Evaluation de l’activité antitumorale in vivo des nanoparticules de polyanhydride IL-1α

Ces protocoles constituent un moyen efficace d’étudier l’activité antitumorale des attaques de modulateurs immunitaires. De plus, l’analyse des chances associées dans les populations de cytokines circulantes et de cellules immunitaires peut être effectuée à l’aide des méthodes proposées. Le principal avantage de ce protocole est qu’il s’agit d’un moyen simple et direct d’implanter une tumeur et de surveiller sa croissance. L’implication directe de cette technique est d’évaluer l’efficacité de certaines thérapies ou défis dans la recherche anticancéreuse. De plus, certains aspects de ces techniques se prêtent aux études de toxicité. Pour commencer, décongelez un flacon congelé de cellules EERL murines dans un bain-marie préchauffé à 37 degrés Celsius et transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres contenant un milieu de culture chaud. Centrifugez le tube conique à 277 fois G pendant cinq minutes à 25 degrés Celsius pour éliminer le média. Ensuite, remettez le palais cellulaire en suspension dans un milieu frais de trois à cinq millilitres et transférez-le dans un flacon de culture cellulaire T25. Laissez les cellules se développer dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, élargissez les flacons plus grands et passez tous les trois jours. Lorsqu’il y a suffisamment de cellules pour l’implantation souhaitée chez toutes les souris, retirez les flacons, jetez le milieu et rincez doucement les cellules PBS. Ajoutez ensuite quatre millilitres d’EDTA à 0,25 % de trypsine et incubez à 37 degrés Celsius pendant deux minutes. Ajouter un milieu frais pour arrêter la réaction de trypsine et recueillir la suspension cellulaire dans des tubes coniques de 50 millilitres. Suspendez à nouveau les cellules dans un milieu frais et comptez les cellules. Centrifugez une fois de plus, puis ajoutez du PBS froid aux cellules pour obtenir une concentration finale de 10 millions de cellules par millilitre. Conservez la suspension cellulaire sur de la glace avant l’injection. Désinfectez la zone des flancs avec un tampon à l’éthanol. Pour injecter une suspension cellulaire chez la souris, aspirez 100 microlitres de suspension cellulaire dans la seringue et retirez toutes les bulles et l’espace mort par le haut. Injectez ensuite la suspension cellulaire par voie sous-cutanée de manière lente et régulière à des souris anesthésiées. Placez les animaux dans leurs cages respectives et surveillez-les jusqu’à ce qu’ils se remettent de l’anesthésie. Pour prélever du sang, saisissez la peau lâche par-dessus l’épaule à l’aide de la main non dominante et perforez la veine sous-maxillaire avec une aiguille ou une lancette de calibre 18. Recueillir 200 à 300 microlitres de sang dans un tube à centrifuger en polypropylène de 1,5 millilitre ou un tube séparateur de sérum. Après la prise de sang, appliquez une légère pression sur le site de ponction jusqu’à ce que le saignement ait cessé. Remettez les souris dans leurs cages respectives et observez-les jusqu’à ce qu’elles se remettent de l’anesthésie. Laissez le sang recueilli coaguler à température ambiante pendant 20 à 30 minutes. Placez ensuite les tubes sur de la glace jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être centrifugés. Centrifugez le sang coagulé à 1 540 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius et prélevez soigneusement la couche de sérum par le haut. Décongelez les échantillons de sérum ou de plasma tout en les conservant sur de la glace. Ensuite, centrifugez les échantillons à 1 540 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, pour sédimenter les débris cellulaires et recueillir soigneusement la couche de sérum par le haut. Placez le kit multiplex à température ambiante et effectuez le test selon le protocole du fabricant. Posez chaque souris sur le dos et vaporisez 70% d’éthanol sur la peau de la région abdominale. Utilisez des pinces et des ciseaux pour couper le ganglion lymphatique du côté droit des souris et la tumeur du côté gauche. Si la tumeur est grosse, coupez-la en petits morceaux et retirez environ 500 à 600 milligrammes du tissu. Placez les tissus sur les tubes dissociateurs respectifs contenant trois à cinq millilitres de média RPMI. Homogénéiser le tissu à l’aide d’un dissociateur automatisé. Après homogénéisation, filtrez la suspension cellulaire à travers un filtre de 70 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifuger à 277 fois G pendant cinq minutes à 25 degrés Celsius pour éliminer le fluide. Lavez et remettez les cellules en suspension dans un à deux millilitres de PBS froid. Utilisez une coloration au bleu de trypsine à 0,4 % pour compter les cellules viables dans un hémocytomètre.Calculez le volume nécessaire pour obtenir deux à trois millions de cellules et transférez-les sur le tube de télécopie respectif. Centrifugeuse a compté les cellules à 277 fois G pendant cinq minutes à 25 degrés Celsius.Décanter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 300 microlitres de PBS. Ajoutez 0,5 à un microlitre de colorant zombie par tube et incubez à température ambiante pendant 20 minutes dans l’obscurité. Centrifugez les cellules Lavez-les avec un à deux millilitres de tampon de télécopie et mettez-les en suspension dans 200 microlitres de tampon de télécopie. Ajoutez le bloqueur des récepteurs FC selon le protocole du fabricant et incubez les cellules pendant 10 minutes. Centrifugez à nouveau aux paramètres décrits précédemment et lavez les cellules avec un à deux millilitres de tampon de télécopie. Ajouter le cocktail d’anticorps et incuber pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Après l’incubation, centrifugez et lavez les cellules avec un tampon de fax d’un à deux millilitres. Ajouter 300 à 400 microlitres de solution de paraformaldéhyde à 2 % et remettre en suspension pour la fixation. Conservez les cellules pendant quelques jours à quatre degrés Celsius ou analysez-les immédiatement à l’aide d’un cytomètre en flux multicolore. Dans cette étude, l’activité antitumorale du polyannhydride IL-1