Détermination analytique de la fonction mitochondriale des homogénats tumoraux solides excisés

Ce protocole décrit une méthode simple et rapide pour mesurer la fonction mitochondriale tumorale. Le protocole est largement applicable à l’oncologie translationnelle clinique et aidera à améliorer l’interprétation diagnostique et mécaniste du rôle des mitochondries dans l’apparition et la progression du cancer. Le principal avantage de cette technique est l’application de l’homogénéisation tissulaire pour simplifier la préparation et maximiser le rendement des mitochondries tout en atténuant les limites de la diffusion.

Cette technique offre des applications potentielles dans les contextes cliniques et diagnostiques avec une évaluation quantitative de la fonction mitochondriale tumorale à l’aide de tissu tumoral fraîchement biopsié ou excisé. Commencez par placer un homogénéisateur en verre contenant un millilitre de milieu respiratoire mitochondrial, ou MiR05, dans un pilon en verre bien ajusté sur de la glace humide. Placez le tissu dans un millilitre de solution de préservation de biopsie, ou BIOPS, dans une boîte de Petri glacée.

Coupez la tumeur en petits morceaux d’environ 5 à 10 milligrammes chacun et replacez les morceaux de tumeur restants dans 10 millilitres de BIOPS conservés sur la glace. Après avoir soigneusement tamponné les sections de tissu sur un papier filtre, placez-les sur un petit bateau de pesage goudronné en plastique et enregistrez le poids humide initial. Replacez les pièces inutilisées dans le tube conique de 10 millilitres de BIOPS pour une conservation continue.

Immergez les sections de tissus dans un homogénéisateur glacé contenant du MiR05 et enregistrez le poids restant sur le bateau de pesée. À l’aide d’un pilon en verre avec une plage de clairance de 0,09 à 0,16 millimètre, perturbez doucement le tissu tumoral en effectuant cinq à sept coups vers le bas et vers le haut. Pour chaque coup, faites pivoter le pilon dans le sens des aiguilles d’une montre / dans le sens inverse des aiguilles d’une montre trois fois tout en poussant le pilon vers le bas, et trois fois supplémentaires tout en tirant le pilon vers le haut.

Laissez le tissu se déposer au fond de l’homogénéisateur entre les coups, mais évitez d’amener le pilon complètement au-dessus du volume de liquide pour éviter la formation de mousse. Versez l’homogénat dans un tube conique de 15 millilitres et placez-le sur de la glace. Pipette un à trois millilitres de MiR05 frais sur le pilon et dans l’homogénéisateur pour laver tout homogénat de tissu restant.

Versez le lavage MiR05 dans le tube conique contenant l’homogénat. Répétez cette étape deux à trois fois pour assurer le transfert complet de l’homogénat. Pour calculer avec précision la concentration d’homogénat tissulaire, inspectez soigneusement l’homogénéisateur et l’homogénat pour le reste de matériel non homogénéisé, qui comprend le tissu conjonctif.

Pour retirer le matériau non homogénéisé de l’homogénéisateur qui ne peut pas être atteint avec une pince à épiler, après avoir ajouté MiR05 à l’homogénéisateur, aspirer le volume, y compris le tissu, avec une pipette et déplacer le contenu dans une boîte de Pétri. Retirez le matériau non homogénéisé déposé en gros morceaux au fond du tube conique de l’homogénat en les aspirant avec une pipette et placez-les sur le capuchon du tube conique. Retirez le tissu de la boîte de Petri ou du bouchon du tube conique avec une pince à épiler et épongez-le sur du papier filtre.

Ajouter l’homogénat restant du capuchon du tube conique dans le tube conique. Boucher le tube, puis inverser pour mélanger. Réinspectez les homogénéisateurs et l’homogénéat pour tout matériau non homogénéisé supplémentaire, et répétez les étapes pour éliminer le matériau non homogénéisé si nécessaire.

Peser et enregistrer la masse du matériau non homogénéisé récupéré de l’homogénéisateur. Inspectez la préparation de l’homogénat pour tout tissu grossièrement intact transféré, retirez les pièces non homogénéisées et pesez-les au besoin. Soustrayez le poids tissulaire récupéré du bateau de pesée, de l’homogénéisateur et de l’homogénat du poids humide initial pour calculer le poids final de l’échantillon.

En utilisant le poids final de l’échantillon, ajoutez du MiR05 supplémentaire pour amener l’homogénat à la concentration souhaitée. Une fois l’homogénat pesé et préparé, procédez au dosage dès que possible. Conservez l’échantillon sur de la glace humide jusqu’à ce qu’il soit transféré à l’instrument.

Une fois l’instrument étalonné et l’échantillon préparé, retirez les bouchons avec un mouvement de torsion et aspirez le MiR05 des chambres, en évitant la membrane exposée à l’intérieur de la chambre. Mélangez bien l’homogénat et ajoutez 2,25 millilitres de l’homogénat à la chambre. Supposons qu’un homogénat soit ajouté à plusieurs chambres, pipette un millilitre de l’homogénat à la fois dans chaque chambre tout en mélangeant l’homogénat pour assurer une distribution tissulaire égale.

Cliquez sur F4 pour nommer et horodater l’événement, puis cliquez sur OK. Remplissez une seringue de 50 millilitres avec de l’oxygène provenant d’un réservoir d’oxygène avec un régulateur et un tube à gaz à l’aide d’une aiguille émoussée de calibre 18. Injectez l’oxygène directement dans les chambres pour les hyperoxygéner en environ 500 micromolaires d’oxygène.

Insérez lâchement les bouchons et attendez de fermer jusqu’à ce que l’oxygène atteigne environ 480 micromolaires. Avec un mouvement de torsion, fermez lentement la chambre et laissez la respiration s’équilibrer pendant environ 15 à 20 minutes. Remplissez le capillaire central du bouchon avec MiR05 si nécessaire.

Utilisez des microsyringes dédiées pour injecter des substrats, des découpleurs et des inhibiteurs dans des chambres entièrement fermées afin de nommer et d’horodater les événements pour chaque chambre en temps réel. Sélectionnez F6 pour ajuster la concentration en oxygène et les échelles négatives de pente d’oxygène au besoin. Après chaque injection, lavez la seringue trois fois dans de l’eau pour les composés solubles dans l’eau et à 70% d’éthanol pour les composés dissous à l’éthanol.

Ajouter cinq microlitres de malate 0,8 molaire et procéder immédiatement à l’injection suivante. Lavez la seringue d’injection trois fois dans de l’eau. Ajoutez immédiatement cinq microlitres de pyruvate 1 molaire et attendez que la respiration se stabilise.

Après avoir lavé la seringue, ajoutez 10 microlitres d’ADP à 0,5 molaire et attendez que la réponse aDP se stabilise. Lavez la seringue et ajoutez cinq microlitres de glutamate 2 molaires et attendez que la respiration se stabilise. Lavez la seringue, puis ajoutez cinq microlitres de cytochrome-C de 4 millimolaires et attendez que la respiration se stabilise.

Après avoir lavé la seringue, ajoutez 20 microlitres de succinate 1 molaire et attendez que la respiration se stabilise. Titrer des incréments de 0,5 à 1 microlitre de FCCP de 1 millimolaire et attendre que la respiration se stabilise après chaque injection. Continuez jusqu’à ce qu’il n’y ait pas d’augmentation supplémentaire de la respiration.

Lavez la seringue d’injection trois fois dans de l’éthanol à 70 %. Ajouter deux microlitres de roténone 150 micromolaires et attendre que la respiration se stabilise. Ajoutez un autre microlitre de roténone pour vous assurer qu’il n’y a plus d’inhibition.

S’il y a une diminution de la respiration, continuez avec des injections supplémentaires jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de diminution de la respiration, puis lavez la seringue d’injection trois fois dans de l’éthanol à 70%. Ajouter deux microlitres d’antimycine A de 125 micromolaires et attendre que la respiration se stabilise. Ajouter un autre microlitre d’antimycine A pour s’assurer qu’il n’y a plus d’inhibition.

S’il y a une diminution de la respiration, continuez avec des injections supplémentaires jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de diminution de la respiration. Lavez la seringue trois fois avec de l’éthanol à 70%. Vérifiez la concentration en oxygène de la chambre.

Si la concentration est inférieure à 125 micromolaires, réoxygéner dans l’air ambiant ou hyperoxygéner légèrement pour s’assurer que l’oxygène ne limite pas le flux respiratoire. Ajouter cinq microlitres d’ascorbate 0,8 molaire. Lavez la seringue trois fois dans de l’éthanol à 70 %.

Ajoutez immédiatement 10 microlitres de TMPD 0,2 molaire et attendez une augmentation de la respiration. Après avoir lavé la seringue avec de l’éthanol, ajoutez 25 microlitres d’azoture de sodium à 4 molaires immédiatement lorsque le flux respiratoire de l’ascorbate TMPD plafonne. Terminez le en cliquant sur Fichier, Enregistrer et déconnecter.

Il a été observé que 40 milligrammes par millilitre d’homogénat tissulaire entraînaient un épuisement rapide de l’oxygène. La consommation d’oxygène a considérablement ralenti avec 30 et 20 milligrammes par millilitre d’homogénat tissulaire, mais a tout de même diminué rapidement en peu de temps en l’absence de substrats ou d’ADP. La concentration de 10 milligrammes par millilitre d’homogénat tissulaire a entraîné un taux de consommation d’oxygène optimal.

Un protocole SUIT a été utilisé pour évaluer la phosphorylation oxydative liée au NADH et au succinate et le transfert d’électrons, ainsi que l’activité du complexe IV. La libération de cytochrome C a été évaluée en présence de pyruvate et de malate, ou de succinate et de roténone, qui ont tous deux révélé que la préparation de l’homogénat n’endommageait pas les mitochondries. Il a également été constaté que la phosphorylation oxydative liée au NADH était négligeable dans les tumeurs EO771.

Le titrage du FCCP pour conduire le flux maximal d’électrons a révélé que dans les tumeurs EO771, la phosphorylation, plutôt que l’oxydation, se limitait à la respiration. Les profils respiratoires homogénés de la tumeur étaient similaires à ceux des cellules EO771 non implantées et perméabilisées par la digitonine, à l’exception d’un transfert d’électrons maximal diminué soutenu par des substrats liés à N et S dans la tumeur. La cinétique respiratoire du succinate a ensuite été évaluée par des titrages progressifs de l’ADP sous-saturé jusqu’à ce que le taux maximal soit atteint.

La concentration demi-maximale d’ADP en présence de succinate et de roténone était de 37,5 micromolaires, tandis que le taux maximal était d’environ 10,5 picomoles par seconde, par milligramme. Les instruments mis en place dans les soins de routine, ainsi que la manipulation des tissus, sont d’une importance cruciale pour le succès de ces expériences. En suivant ces procédures, d’autres approches spécifiques à la masse ou aux marqueurs de normalisation des taux peuvent être appliquées en fonction de la question de l’intérêt.

Les mesures courantes comprennent la quantification des protéines totales et l’activité enzymatique de la citrate synthase, mais varient en fonction du système de modèle, de la conception statistique et de la question de recherche.