaires, générant des données de haute qualité à partir de très peu de cellules. Ce protocole décrit la réalisation de dosages H3K4me1 CUT&amp;Tag sur des myoblastes de souris isolés des muscles des membres postérieurs de souris.

Utilisation du clivage sous cibles et du test de marquage (CUT &#38; Tag) dans la recherche sur le myoblaste chez la souris

Ce protocole permet une extraction efficace d’histones de divers échantillons cliniques pour une analyse ultérieure des modifications post-traductionnelles par LC-MS/MS. En facilitant la détection robuste des modifications clés des histones, il constitue un outil précieux pour un profilage épigénétique complet dans de grandes cohortes cliniques.

Extraction d’histones à partir d’échantillons cliniques pour le profilage épigénétique par spectrométrie de masse

Cette étude présente un protocole multiome spatial Trekker–CUT&amp;Tag combinant le codage à barres spatial direct d’une section tissulaire avec l’analyse multiome unicellulaire. Cette approche permet simultanément un profilage spatial de l’expression génique par une seule cellule et la modification de l’histone H3K27ac, offrant des perspectives mécanistes sur la régulation génique dans le contexte de la microanatomie tissulaire.

Profilage multiomique spatialement résolu et intégré à cellules uniques du transcriptome et des cibles épigénomiques dans les sections de tissu gelé

Découvrez le protocole CUT&Tag affiné pour le profilage épigénomique des modifications d'histones H3K4me3 dans les plantes. Cette méthode efficace isole les noyaux intacts et permet une analyse précise de la chromatine.

Profilage de la modification H3K4me3 dans les usines à l’aide du clivage sous cibles et de la marquage

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