Perles chargeant des protéines et des acides nucléiques dans des cellules humaines adhérentes

Le chargement de billes est un test peu coûteux pour charger des particules imperméables à membrane dans des cellules adhérentes vivantes. Ce protocole s’est avéré extrêmement utile pour charger des sondes pour une seule cellule ou une seule molécule ou des expériences de microscopie à fluorescence. La charge de billes permet aux chercheurs de charger rapidement toutes sortes de molécules, y compris des protéines, de l’ADN, de l’ARN, des particules synthétiques ou une combinaison de celles-ci simultanément dans des cellules individuelles.

Lors du premier chargement de billes, il est important de tester la force de taraudage. Les lignées cellulaires réagissent différemment au chargement des perles. Ainsi, le nombre et la force des robinets peuvent être modifiés pour une charge optimale des cellules tout en minimisant le pelage des cellules.

Pour démontrer la procédure, Matthew Saxton et moi serons rejoints par nos collègues, dr Amanda Cook et Gabriel Galindo. Commencez par mesurer environ cinq millilitres de perles de verre dans un tube conique de 50 millilitres. Ajouter 25 millilitres d’hydroxyde de sodium à deux molaires dans le tube et mélanger doucement pendant deux heures à l’aide d’un agitateur ou d’un rotor.

Faites tourner brièvement le tube de perles dans une centrifugeuse si les billes sont en suspension, puis décantez l’hydroxyde de sodium tout en conservant autant de perles que possible. Lavez soigneusement les perles avec de l’eau de qualité de culture cellulaire jusqu’à ce que le pH soit neutre et décantez l’eau à chaque fois. Utilisez la bandelette de test de pH sur l’effluent pour confirmer un pH neutre, puis lavez soigneusement les billes avec de l’éthanol à 100%, deux à trois fois.

Décantation de l’éthanol à chaque fois. Séchez les perles et saupoudrez-les pour former une fine couche à l’intérieur d’un récipient stérile. Laissez ensuite le récipient ouvert à l’intérieur d’une armoire de biosécurité pour sécher les perles à l’air libre pendant la nuit.

Tapotez ou secouez doucement le récipient et vérifiez que les perles ont une texture sandy sans s’agglutination ni écaillage pour vous assurer que les perles sont complètement sèches. Ajouter les perles à l’appareil et couvrir toute l’ouverture de la chambre de maintien des perles à l’aide d’un maillage en polypropylène ou d’un matériau équivalent avec des ouvertures de 105 micromètres pour permettre aux perles de passer. Serrez le maillage entre les extrémités mâle et femelle d’une chambre d’imagerie métallique réutilisable, puis scellez-le hermétiquement avec le film cireux et stérilisez l’appareil aux UV pendant 15 minutes.

L’appareil de chargement de billes peut maintenant être utilisé pour effectuer des centaines de tests de chargement. Conservez l’appareil dans un récipient sec desséché par du gel de silice ou un autre milieu dessiccant et scellez-le. Si les perles deviennent, séchez complètement et stérilisez le chargeur de perles et remplacez-le par des perles fraîches, comme démontré précédemment.

Retirez le milieu des cellules et aspirez doucement tout le milieu autour des bords de la chambre. Inclinez ensuite la chambre à un angle d’environ 45 degrés et retirez la goutte restante de média dans le micro-puits central. Pipettez doucement la solution de chargement des billes sur le micro-puits en verre présent au centre de la chambre.

Utilisez l’appareil de chargement des billes pour disperser doucement une monocouche de billes de verre sur le dessus des cellules. Assurez-vous que les perles recouvrent complètement les cellules. Pincez la chambre avec deux doigts, soulevez-la d’environ deux pouces et abaissez-la fermement en utilisant une force approximativement équivalente à la chute du plat de cette hauteur, ajoutez doucement le milieu dans la chambre en pipetant lentement sur le côté en plastique de la chambre.

Aspirer les perles flottantes sans perturber les cellules, toute la procédure de chargement des billes doit être effectuée relativement rapidement. Ainsi, les cellules ne se dessèchent pas lorsqu’elles sont sans milieu. Ensuite, incubez les cellules 4,5 à deux heures dans l’incubateur.

Avant l’imagerie, lavez les cellules trois fois avec le milieu pour éliminer les billes et les composants de charge excédentaire dans la solution de chargement. Imagez les cellules immédiatement ou lorsque l’expérience l’exige à l’aide des instructions du manuscrit textuel. Les cellules qui ont été chargées avec succès de billes avaient presque toujours Cy3-Pa57 et A488-H3K11ac marqués ensemble les protéines.

Un microgramme d’ADN plasmidique et de GFP codant et 0,5 microgramme de protéine étiquetée Cy3 ont également été introduits dans les cellules via une charge de billes exprimée et visualisée. 40% des cellules étaient chargées de billes de protéines fab et 21% des cellules chargées de billes expriment le plasmide chargé par le noyau. Les cellules chargées de billes exprimaient différents niveaux de plasmide.

Le résultat de ce test de rapport de Fisher a montré que bien que les protéines un et deux aient des distributions d’intensité similaires, chaque protéine avait une distribution significativement plus petite que le plasmide. Les niveaux de protéines chargées de billes avaient peu de variance d’une cellule à l’autre et les niveaux de deux protéines chargées simultanément étaient fortement corrélés l’un avec l’autre. Un chargement correct des billes n’a eu presque aucun effet notable sur le nombre de cellules U2OS humaines ou leur morphologie lorsqu’elles ont été imagées directement avant, directement après et 24 heures après le chargement des perles.

Une mauvaise charge de perles avec des perles excessives et une force de taraudage a causé une perte de cellules, une mauvaise morphologie cellulaire et des grappes de perles restant sur le verre de couverture. même si l’on pense que les cellules subissent des dommages mécaniques pendant que les cellules de chargement des perles se sont développées et ont proliféré dans la chambre correctement chargée de perles. Il a également été observé que les cellules chargées de billes subissent une division cellulaire.

RPE1 et une lignée cellulaire HeLa ont été chargées de fab pour démontrer la polyvalence de la technique de chargement de perles. Les cellules U2OS étaient également chargées d’un Cy5-ARN 9-mer et d’un Cy3-ADN 28-mer ensemble. Lorsque vous essayez ce protocole, assurez-vous d’ajouter uniquement une monocouche de perles aux cellules, car trop de perles provoquent le détachement des cellules.

Ainsi, après une brève récupération de 30 minutes, les cellules de chargement des billes sont prêtes pour l’imagerie immédiatement ou des heures à des jours plus tard, si la procédure nécessite d’autres étapes telles que la coloration, qui peut également être effectuée après la période de récupération.