Détection directe des isolévuglandines dans les tissus à l’aide d’une protéine de fusion phosphatase alcaline D11 scFv et d’une immunofluorescence

Les isolévuglandines ont été impliquées dans plusieurs maladies, en particulier les maladies cardiovasculaires. Ce protocole a été développé pour détecter les isolévuglandines dans les tissus avec la protéine de fusion de la phosphatase alcaline D11 et l’immunofluorescence. Les méthodes actuelles de détection sont coûteuses ou nécessitent un anticorps secondaire pour un E-tag.

Trouver un anticorps secondaire fiable est difficile, mais ce protocole supprime l’étape de l’anticorps secondaire. Immerger les lames de tissus de souris et de paraffine humaine dans le xylène trois fois pendant cinq minutes pour déparrafiniser les tissus. Pour réhydrater les tissus, lavez les mouchoirs deux fois avec de l’éthanol à 95%, puis deux fois avec de l’éthanol à 70%, puis deux fois avec de l’éthanol à 50% préparé dans de l’eau.

Lavez les lames dans une solution saline tamponnée avec 0,1% Tween 20 trois fois en remplissant le porte-lames avec TBST. Ensuite, jetez le TBST. Placez les lames dans un tampon de citrate de sodium préchauffé et incuber dans un autocuiseur réglé à quatre minutes à haute pression, pour un temps total de récupération de l’antigène de 20 minutes.

À la fin de l’incubation, retirez les lames de l’autocuiseur et laissez-les refroidir pendant 20 minutes à température ambiante. Donnez trois lavages rapides aux lames avec TBST comme démontré. Bloquez les lames en ajoutant 2%BSA dissous dans TBST.

Couvrir les lames avec du ruban de paraffine et incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Après l’incubation, jetez le tampon bloquant. Ajouter 200 microlitres de phosphatase alcaline D11 préparée dans TBST aux lames et couvrir les lames de ruban de paraffine.

Après avoir incubé les lames dans une chambre humidifiée pendant trois heures à température ambiante, lavez les lames trois fois avec TBST. Développer les lames avec un révélateur de phosphatase alcaline calorimétrique pour l’immunohistochimie, ou un révélateur de phosphatase alcaline fluorescente pour l’immunofluorescence. Lavez les lames une fois avec TBST pour éliminer l’excès de révélateur et empêcher tout développement ultérieur des couleurs.

Contre-colorer les lames avec un microgramme par millilitre de coloration nucléaire HEX préparée dans PBS pour l’immunofluorescence. Ensuite, lavez les lames une fois avec TBST pour enlever tout excès de contre-tache. Utilisez le support de montage pour placer le bordereau de couvercle sur les glissières développées.

Observez les lames sous un microscope à lumière inversée pour l’immunohistochimie ou un microscope confocale fluorescent pour l’immunofluorescence. Quatre expériences de contrôle négatif peuvent être effectuées pour confirmer la spécificité de la coloration D11 AP pour l’isolévuglandine. Dans la première expérience de contrôle négatif, incuber les tissus avec D11 AP dilué dans TBST, ou TBST seul.

Incuber ensuite les tissus avec de l’AP D11 dilué et de l’extrait pariplasmique bactérien dilué dans du TBST sans le liant D11 AP. Pour le test compétitif, préparer isoLG et isoLG adduits à l’albumine sérique de souris à un rapport molaire de huit pour un. Diluer D11 AP un à 10 dans TBST.

Incuber ensuite le D11 AP dilué avec 50 microgrammes par millilitre de MSA adduit à l’isolévuglandine, ou le MSA non adduit pendant une heure à température ambiante. Ajouter D11 AP avec isolévuglandine MSA ou D11 AP avec MSA non adduit aux tissus pour la coloration. Utiliser un anticorps D20 variable à fragment de chaîne unique pertinent pour colorer les tissus pour l’ensemble de contrôle négatif final.

L’immunofluorescence de l’aorte chez les souris hypertendues et normotendues a été étudiée à l’aide de ce protocole. La coloration avec D11 AP a indiqué une concentration accrue d’isoLGs dans l’aorte des souris souffrant d’hypertension induite par l’angiotensine II par rapport aux souris témoins. Le D11 AP a été utilisé pour détecter les isolévuglandines présentes dans les tissus intestinaux de patients humains souffrant d’hypertension et d’humains normotendus.

Les tissus des patients souffrant d’hypertension présentaient des concentrations élevées d’isolevuglandines. Les tissus ont été colorés avec de l’extrait pariplasmique et sans D11 AP. La coloration plus brillante a été observée dans le tissu coloré avec D11 AP par rapport au tissu coloré à l’extrait pariplasmique, confirmant que la coloration n’était pas due à la phosphatase alcaline bactérienne non conjuguée présente dans l’extrait pariplasmique. Dans l’essai compétitif, le tissu coloré avec D11 AP pré-incubé avec le concurrent isoLG a montré une coloration diminuée, similaire à la coloration observée dans les tissus avec D11 AP, qui montre une spécificité de D11 AP aux isolevuglandines.

Dans le témoin négatif, la coloration de l’aorte de souris avec D11 AP a entraîné une forte coloration par rapport à D20, indiquant la spécificité de D11 AP aux isolévuglandines dans l’aorte hypertendue. Il est important d’inactiver toute phosphatase alcaline endogène présente dans les tissus pour limiter la coloration de fond.