Name: Génération d’organoïdes cérébraux humains pour la modélisation des maladies mitochondriales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Découvrez un protocole pour générer des organoïdes cérébraux humains à partir de cellules iPSC afin d'évaluer les propriétés mitochondriales sans bioreacteur coûteux. Cette méthode permet d'étudier les maladies mitochondriales et d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

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Nous remercions Miriam Bünning pour son soutien technique. Nous reconnaissons le soutien de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (PR1527/5-1 à A.P.), de Spark et de l’Institut de la santé de Berlin (BIH) (FONDS DE VALIDATION DE LA BOSNIE-HERZÉGOVINE à A.P.), de la United Mitochondrial Disease Foundation (UMDF) (Leigh Syndrome International Consortium Grant to A.P.), de l’hôpital universitaire de Düsseldorf (Forschungskommission UKD à A.P.) et du ministère fédéral allemand de l’Éducation et de la Recherche (BMBF) (e: Subvention bio jeune chercheur AZ 031L0211 à A.P.). Les travaux en laboratoire du C.R.R. ont été soutenus par la DFG (FOR 2795 « Synapses sous stress », Ro 2327/13-1).

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Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier ou non financier concurrent.

Cet article décrit la génération reproductible d’organoïdes cérébraux humains dérivés de l’iPSC et leur utilisation pour la modélisation des maladies mitochondriales. Le protocole décrit ici est modifié sur la base d’un travail précédemment publié20. Un avantage majeur du protocole actuel est qu’il ne nécessite pas l’intégration manuelle de chaque organoïde dans une matrice d’échafaudage. En fait, la solution matricielle est simplement dissoute dans le milieu de culture cellulaire. De plus, il n’e...

Les maladies mitochondriales représentent la plus grande classe d’erreurs innées du métabolisme1. Ils sont causés par des mutations génétiques perturbant différents processus mitochondriaux, y compris la phosphorylation oxydative (OXPHOS)2, l’assemblage de la chaîne respiratoire, la dynamique mitochondriale et la transcription ou la réplication de l’ADN mitochondrial3. Les tissus ayant des besoins énergétiques sont particulièrement affectés par le dysfonctionnement mitochondrial4. En conséquence, les patients atteints de maladies mitochondriales développent généralement des manifestations neurologiques précoces.
Il n’existe actuellement aucun traitement disponible pour les enfants atteints de maladies mitochondriales5. Un obstacle majeur au développement de médicaments pour les maladies mitochondriales est le manque de modèles efficaces récapitulant l’évolution de la maladie humaine6. Plusieurs des modèles animaux actuellement étudiés ne présentent pas les défauts neurologiques présents chez les patients7. Par conséquent, les mécanismes sous-jacents à la pathologie neuronale des maladies mitochondriales ne sont toujours pas entièrement compris.
Des études récentes ont généré des CSPi de patients atteints de maladies mitochondriales et ont utilisé ces cellules pour obtenir des cellules neuronales spécifiques au patient. Par exemple, des défauts génétiques associés à la maladie mitochondriale, le syndrome de Leigh, se sont avérés causer des aberrations dans la bioénergétique cellulaire8,9, la synthèse des protéines10 et l’homéostasie du calcium9,11. Ces rapports ont fourni d’importants indices mécanistes sur la déficience neuronale survenant dans les maladies mitochondriales, ouvrant la voie à la découverte de médicaments pour ces maladies incurables12.
Les cultures bidimensionnelles (2D), cependant, ne permettent pas d’étudier la complexité architecturale et l’organisation régionale des orgues 3D13. À cette fin, l’utilisation d’organoïdes cérébraux 3D dérivés d’iPSC spécifiques au patient14 peut permettre aux chercheurs d’obtenir des informations supplémentaires importantes et ainsi aider à disséquer l’impact des maladies mitochondriales sur le développement et la fonction du système nerveux15. Des études utilisant des organoïdes cérébraux dérivés de l’iPSC pour étudier les maladies mitochondriales commencent à découvrir les composants neurodéveloppementaux des maladies mitochondriales. 
Les organoïdes de la moelle épinière porteurs de mutations associées à la maladie mitochondriale, à l’encéphalopathie mitochondriale, à l’acidose lactique et au syndrome des épisodes ressemblant à des accidents vasculaires cérébraux (MELAS) ont montré une neurogenèse défectueuse et une différenciation retardée des motoneurones16. Les organoïdes corticaux dérivés de patients atteints de la maladie mitochondriale, le syndrome de Leigh, ont montré une taille réduite, des défauts dans la génération de bourgeons épithéliaux neuronaux et une perte de l’architecture corticale17. Les organoïdes cérébraux de patients atteints du syndrome de Leigh ont montré que les défauts de la maladie s’initient au niveau des cellules progénitrices neurales, qui ne peuvent pas s’engager dans le métabolisme mitochondrial, provoquant une ramification neuronale aberrante et une morphogenèse18. Ainsi, les progéniteurs neuronaux peuvent représenter une cible thérapeutique cellulaire pour les maladies mitochondriales, et les stratégies favorisant leur fonction mitochondriale peuvent soutenir le développement fonctionnel du système nerveux.
L’utilisation d’organoïdes cérébraux pourrait aider à découvrir les composants neurodéveloppementaux des maladies mitochondriales. Les maladies mitochondriales sont principalement considérées comme une neurodégénérescence précoce5. Cependant, des défauts neurodéveloppementaux sont également présents chez les patients atteints de maladies mitochondriales, notamment un retard de développement et des troubles cognitifs19. Les organoïdes cérébraux spécifiques au patient peuvent aider à traiter ces aspects et à élucider comment les maladies mitochondriales peuvent avoir un impact sur le développement du cerveau humain. Le dysfonctionnement mitochondrial pourrait également jouer un rôle pathogénétique dans d’autres maladies neurologiques plus courantes, telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington4. Par conséquent, élucider l’impact des défauts mitochondriaux dans le développement neurologique à l’aide d’organoïdes cérébraux pourrait également être déterminant pour l’étude de ces maladies. Cet article décrit un protocole détaillé pour générer des organoïdes cérébraux reproductibles qui peuvent être utilisés pour effectuer la modélisation des maladies mitochondriales.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Affinity Designer</td><td>Serif (Europe) Ltd</td><td></td><td>Logiciel de mise en page ; Éditeur de graphiques vectoriels</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 âne anti-cochon d’Inde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SAB4600033-250UL</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 âne anti-souris</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-31571</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Antimycine A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1397-94-0</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&beta ;-Tubuline III (TUJ-1)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8578</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Laser Argon</td><td>Melles Griot</td><td></td><td>Tout autre laser, par exemple, les lasers à diode émettant 488 est très bien, aussi</td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Sigma</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>B-27 avec vitamine A</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>3 % dans PBS, stocker la solution à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-0811</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>Culture cellulaire étoile 6 plaque à 6 puits</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Concentré de lipides chimiquement définis</td><td>Gibco</td><td>11905031</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal à balayage laser C1</td><td>Nikon Microscope</td><td></td><td>confocal modulaire système</td></tr><tr><td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Matrice de membrane basale, sans rouge de phénol, sans LDEV</td> Composant <td>de la</td><td>matrice</td><td>Corning</td> 356231</tr><tr><td>CyQUANT Kit de dosage de la prolifération cellulaire</td><td>Thermo Fisher</td><td>C7026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>31330038</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2660-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Âne anti-chèvre Cy3</td><td>Merck Millipore</td><td>AP180C</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Âne anti-souris Cy3</td><td>Merck Millipore</td><td>AP192C</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Âne anti-lapin Cy3</td><td>Merck Millipore</td><td>AP182C</td><td>1:300</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DS-Q1Mc Appareil photo</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 90i Microscope droit à grand champ</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope droit Eclipse E 600FN</td> Solutions de <td>microscope</td><td></td><td></td>Nikon</tr><tr><td>Microscope inversé Eclipse Ts2</td> Solutions <td>Microsope Nikon EZ-C1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silver Version 3.91</td><td>Solutions de microscope</td><td></td> Nikon <td>Logiciel d’imagerie pour microscope confocal</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>370-86-5</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de bovin fœtal</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-291</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow MEM</td><td>Gibco</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>Pipette en verre Pasteur</td><td>Marque</td><td>747715</td><td>Inverted</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Laser hélium-néon</td><td>Melles Griot</td><td></td><td>Un laser sur deux, par exemple les lasers à diode émettant 594 est bien, aussi</td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Merck</td><td>H3149-25KU</td><td></td></tr><tr><td>HERACell 240i CO2 Incubateur</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1:2500</td></tr><tr><td>Image J 1.53c</td><td>Wayne Rasband National Institute of Health</td><td></td><td>Logiciel de traitement d’images</td></tr><tr><td>Injekt Solo 10 mL/ Luer</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td></td><td>Gibco</td> 10828010 <td></td></tr><tr><td>Laser (407 nm)</td><td>Cohérent</td><td></td><td>Tout autre laser, par exemple les lasers à diode émettant 407 est très bien, aussi</td></tr><tr><td>Map2</td><td>Synaptic Systems</td><td>No. 188004</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Maxisafe 2030i</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>Stemcell Technology</td><td>85850</td><td>iPSC medium</td></tr><tr><td>Multifuge X3R Centrifugeuse</td><td>Thermo Scientific</td><td>10325804</td><td></td></tr><tr><td>MycoAlert Kit de détection de mycoplasmes</td><td>Lonza</td><td># LT07-218</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille à usage unique (23G x 1" TW)</td><td>Neoject</td><td>10016</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Aadvanced Research 3.2</td><td>Logiciel d’imagerie</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycin A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010</td><td>Heidolph</td><td>543-12310-00</td><td></td></tr><tr><td>PAP Pen</td><td>Sigma</td><td>Z377821-1EA</td><td>Pour dessiner une barrière hydrophobe sur des lames.</td></tr><tr><td>Kit de système de dissociation de la papaïne</td><td>Worthington</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Merck</td><td>818715</td><td>4 % dans le PBS, solution de magasin à -20 &deg ; C</td></tr><tr><td>Pipette Pasteur 7mL</td><td>VWR</td><td>612-1681</td><td>Graduée jusqu’à 3 mL</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2&nbsp ; &infin ;/0.17 WD 1.0</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>Microscope sec</td></tr><tr><td>Objectif Plan Apo VC 60x / 1.40 huile DIC N2 &infin ;/0.17 WD 0.13</td><td>Solutions de microscope</td><td></td> <td>NikonMicroscope à immersion dans l’huile Objectif Boîte</td></tr> de <tr><td>Pétri en polystyrène (100 mm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664161</td><td></td></tr><tr><td>Tube à fond rond en polystyrène avec capuchon de crépine (5 mL)</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Glass Antifade Moutant</td><td>Invitrogen</td><td>P36980</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre qualitatif</td><td>VWR</td><td>516-0813</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de roche</td><td>Merck</td><td>SCM075</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>83-794</td><td></td></tr><tr><td>S100&beta ;</td><td>Abcam</td><td>Ab11178</td><td>1:600</td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>13031</td><td></td></tr><tr><td>Lames de scalpel</td><td>Heinz Herenz Hamburq</td><td>1110918</td><td></td></tr><tr><td>SMI312</td><td>Biolegend</td><td>837904</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Merck/Sigma</td><td>31437-1kg-M</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Roth</td><td>3957</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate de dihydrogène</td><td>Applichem</td><td>131965</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>SOX2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-17320</td><td>1:100</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Réactif de dissociation cellulaire</td><td>Gibco/StemPro</td><td>A1110501</td><td>Réactif A</td></tr><tr><td>Super Glue Gel</td><td>UHU</td><td>63261</td><td>Gel adhésif</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>VWR</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>Seringue à usage unique (1 mL)</td><td>BD Plastipak</td><td>300015</td><td></td></tr><tr><td>TB2 Thermoblock</td><td>Biometra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC Plate 24 Well</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>TC Plate 6 Well</td><td>Sarstedt</td><td>83.392</td><td></td></tr><tr><td>TGFbeta3</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-007</td><td></td></tr><tr><td>Capot</td> <td>de culture tissulaireThermoFisher</td><td>51032711</td><td></td></tr><tr><td>TOM20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-11415</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Merck</td><td>X100-5ML</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome Microm HM 650 V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Production terminé, tout autre microtome réglable convient également.</td></tr><tr><td>Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade</td><td>Wilkinson Sword</td><td>70517470</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Benchkote</td><td>Merck/Sigma</td><td>28418852</td><td></td></tr><tr><td>Wnt Antagonist I</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>3378738</td><td></td></tr><tr><td>XF 96 analyseur de flux extracellulaire</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100737-101</td><td></td></tr><tr><td>XF Assay DMEM Medium</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>103680-100</td><td></td></tr><tr><td>Solution de calibrage XF</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>XFe96 FluxPak (microplaque à 96 puits)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr></tbody></table>

génération d’organoïdes cérébraux humains pour la modélisation des maladies mitochondriales

Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling

Les maladies mitochondriales représentent la plus grande classe d’erreurs innées du métabolisme et sont actuellement incurables. Ces maladies provoquent des anomalies neurodéveloppementales dont les mécanismes sous-jacents restent à élucider. Un obstacle majeur est le manque de modèles efficaces récapitulant la déficience neuronale précoce observée chez les patients. Les progrès de la technologie des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) permettent la génération d’organoïdes cérébraux tridimensionnels (3D) qui peuvent être utilisés pour étudier l’impact des maladies sur le développement et l’organisation du système nerveux. Les chercheurs, y compris ces auteurs, ont récemment introduit des organoïdes cérébraux humains pour modéliser les troubles mitochondriaux. Cet article présente un protocole détaillé pour la génération robuste d’organoïdes cérébraux humains dérivés de l’iPSC et leur utilisation dans le profilage bioénergétique mitochondrial et les analyses d’imagerie. Ces expériences permettront l’utilisation d’organoïdes cérébraux pour étudier les dysfonctionnements métaboliques et développementaux et peuvent fournir des informations cruciales pour disséquer la pathologie neuronale des maladies mitochondriales.

Le protocole décrit ici facilite la génération robuste d’organoïdes ronds (Figure 1A). Les organoïdes générés contiennent des neurones matures qui peuvent être visualisés à l’aide de marqueurs protéiques spécifiques aux axones (SMI312) et aux dendrites (protéine 2 associée aux microtubules (MAP2)) (Figure 1B).. Les organoïdes matures contiennent non seulement des cellules neuronales (MAP2-positives), mais aussi ...

Nous décrivons un protocole détaillé pour la génération d’organoïdes cérébraux dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme et leur utilisation dans la modélisation des maladies mitochondriales.

Génération d’organoïdes cérébraux humains pour la modélisation des maladies mitochondriales

Mitochondrial diseases represent the largest class of inborn errors of metabolism and are currently incurable. These diseases cause neurodevelopmental ...

Ce protocole vise à utiliser des organoïdes cérébraux pour étudier les maladies mitochondriales. Il a été développé pour générer des organoïdes cérébraux reproductibles dans l’évaluation de leurs propriétés mitochondriales. Cette méthode ne nécessite pas de bioréacteurs coûteux et de procédures d’intégration fastidieuses.Par conséquent, il est facile à mettre en œuvre et à mettre à l’échelle. Ce protocole permet de générer des organoïdes cérébraux reproductibles et de tester leurs propriétés mitochondriales. Cela peut conduire à l’identification de cibles interventionnelles pour les maladies mitochondriales incurables.Pour commencer, cultivez des CSPi humaines dans des conditions sans mangeoire dans un milieu iPSC sur des plaques revêtues de six puits et conservez-les dans un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 degrés Celsius et à 5% de dioxyde de carbone. Passage des CSPi à 80% de confluence en utilisant un milieu de détachement sans enzyme dans des rapports allant de un par quatre à un par 12. Pour augmenter la survie cellulaire, ajoutez 10 micromolaires rho-associated protein kinase ou inhibiteur de ROCK après chaque fractionnement.Dissocier les 80% iPSC au jour zéro. Préparez le milieu de différenciation corticale un ou CDM1 et préchauffez-le à température ambiante avant de l’ajouter aux cellules. Lavez les puits contenant les CSPi avec du PBS pour éliminer les cellules mortes et les débris.Ajouter 500 microlitres de réactif A préchauffé à chaque puits et incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Vérifiez au microscope pour vous assurer du détachement des cellules. Ajouter un millilitre de milieu iPSC pour diluer le réactif A afin de neutraliser son activité.Utilisez une pipette de 1 000 microlitres pour dissocier les cellules en les canalisant de haut en bas et transférez la suspension de la cellule dans un tube centrifuge de 15 millilitres. Centrifugez doucement les cSPi à 125 fois G pendant cinq minutes à température ambiante, puis aspirez soigneusement le surnageant pour éviter de perturber la pastille cellulaire. Remettez en suspension la pastille avec un millilitre de CDM1 pour obtenir une suspension à cellule unique et compter le nombre de cellules.Préparer le milieu d’ensemencement avec 9 000 cSPi pour 100 microlitres dans le MDP1 complété par 20 inhibiteurs micromolaires de ROCK, trois inhibiteurs micromolaires de la caténine WNT ou IWR-1 et cinq micromolaires SB-431542. Ajouter 100 microlitres de milieu d’ensemencement par puits à une plaque inférieure de 96 puits en V. Conservez la plaque dans un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 degrés Celsius et à 5% de dioxyde de carbone.Pour générer des neurosphères, le premier jour, observez que des agrégats de cellules rondes avec des bordures lisses définies se forment. Notez les cellules mortes autour des agrégats. Continuer à cultiver dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Le troisième jour, agitez la plaque en tapotant sur les côtés trois fois pour détacher les cellules mortes, puis ajoutez 100 microlitres de CDM1 complétés par 20 inhibiteurs micromolaires de ROCK, trois micromolaires IWR-1 et cinq micromolaires SB-431542 à chaque puits. Gardez la plaque à l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le sixième jour, retirez soigneusement 80 microlitres du milieu surnageant de chaque puits.Évitez de toucher le fond du puits. Ajouter 100 microlitres de CDM1 complétés par trois micromolaires IWR-1 et cinq micromolaires SB-431542 à chaque puits et incuber la plaque. Répétez l’étape précédente tous les trois jours jusqu’au jour 18.Le jour 18, pour transférer des neurosphères, préparez le CDM2 et ajoutez 10 millilitres à une plaque de culture cellulaire ultra faible de 100 millimètres. Utilisez une pipette de 200 microlitres avec la pointe coupée pour transférer les neurosphères rondes de la plaque de 96 puits à la plaque de culture cellulaire ultra faible de 100 millimètres. Retirer cinq millilitres de milieu de la plaque contenant les neurosphères et ajouter cinq millilitres de CDM2 frais.Placez la plaque sur un agitateur orbital à 70 rotations par minute à l’intérieur d’un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Tous les trois jours, aspirez soigneusement le milieu surnageant et remplacez-le par du CDM2 frais. Laissez une petite quantité du milieu pour empêcher les neurosphères de se dessécher.Le jour 35, préparez le MDP3. Aspirer le milieu de la plaque et ajouter 10 millilitres de CDM3 froid. Après avoir changé le milieu, replacez la plaque sur un agitateur orbital à 70 rotations par minute à l’intérieur d’un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Changez le milieu tous les trois à cinq jours en fonction du taux de croissance indiqué par la couleur du milieu. Le jour 70, préparez le MDP4. Utilisez le milieu CDM4 jusqu’à ce que l’âge souhaité des organoïdes soit atteint.Pendant cette période, maintenez la plaque sur un agitateur orbital réglé à 70 rotations par minute à l’intérieur d’un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Changez le milieu tous les trois à cinq jours en fonction du taux de croissance. Préparez une solution de PFA à 4 % et placez-la sous une hotte de sécurité.Recueillez les organoïdes cérébraux et transférez-les doucement avec une pipette Pasteur en plastique émoussée de trois millilitres dans une plaque de six puits remplie de PFA. Conservez les organoïdes dans la solution de PFA pendant une heure à température ambiante. Retirez soigneusement le PFA avec une pipette Pasteur en plastique de trois millilitres et lavez les organoïdes fixes trois fois à l’aide de PBS.Conservez les organoïdes fixes à quatre degrés Celsius dans pbS jusqu’à ce qu’ils soient utilisés ultérieurement. Les organoïdes générés à l’aide de ce protocole contiennent des neurones matures qui peuvent être visualisés à l’aide de marqueurs protéiques spécifiques aux axones et aux dendrites. Les organoïdes matures contiennent non seulement des cellules neuronales, mais aussi des cellules gliales.En utilisant l’analyse des organoïdes cérébraux tranchés, il est possible de surveiller les axones positifs SMI 312 et les dendrites positives MAP2 ou les cellules gliales bêta S100. De plus, les images confocales aident à étudier la distribution détaillée et l’organisation des progéniteurs neuronaux SOX2 positifs en ce qui concerne les neurones positifs à la tubuline bêta-3. Les organoïdes cérébraux ont été colorés pour des marqueurs spécifiques aux mitochondries, tels que la translocase de la membrane externe ou TOM20.Le profilage bioénergétique des organoïdes cérébraux a été réalisé en mesurant à la fois les métabolismes mitochondriaux à l’aide du taux de consommation d’oxygène, ou OCR, et le métabolisme glycolytique à l’aide du taux d’acidification extracellulaire, ou ECAR. L’oligomycine provoque une baisse du profil OCR et identifie donc l’OCR nécessaire à la production d’ATP. Lors du traitement à l’oligomycine, il peut également y avoir une augmentation compensatoire de l’ECAR, ce qui suggère que les cellules peuvent réguler à la hausse la glycolyse pour prévenir le stress métabolique.Lors du transfert des neurosphères de la plaque de 96 puits vers une plaque de culture ou pendant la procédure de fixation, il est crucial de manipuler les organoïdes en douceur pour éviter de les endommager. Après la génération d’organoïdes cérébraux, l’imagerie multi-électrodes ou l’imagerie calcique seraient des méthodes idéales pour tester la fonctionnalité des organoïdes.

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Génération d’organoïdes cérébraux humains pour la modélisation des maladies mitochondriales

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