Échange hydrogène/deutérium basé sur l’électrophorèse capillaire pour la caractérisation conformationnelle des protéines avec spectrométrie de masse descendante
8 juin 2021
Présenté ici est un protocole pour une approche d’échange hydrogène/deutérium (HDX) basée sur l’électrophorèse capillaire couplée à une spectrométrie de masse descendante. Cette approche caractérise la différence dans les structures d’ordre supérieur entre différentes espèces de protéines, y compris les protéines dans différents états et différentes protéoformes, en effectuant une séparation différentielle simultanée HDX et électrophorétique.
Cette méthode permet de séparer les espèces protéiques coexistantes, y compris différents conformateurs ou variantes, et de caractériser en ligne leurs différences de structure d’ordre supérieur en une seule mesure CEMS. Il utilise l’effet électrophorétique pour fournir un environnement de près de 100% de durée pour les réactions HDX et la séparation orthogonale des espèces protéiques coexistantes pendant HDX pour l’analyse descendante de la SEP. Commencez par le préconditionnement de l’électrophorèse capillaire, de l’échange d’hydrogène deutérium ou de la configuration CE HDX.
En utilisant les ultrasons dans un mélange de 50% de méthanol, 49% d’eau et 1% d’acide formique, nettoyez le flux à travers l’interface microviale CE-MS pendant au moins 30 minutes à température ambiante. Montez le capillaire modifié HPC sur l’électrophérèse capillaire ou l’instrument CE. Rincez le capillaire avec une solution d’électrolyte de fond ou BGE pendant 10 minutes à l’aide de l’échantillonneur automatique et laissez-le rempli avec le BGE.
Utilisez une longueur appropriée de tube capillaire en silice fondue non modifiée comme tuyau de perfusion pour la solution modificateur. Utilisez un manchon d’union et approprié pour connecter le tuyau modificateur à une seringue en verre étanche aux gaz avec une température émoussée et rincez le tuyau avec la solution modificateur pendant au moins 10 minutes à l’aide d’une pompe à perfusion. Insérez les sorties du capillaire ceux codés HPC et des tubes modificateurs chargés des solutions correspondantes dans l’interface CE-MS nettoyée.
Avancez la seringue avec les pompes à perfusion de manière à ce que la solution modificateur atteigne l’extrémité de l’interface. Montez l’interface CE-MS assemblée sur un boîtier de source d’ionisation par pulvérisation de nano-électrons d’un spectromètre de masse. Appliquez une tension de pulvérisation de 3 à 5 kilovolts sur l’interface CE-MS.
Infuser la solution modificateur avec la pompe de l’infuseur à un débit allant de 0,1 à 10 microlitres par minute et assurer une électropulvérisation stable à l’extrémité de l’interface CE-MS. Placez le flacon d’échantillon contenant le BGE et l’échantillonneur automatique, qui sera utilisé plus tard pour acquérir des électrophérogrammes vierges et des spectres de masse vierges. Estimer le volume d’injection en utilisant la relation entre le volume d’injection et les paramètres d’injection.
Et injectez la solution d’échantillon à l’aide de l’échantillonneur automatique à deux PSI pendant une durée appropriée. Commencez la séparation CE en appliquant une tension électrophorétique de 20 kilovolts dans une pression de perfusion allant de 0 à 2 PSI et acquérez l’électrophérogramme. Pendant ce temps, acquérir les données MS en mode chromatographique où le graphique de courant ionique est acquis en fonction du temps et les scans MS correspondants ne sont pas automatiquement combinés en un seul spectre.
Enregistrez l’électrophérogramme vierge et les spectres de masse comme références. Placez les flacons d’échantillon contenant les concentrations souhaitées des solutions d’échantillons de protéines dans l’auto-échantillonneur et acquérez les électrophérogrammes et les spectres MS1 des espèces de protéines séparées électrophorétiquement et marquées au deutérium. Effectuer des mesures Ms.en tandem pour les espèces d’intérêt, soit après avoir acquis les spectres MS1 au cours de la même série, soit lors d’une exécution séparée ultérieure.
Après chaque mesure, rincer le capillaire avec du BGE à une pression de 20 PSI pendant au moins 10 minutes. Nettoyez l’interface CEMS et tous les tubes pour le stockage à la fin des expériences. Acquérir un ensemble de données de l’échantillon de point final HDX avec SEP en mode perfusion directe.
Une faible pression d’infusion a entraîné une meilleure séparation des pics CE, mais a entraîné une augmentation du temps de migration et de la durée de l’expérience. Un temps de réaction HDX plus long a entraîné un niveau plus élevé de durabilité des analytes protéiques. La variance A et B de l’immunoglobuline bêta ou bêta IG, qui ne diffèrent que par deux résidus d’acides aminés dans leur séquence, a donné lieu à deux pics correctement séparés dans l’électrophérogramme dérivé de l’EIC.
La variance différentielle marquée au deutérium a entraîné une distribution de masse distincte des ions. Un nombre plus faible d’ions Z que d’ions C a été observé en raison de la liaison dysofiée unique dans la confirmation de l’IG bêta qui limite l’efficacité de fragmentation entre CS 82 et CS 176. La plupart des ions fragments produits à partir de l’IGA bêta et de l’IGB bêta présentent une absorption similaire du deutérium.
Cependant, les segments plus importants couvrant les sites de variation de séquence de l’IGA bêta ont été d’autant plus déduis que l’IGB bêta. Le pH de BGE est ajusté en fonction du point isoélectrique de l’échantillon pour empêcher l’agrégation des protéines et faciliter la séparation tout en maintenant le complexe.
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Aperçu
Ce protocole décrit une méthode d'échange hydrogène/deutérium (HDX) fondée sur l'électrophorèse capillaire et associée à une spectrométrie de masse en approche haut-bas. Elle permet de caractériser les différences de structure tertiaire entre diverses espèces protéiques, y compris différents états et protéofomres, grâce à un fractionnement électrophorétique et un échange HDX différentiel réalisés simultanément.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biochimie
- Spectrométrie de masse
- Chimie des protéines
Contexte
- Électrophorèse capillaire (CE) est une technique puissante permettant de séparer les biomolécules.
- Échange hydrogène/déutérium (HDX) fournit des informations sur la dynamique et la structure des protéines.
- La spectrométrie de masse en approche descendante permet l'analyse de protéines intactes et de leurs variants.
- Cette méthode peut analyser plusieurs conformères protéiques lors d'une seule mesure.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode permettant d'analyser les structures tridimensionnelles des protéines.
- Faciliter la séparation d'espèces protéiques coexistantes.
- Améliorer l'efficacité des mesures de HDX par séparation électrophorétique.
Méthodes utilisées
- Préconditionnement du dispositif d'électrophorèse capillaire.
- Ultrasonication de l'interface CE-MS dans un mélange de méthanol, d'eau et d'acide formique.
- Rinçage de la capillaire avec une solution d'électrolyte tampon.
- Réalisation de réactions de HDX dans un environnement contrôlé pendant l'électrophorèse.
Résultats principaux
- Séparation réussie de différents conformères protéiques.
- Caractérisation des différences structurales dans une seule mesure CEMS.
- Efficacité démontrée de la méthode pour l'analyse en ligne.
- Apport de connaissances sur la dynamique des espèces protéiques.
Conclusions
- La méthode CE HDX est efficace pour l'étude de la structure des protéines.
- Cette approche peut être appliquée à diverses espèces et états de protéines.
- Elle offre un processus simplifié pour analyser la dynamique des protéines.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La résolution de l'hétérogénéité conformationnelle des protéines thérapeutiques demeure un défi critique dans la recherche et le développement en biopharmacie, notamment pour caractériser les structures et la dynamique de haut niveau des états protéiques coexistants. Cette méthode d’échange hydrogène/déutérium basée sur l’électrophorèse capillaire (CE-HDX) permet une analyse spécifique aux conformères des différences structurales protéiques en une seule mesure, soutenant ainsi la validation ciblée et la réduction des risques mécanistiques en phase précoce de découverte. En intégrant la séparation électrophorétique à la spectrométrie de masse en approche « top-down », cette approche renforce la fiabilité prédictive du comportement des protéines et éclaire les décisions d’avancement ou d’abandon lors de l’identification des candidats.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en résolvant les différences conformationnelles entre les variants protéiques et les protéofomes.
- Valeur opérationnelle : Soutient la validation fonctionnelle des cibles grâce à la caractérisation de structures tridimensionnelles spécifiques aux conformères.
- Valeur prédictive : Renforce la confiance dans le choix des cibles en révélant les dynamiques structurales liées à la fonction biologique.
Développement de criblage et de tests
- Préparation des tests : Prépare des systèmes protéiques biologiquement pertinents pour des analyses en aval en séparant et en caractérisant les états coexistants.
- Résultats quantitatifs : Fournit des mesures de deutération globales et au niveau des fragments, permettant une comparaison quantitative des conformères protéiques.
- Reproductibilité : Réduit au minimum la présence de solvant protique résiduel lors de l'échange hydrogène-deutérium (HDX), créant ainsi un environnement de deutération quasi complet pour des résultats cohérents.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Relie les découvertes initiales sur la conformation aux validations précliniques en caractérisant la dynamique des protéines en solution.
- Réduction des risques mécanistiques : Clarifie les relations structure-fonction des variants protéiques, réduisant ainsi l'ambiguïté lors de l'optimisation des candidats thérapeutiques.
- Alignement sur les biomarqueurs : Facilite l'identification de biomarqueurs conformationnels associés à des résultats fonctionnels dans des systèmes pertinents pour la maladie.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation précoce de cibles jusqu'à l'identification de composés initiateurs, où la résolution conformationnelle oriente l'ingénierie des protéines et les campagnes de criblage.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses en séparant et en analysant des conformères protéiques coexistants dans des conditions proches de l'état natif.
- Criblage : Permet la standardisation des tests en fournissant des lectures structurales quantitatives et reproductibles pour les espèces protéiques.
- Analytique : Fournit des niveaux globaux de deutération et des profils d'absorption spécifiques aux fragments, facilitant l'analyse comparative des états protéiques.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre la dynamique structurale et les résultats fonctionnels, soutenant ainsi les décisions d'avancement ajustées au risque.
- Réutilisation en entreprise : Fonctionne comme une plateforme réutilisable pour caractériser l'hétérogénéité protéique à travers plusieurs cibles et projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive concernant le comportement des protéines en résolvant l'hétérogénéité conformationnelle.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et l'évolutivité grâce à l'intégration automatisée de l'EC-MS et à la réduction des artefacts liés au solvant.
- Valeur stratégique : Améliore la qualité des décisions « aller/ne pas aller » en réduisant l'incertitude mécanistique associée aux cibles protéiques.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats protéiques en fonction de leur stabilité structurale et de leurs dynamiques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Requiert une expertise en électrophorèse capillaire, en spectrométrie de masse et en principes de HDX protéique.
- Dépend de la compatibilité de l'interface CE-MS, de l'optimisation de l'électrolyte tampon et de l'acheminement de la solution modificatrice.
- Implique une standardisation inter-équipes des paramètres de trempe de HDX, de dénaturation et d'acquisition MS.
- Implique des adaptations selon la taille, la charge et la solubilité variables des protéines en conditions électrophorétiques.
- Limité par la durée d'analyse à faibles pressions d'infusion, qui améliorent la séparation mais prolongent la durée de l'expérience.
