Échange hydrogène/deutérium basé sur l’électrophorèse capillaire pour la caractérisation conformationnelle des protéines avec spectrométrie de masse descendante

Présenté ici est un protocole pour une approche d’échange hydrogène/deutérium (HDX) basée sur l’électrophorèse capillaire couplée à une spectrométrie de masse descendante. Cette approche caractérise la différence dans les structures d’ordre supérieur entre différentes espèces de protéines, y compris les protéines dans différents états et différentes protéoformes, en effectuant une séparation différentielle simultanée HDX et électrophorétique.

Cette méthode permet de séparer les espèces protéiques coexistantes, y compris différents conformateurs ou variantes, et de caractériser en ligne leurs différences de structure d’ordre supérieur en une seule mesure CEMS. Il utilise l’effet électrophorétique pour fournir un environnement de près de 100% de durée pour les réactions HDX et la séparation orthogonale des espèces protéiques coexistantes pendant HDX pour l’analyse descendante de la SEP. Commencez par le préconditionnement de l’électrophorèse capillaire, de l’échange d’hydrogène deutérium ou de la configuration CE HDX.

En utilisant les ultrasons dans un mélange de 50% de méthanol, 49% d’eau et 1% d’acide formique, nettoyez le flux à travers l’interface microviale CE-MS pendant au moins 30 minutes à température ambiante. Montez le capillaire modifié HPC sur l’électrophérèse capillaire ou l’instrument CE. Rincez le capillaire avec une solution d’électrolyte de fond ou BGE pendant 10 minutes à l’aide de l’échantillonneur automatique et laissez-le rempli avec le BGE.

Utilisez une longueur appropriée de tube capillaire en silice fondue non modifiée comme tuyau de perfusion pour la solution modificateur. Utilisez un manchon d’union et approprié pour connecter le tuyau modificateur à une seringue en verre étanche aux gaz avec une température émoussée et rincez le tuyau avec la solution modificateur pendant au moins 10 minutes à l’aide d’une pompe à perfusion. Insérez les sorties du capillaire ceux codés HPC et des tubes modificateurs chargés des solutions correspondantes dans l’interface CE-MS nettoyée.

Avancez la seringue avec les pompes à perfusion de manière à ce que la solution modificateur atteigne l’extrémité de l’interface. Montez l’interface CE-MS assemblée sur un boîtier de source d’ionisation par pulvérisation de nano-électrons d’un spectromètre de masse. Appliquez une tension de pulvérisation de 3 à 5 kilovolts sur l’interface CE-MS.

Infuser la solution modificateur avec la pompe de l’infuseur à un débit allant de 0,1 à 10 microlitres par minute et assurer une électropulvérisation stable à l’extrémité de l’interface CE-MS. Placez le flacon d’échantillon contenant le BGE et l’échantillonneur automatique, qui sera utilisé plus tard pour acquérir des électrophérogrammes vierges et des spectres de masse vierges. Estimer le volume d’injection en utilisant la relation entre le volume d’injection et les paramètres d’injection.

Et injectez la solution d’échantillon à l’aide de l’échantillonneur automatique à deux PSI pendant une durée appropriée. Commencez la séparation CE en appliquant une tension électrophorétique de 20 kilovolts dans une pression de perfusion allant de 0 à 2 PSI et acquérez l’électrophérogramme. Pendant ce temps, acquérir les données MS en mode chromatographique où le graphique de courant ionique est acquis en fonction du temps et les scans MS correspondants ne sont pas automatiquement combinés en un seul spectre.

Enregistrez l’électrophérogramme vierge et les spectres de masse comme références. Placez les flacons d’échantillon contenant les concentrations souhaitées des solutions d’échantillons de protéines dans l’auto-échantillonneur et acquérez les électrophérogrammes et les spectres MS1 des espèces de protéines séparées électrophorétiquement et marquées au deutérium. Effectuer des mesures Ms.en tandem pour les espèces d’intérêt, soit après avoir acquis les spectres MS1 au cours de la même série, soit lors d’une exécution séparée ultérieure.

Après chaque mesure, rincer le capillaire avec du BGE à une pression de 20 PSI pendant au moins 10 minutes. Nettoyez l’interface CEMS et tous les tubes pour le stockage à la fin des expériences. Acquérir un ensemble de données de l’échantillon de point final HDX avec SEP en mode perfusion directe.

Une faible pression d’infusion a entraîné une meilleure séparation des pics CE, mais a entraîné une augmentation du temps de migration et de la durée de l’expérience. Un temps de réaction HDX plus long a entraîné un niveau plus élevé de durabilité des analytes protéiques. La variance A et B de l’immunoglobuline bêta ou bêta IG, qui ne diffèrent que par deux résidus d’acides aminés dans leur séquence, a donné lieu à deux pics correctement séparés dans l’électrophérogramme dérivé de l’EIC.

La variance différentielle marquée au deutérium a entraîné une distribution de masse distincte des ions. Un nombre plus faible d’ions Z que d’ions C a été observé en raison de la liaison dysofiée unique dans la confirmation de l’IG bêta qui limite l’efficacité de fragmentation entre CS 82 et CS 176. La plupart des ions fragments produits à partir de l’IGA bêta et de l’IGB bêta présentent une absorption similaire du deutérium.

Cependant, les segments plus importants couvrant les sites de variation de séquence de l’IGA bêta ont été d’autant plus déduis que l’IGB bêta. Le pH de BGE est ajusté en fonction du point isoélectrique de l’échantillon pour empêcher l’agrégation des protéines et faciliter la séparation tout en maintenant le complexe.