Capture assistée par résine couplée à un étiquetage de masse en tandem isobare pour la quantification multiplexée de l’oxydation des protéines thiols

Ce protocole décrit une méthode qui permet l’identification spécifique au site des résidus oxydés de cystine de protéines. La méthode permet de générer des données quantitatives et spécifiques au site sur les résidus de cystine oxydés à partir de différents types d’échantillons. Pour commencer la procédure de capture assistée, laver deux fois les granulés de protéines précipités avec de l’acétone en centrifugeant à 20, 500 G, dans quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Ensuite, décantez l’acétone et retirez l’acétone restante avec une micro-pipette. À l’aide d’une pipette sérologique en verre, ajoutez trois millilitres d’acétone fraîche glacée dans le tube et mélangez bien en retournant le tube plusieurs fois. Après le deuxième lavage, laissez les granulés sécher à l’air pendant une à deux minutes sans les laisser sécher.

Ajouter un millilitre de tampon B à la pastille de protéine séchée. Pour solubiliser la protéine, sonicer la pastille à plusieurs reprises dans un sonicateur de bain avec une sortie de 250 watts pendant 15 à 30 secondes à la fois, avec un bref vortex. Effectuer le test de l’acide bicinchoninique ou BCA pour mesurer la concentration en protéines.

Pour normaliser les concentrations de protéines, transférez 500 microgrammes d’échantillon de protéines dans un filtre centrifuge de 0,5 millilitre et 10 kilodaltons et augmentez le volume de l’échantillon à 500 microlitres avec un tampon de remise en suspension. Centrifuger le mélange tampon protéique à 14 000 g à température ambiante, jusqu’à ce que le volume dans le filtre centrifuge soit inférieur à 100 microlitres. Prélever l’échantillon en inversant le filtre dans un tube de collecte.

Centrifuger l’échantillon à 1000 G pendant deux minutes et ajouter le tampon C pour obtenir un volume final de 500 microlitres. Pour réduire les thiols protéiques, ajoutez 20 microlitres de dithiothréitol ou de DTT à 500 millimolaires à l’échantillon pour obtenir une concentration finale de 20 millimolaires et incuber les échantillons pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius avec agitation à 850 tr / min. Après réduction, centrifuger les échantillons dans des filtres centrifuges de 0,5 millilitre et 10 kilodaltons à 14 000 g à température ambiante, jusqu’à ce que le volume dans le filtre centrifuge soit inférieur à 100 microlitres.

Ajouter le tampon D pour porter le volume à 500 microlitres et répéter la centrifugation. Après la quatrième centrifugation, prélever les échantillons en inversant le filtre dans un tube de collecte pour centrifuger à 1000 G pendant deux minutes. Ensuite, mesurez la concentration en protéines à l’aide du test BCA.

Ensuite, placez les colonnes de spin sur un collecteur à vide et, à l’aide d’une micro-pipette, transférez 500 microlitres de la boue de résine d’affinité thiol fraîchement préparée à chaque colonne. Appliquer le vide pour éliminer l’eau. Répétez la procédure une fois pour obtenir 30 milligrammes de résine par colonne.

Lavez la résine cinq fois avec 500 microlitres d’eau ultrapure, en appliquant un vide pour éliminer l’eau, puis cinq fois avec 500 microlitres de tampon E.In un nouveau tube, ajoutez le tampon C à 150 microgrammes de l’échantillon de protéines réduit jusqu’à ce que le volume final soit de 120 microlitres. Transférer la solution protéique dans une colonne de spin bouché contenant la résine. Placer le bouchon sur la colonne et incuber pendant deux heures à température ambiante en agitant à 850 tr/min.

Lavez la résine comme décrit dans le manuscrit. Remplacez la fiche. Pour effectuer une digestion tryptique sur résine, ajoutez 120 microlitres de solution de trypsine fraîchement préparée aux échantillons et incuber la colonne pendant une nuit à 37 degrés Celsius, en agitant à 850 tr / min.

Le lendemain, lavez la résine plusieurs fois comme décrit dans le manuscrit et remplacez le bouchon. À l’aide d’une micropipette, ajouter 40 microlitres de tampon de bicarbonate de triéthylammonium de 100 millimolaires à la résine lavée. Ajoutez ensuite 70 microlitres de l’étiquette de masse en tandem dissous ou du réactif de marquage TMT, et incuber pendant une heure à température ambiante en agitant à 850 tr / min.

Conservez tout réactif TMT restant à moins 80 degrés Celsius. Lavez la résine et remplacez le bouchon. Éluer les peptides marqués TMT en ajoutant 100 microlitres de tampon de bicarbonate d’ammonium 100 millimolaires à pH 8,0, contenant 20 millimolaires de DTT, à la colonne, et en incubant la colonne sur un mélangeur thermique à température ambiante pendant 30 minutes à 850 tr / min.

Après l’incubation, effectuer l’élution en plaçant la colonne sur un collecteur à vide, en appliquant le vide et en éluant les échantillons dans un tube microcentrifuge de cinq millilitres. Répétez l’étape une fois, puis ajoutez 100 microlitres d’acétonitrile à 80% avec 0,1% d’acide trifluoroacétique dans la colonne. Après avoir incubé la colonne pendant 10 minutes à température ambiante, éluer l’échantillon dans le même tube à centrifuger de cinq millilitres.

Placer les échantillons élués dans un concentrateur sous vide jusqu’à ce qu’ils soient secs. Ensuite, conservez les peptides secs à moins 80 degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure. L’analyse qualitative d’échantillons peptidiques de cellules RAW 264.7 a été réalisée avec SDS-PAGE, dans laquelle les échantillons ont été comparés en déterminant différents niveaux d’oxydation dus aux traitements.

Les protéines séparées ont ensuite été sondées par transfert Western pour étudier plus en détail les niveaux d’oxydation des protéines individuelles. Les intensités ioniques rapportées de peptides contenant de la cystine ont été analysées par chromatographie liquide par spectrométrie de masse en tandem. La stœchiométrie d’oxydation thiol de l’iTRAQ, des peptides enrichis et oxydés marqués aux niveaux individuels du site cystine a été quantifiée.

Retirez soigneusement l’acétone sans déranger la pastille de protéine. Assurez-vous que la pastille de protéine est complètement solubilisée et quantifiée avec précision, et que la résine est allouée avec précision aux colonnes de spin. Assurez-vous de remettre en suspension la résine pendant les étapes de lavage.

Une évaluation plus approfondie des protéines et peptides enrichis peut être effectuée par SDS-PAGE et coloration, Western blot et spectrométrie de masse.