Name: Production à l’échelle sans cellules et ajout d’adjuvant à une protéine recombinante de la membrane externe majeure de Chlamydia muridarum pour le développement d’un vaccin (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Découvrez la production d'antigènes de protéines membranaires par expression sans cellule dans des nanodiscs lipidiques. Cette méthode évolutive facilite le développement de vaccins subunitaires avec adjuvants.

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Ce travail a été soutenu par la subvention R21 AI20925 et U19 AI144184 du Service de santé publique de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses. Ces travaux ont été réalisés sous les auspices du département de l’Énergie des États-Unis par le Lawrence Livermore National Laboratory dans le cadre du contrat DE-AC52-07NA27344 [LLNL-JRNL-822525, LLNL-VIDEO-832788].

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents connus ou de relations personnelles qui auraient pu sembler influencer le travail rapporté dans cet article.

La chlamydia est l’infection sexuellement transmissible la plus courante qui touche les hommes et les femmes. Bien que la recherche sur les vaccins contre la chlamydia s’étende sur des décennies, un vaccin sûr et efficace pouvant être mis à l’échelle de la production de masse est resté insaisissable13. Le MOMP chlamydia est considéré comme le principal candidat en tant qu’antigène vaccinal protecteur; cependant, MOMP est très hydrophobe et sujet à un pliage incorrect14,15. D’autres études ont révélé que le MOMP existe dans des états oligomères essentiels à son immunogénicité11. Détaillé ici est une méthode de co-expression validée et sans cellules qui produit un MOMP oligomère formé dans une nanoparticule tNLP en tant que vaccin, avec des rendements d’environ 1,5 mg de MOMP purifié par 3 ml de lysat. Cette procédure entièrement collationnée peut être mise à l’échelle pour la production industrielle, ce qui augmente ses perspectives en tant qu’approche utile pour la génération de vaccins.
Nous avons déjà publié sur l’utilisation de l’expression acellulaire pour produire des protéines membranaires intégrées dans les PNL 3,16, ainsi que l’expression dans des disques stabilisés par les télodendrimères. Cependant, cette dernière technique a produit des particules membrane-protéine avec une plus grande hétérogénéité et une solubilité plus faible. 4 De plus, l’immunogénicité des particules MOMP-télodendrimères n’est pas claire par rapport aux particules MOMP-tNLP6.
Cette procédure peut être adaptée pour intensifier l’expression des protéines membranaires bactériennes qui sont des candidats prometteurs en tant qu’antigènes pour une utilisation dans les vaccins sous-unitaires. Non seulement cette procédure produit une protéine membranaire bactérienne solubilisée, mais la structure globale des nanoparticules est susceptible d’être modifiée à l’aide d’une variété d’adjuvants vaccinaux lipophiles, y compris, mais sans s’y limiter, le CpG conjugué à une fraction cholestérol ou FSL-1. L’expression d’autres antigènes candidats à partir de bactéries est possible, bien que des paramètres tels que la température d’expression, le choix des lipides et le type de système d’expression puissent devoir être explorés pour obtenir des rendements optimaux.
De plus, le choix et le rapport plasmidique sont essentiels dans ce processus. Les deux plasmides utilisés doivent être construits à partir de la même colonne vertébrale. Si les inserts ont approximativement la même longueur, les rapports peuvent être basés sur la masse du plasmide ajouté, comme décrit ici. Cependant, le ratio basé sur les taupes donnera des résultats plus reproductibles, en particulier lors de la mise à l’échelle des réactions. Les rapports qui fonctionnent bien dans les réactions à l’échelle du crible (< 0,5 mL) peuvent ne pas être applicables aux réactions plus importantes et peuvent nécessiter une optimisation supplémentaire. Les protéines non membranaires peuvent toujours être exprimées à l’aide de kits acellulaires, mais peuvent ne pas nécessiter la nanoparticule lipidique (co-expression) pour produire un produit soluble. De plus, bien que ce protocole décrive l’adjuvant avec CpG et FSL-1, ce système se prête à la formulation avec d’autres adjuvants lipophiles ou au mélange avec des adjuvants solubles selon les besoins.
Il est essentiel d’éviter la contamination lors de la mise en place de la réaction d’expression acellulaire car cela peut affecter les rendements. Tous les additifs à la réaction, y compris les plasmides eux-mêmes, doivent être très purs. De plus, les protéines exprimées ne doivent être en contact qu’avec des matériaux et des solutions exempts de contamination par les endotoxines. La contamination par les endotoxines dans les formulations candidates peut entraîner des résultats incohérents et fallacieux des tests immunologiques et peut être nocive en quantités suffisantes. Bien que cela ne soit pas décrit ici, une purification supplémentaire après chromatographie d’affinité au nickel peut être nécessaire si de nombreux contaminants sont observés lors d’étapes d’analyse ultérieures, telles que SDS-PAGE. Cela pourrait être accompli avec la SEC, bien que les conditions puissent nécessiter une optimisation formulation par formulation.

Les lysats procaryotes ou eucaryotes pour l’expression cellulaire de protéines sont facilement disponibles en tant que produits commerciaux pour synthétiser des protéines d’intérêt (pour une revue complète, voir 1). Ces systèmes d’expression sont disponibles à différentes échelles et utilisent des lysats de divers organismes, y compris E. coli, les plants de tabac et les cultures de mammifères. Les lysats acellulaires offrent de multiples avantages par rapport aux approches traditionnelles de production de protéines recombinantes, notamment la facilité d’utilisation et la production robuste et rapide de protéines. Bien que ces approches soient principalement utilisées pour produire des protéines solubles, ce groupe a mis au point une approche pour leur utilisation pour exprimer les protéines membranaires.
Cette nouvelle approche apporte des modifications mineures aux systèmes d’expression acellulaires existants en incluant de l’ADN codant pour deux produits protéiques pour l’expression, une apolipoprotéine et la protéine membranaire d’intérêt. L’apolipoprotéine exprimée (dérivés de l’ApoA1 ou de l’ApoE4) interagit avec les lipides ajoutés au lysat acellulaire pour assembler spontanément (~20 nm) les PNL. Lorsqu’ils sont co-traduits avec une protéine membranaire d’intérêt, la protéine NLP et la protéine membranaire forment un complexe de nanoparticules solubles dans lequel la protéine membranaire est intégrée dans la bicouche lipidique NLP. Ainsi, la protéine membranaire est plus accessible pour les applications en aval, car elle est contenue dans des particules solubles et discrètes. Cette approche peut produire des complexes protéiques oligomères fonctionnels dans la bicouche2 NLP et peut produire le composant antigénique d’un vaccin sous-unitaire, qui est ensuite mélangé avec des adjuvants lipophiles pour former un vaccin à nanoparticules comportant un antigène colocalisé et un adjuvant adapté à l’évaluation in vivo .
Cette méthode actuelle est modifiée à partir d’un protocole3 précédemment publié. Les modifications clés sont axées sur la mise à l’échelle de la réaction acellulaire et la purification ultérieure du complexe protéique-NLP. Une autre modification comprend l’ajout d’un polymère amphiphile connu sous le nom de télodendrimère, qui est d’abord mélangé avec les lipides avant d’être ajouté à la réaction acellulaire. La co-traduction des plasmides en présence du télodendrimère et des lipides produit un NLP télodendrimère (tNLP). L’ajout du télodendrimère permet également de moduler la taille et la monodispersité des nanoparticules de tNLPrésultantes 4. Ce protocole est spécifiquement optimisé pour les études vaccinales à grande échelle afin de produire une protéine d’antigène sous-unitaire liée à la membrane, chlamydia MOMP 5,6. La méthode produit un MOMP recombinant associé à la TNLP pour former un complexe MOMP-tNLP hautement soluble qui conserve l’oligomérisation de MUT. Une production typique de 3 ml à l’échelle donne >1,5 mg de MOMP purifié. Le MOMP-tNLP produit sans cellules se prête à une addition rapide d’adjuvant pour les tests d’immunogénicité in vivo.

<table><tbody><tr><td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) sous forme de poudre</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL de tubes à centrifuger sans endotoxines</td><td>Eppendorf</td><td>2600028</td><td></td></tr><tr><td>1 M Solution de chlorhydrate de Trizma</td><td>Millipore Sigma</td><td>T2194</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique, glacial, réactif ACS, &ge ; 99,7 %</td> <td>Appareil Millipore Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot Barrage</td> tampon <td>1706545</td><td></td><td>Bio-Rad</td></tr><tr><td>pour XCell SureLock</td><td>Life Technologies</td><td>EI0012</td><td></td></tr><tr><td>C24 Agitateur d’incubateur</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système d’expression acellulaire : RTS 500 ProteoMaster E. coli HY Kit</td><td>BiotechRabbit</td><td>BR1400201</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete His-Tag Purification Résine</td><td>Roche Molecular Diagnostics</td><td>5893682001</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, sans EDTA Cocktail d’inhibiteurs de protéase</td><td>Roche Molecular Diagnostics</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>CpG-ODN1826</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T9449</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Tréhalose dihydraté</td><td>Millipore Sigma</td><td>71509</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de dialyse D-Tube Dialyzer Maxi</td><td>Millipore Sigma</td><td>71508-3</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes jetables en polypropylène fritté Capacité de 10 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550EDU</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Millipore Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Électrophorèse Alimentation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cartouche Endosafe PTS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9594798</td><td></td></tr><tr><td>Endosafe-PTS Testing System</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution de lavage gel : 10 % de méthanol, 7 % d’acide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>acétique HCl et NaOH solutions pour Réglage du</td><td></td><td></td><td></td>pH</tr><tr><td>HPLC avec détecteur à barrettes de diodes UV-vis</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyClone HyPure Eau de culture</td><td>VWR</td><td>82007-328</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Système de transfert sec Life</td><td>Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 Piles de transfert, PVDF</td><td>Life Technologies</td><td>IB24001</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel Image Studio V2.0</td><td>Li-COR Biiosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Millipore Sigma</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Immun-Blot PVDF Membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>1620177</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey Fc imageur</td><td>Li-COR Biiosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td>Labconco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol (&ge ; 99.9 %)</td><td>Millipore Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Four à micro-ondes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One/OneC Microvolume Spectrophotomètre UV-Vis</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp ; ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4 à 12 %, Bis-Tris, 1,0 mm</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’échantillonnage NuPAGE LDS (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de fonctionnement NuPAGE MES SDS (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP000202</td><td></td></tr><tr><td>Agent réducteur d’échantillon NuPAGE (10x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de blocage Odyssey en TBS contenant 0,2 % Tween 20</td><td>Li-COR Biosciences</td><td>927-50000</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur</td><td></td><td></td><td></td>orbital</tr><tr><td>PBS-T (1x PBS, 0,2 % Tween 20, pH 7,4)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEG5K-CA8 Télodendrimère (produit de synthèse personnalisé)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vecteur pIVEX2.4d</td><td>Roche Molecular Diagnostics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps primaire : MAb40 (anticorps monoclonal au domaine variable 1 (VD1) de C. muridarum MOMP, laboratoire de la Maza)4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorps primaire : MAbHIS, anticorps Penta-His</td><td>Qiagen</td><td>34660</td><td></td></tr><tr><td>Sonde sonicatrice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluoromètre</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Protein Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q33212</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette Rainin : LTS 1000 &micro ; L</td><td>Rainin</td><td>17002428</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Pointes de pipette : LTS 20 & micro ; L</td><td>Rainin</td><td>17002429</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Pointes de pipette : LTS 200 & micro ; L</td><td>Rainin</td><td>17002426</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Pipettes</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire : IRDye 800CW chèvre (polyclonale) anti-souris IgG (lourdes et légères)</td><td>Li-COR Biosciences</td><td>926-32210</td><td></td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td><td>Life Technologies</td><td>LC5925</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium NaCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique NaH2PO4</td><td>Millipore Sigma</td><td>&nbsp ; S0751</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200, 5/150 GL colonne</td><td>Cytiva</td><td>GE28-9909-45</td><td></td></tr><tr><td>Lipoprotéine diacylée synthétique-TLR2/6 FSL-1</td><td>Invivogen</td><td>&nbsp ; tlrl-fsl</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Ruby Protein Gel Stain</td><td>Life Technologies</td><td>S12001</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr>Source <td></td><td></td><td></td><td>de lumière UV</td></tr><tr><td>Vacufuge Bench Top Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR 15 mL coniques (89039-666)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR 50 mL coniques (89039-656)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies)</td><td>Life Technologies</td><td>EI0001</td><td></td></tr></tbody></table>

production à l’échelle sans cellules et ajout d’adjuvant à une protéine recombinante de la membrane externe majeure de chlamydia muridarum pour le développement d’un vaccin

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

Les vaccins sous-unitaires offrent des avantages par rapport aux vaccins inactivés ou atténués plus traditionnels dérivés de cellules entières en termes d’innocuité, de stabilité et de fabrication standard. Pour obtenir un vaccin sous-unitaire à base de protéines efficace, l’antigène protéique doit souvent adopter une conformation de type natif. Ceci est particulièrement important pour les antigènes pathogènes de surface qui sont des protéines liées à la membrane. Des méthodes acellulaires ont été utilisées avec succès pour produire des protéines membranaires fonctionnelles correctement repliées grâce à la co-traduction de particules de nanolipoprotéines (PNL), communément appelées nanodisques. 
Cette stratégie peut être utilisée pour produire des vaccins sous-unitaires constitués de protéines membranaires dans un environnement lié aux lipides. Cependant, la production de protéines acellulaires est souvent limitée à petite échelle (<1 mL). La quantité de protéines produites en petites séries est généralement suffisante pour les études biochimiques et biophysiques. Cependant, le processus sans cellules doit être mis à l’échelle, optimisé et soigneusement testé pour obtenir suffisamment de protéines pour les études vaccinales sur des modèles animaux. D’autres processus impliqués dans la production de vaccins, tels que la purification, l’ajout d’adjuvants et la lyophilisation, doivent être optimisés en parallèle. Cet article rend compte de l’élaboration d’un protocole à grande échelle pour exprimer, purifier et formuler un vaccin sous-unitaire protéique lié à la membrane. 
Les réactions acellulaires à grande échelle nécessitent une optimisation des concentrations et des rapports plasmidiques lors de l’utilisation de vecteurs d’expression plasmidique multiples, de la sélection des lipides et de l’ajout d’adjuvants pour la production à haut niveau de particules de nanolipoprotéines formulées. La méthode est démontrée ici avec l’expression d’une protéine de membrane externe majeure (MOMP) chlamydiale mais peut être largement appliquée à d’autres antigènes de protéines membranaires. L’efficacité des antigènes peut être évaluée in vivo au moyen d’études d’immunisation pour mesurer la production d’anticorps, comme démontré ici.

Le profil SDS-PAGE de la purification par affinité Ni de MOMP-tNLP à partir d’une réaction sans cellules de 1 mL est illustré à la figure 1B. La réaction a entraîné des niveaux élevés d’expression pour le MOMP et la protéine Δ49ApoA1. Des résultats antérieurs ont montré que l’expression acellulaire de Δ49ApoA1 en présence de DMPC et de télodendrimère entraînait la formation de particules de nanolipoprotéines de télodendrimères (tNLP)4. La co-élution de MOMP avec Δ49ApoA1 a indiqué que MOMP est associé aux TNLP, car le His-tag n’est présent que sur l’échafaudage tNLP Δ49ApoA1 et non sur MOMP. MOMP est une protéine hautement insoluble qui ne peut être éluée que par complexation avec des tNLP, dont il a été démontré qu’elle facilite la solubilisation des protéines membranaires.
Les fractions d’élution contenant des MOMP-tNLP ont été regroupées et la concentration totale de protéines a été déterminée à l’aide d’un dispositif de quantification basé sur la fluorescence, ou d’un dispositif qui mesure la concentration par absorbance à 280 nm, en suivant les instructions du fabricant pour la quantification des protéines. Pour permettre un dosage précis du vaccin MOMP, il est également important de déterminer la concentration de MOMP dans les complexes purifiés. Nous avons développé une méthode pour quantifier le MOMP basée sur la densitométrie sur gel (Figure 2) dans laquelle un MOMP recombinant purifié avec une concentration connue a été utilisé comme norme. En établissant la courbe standard et en la comparant à l’échantillon MOMP-tNLP, la concentration de MOMP peut être quantifiée avec précision. La détermination de la concentration de MOMP dans l’échantillon purifié a permis d’estimer le rendement du MOMP dans les réactions acellulaires à différentes échelles, ce qui est important pour la planification de la configuration de la réaction appropriée aux études en aval (tableau 3).
MOMP doit former des oligomères pour provoquer une réponse immunitaire robuste11. Pour tester l’état oligomérique de MOMP, MOMP-tNLP a été analysé en présence et en absence de chaleur et de l’agent réducteur dithiothréitol (DTT, 50 mM, Figure 3A). Des oligomères d’ordre supérieur de MOMP ont été identifiés par SDS-PAGE lorsque les échantillons n’ont pas été traités par chaleur et DTT. En comparaison, les échantillons traités à la chaleur en présence de TNT présentaient principalement deux bandes distinctes sur le gel, correspondant au MOMP et au Δ49ApoA1 (environ 40 kDa et 22 kDa, respectivement). Ces résultats ressemblent beaucoup au modèle de bandes de gel attribué à la formation d’oligomères de MOMP, ce qui est essentiel à son efficacité.
Une analyse par transfert Western ultérieure utilisant MAb40, un anticorps dirigé contre l’épitope linéaire sur le domaine variable de la protéine MOMP, a montré un schéma de bandes similaire, confirmant la formation d’oligomères par la protéine MOMP dans son état non dénaturé (Figure 3B). Un facteur important ayant un impact sur la formation d’oligomères MOMP est le rapport entre le plasmide MOMP et le plasmide Δ49ApoA1 lors de la configuration de la réaction acellulaire. Le tableau 4 énumère le rapport des plasmides et le taux d’insertion de MOMP dans les TNLP. Des études antérieures ont indiqué que le MOMP chlamydia et d’autres protéines de la membrane externe peuvent exister principalement sous forme de trimères12. Pour maximiser la formation de trimères dans la réaction acellulaire, il est souhaitable d’avoir un taux d’insertion proche de trois protéines MOMP par NLP, ce qui correspond à un rapport plasmidique ~25:1 MOMP-to-Δ49ApoA1.
Un test par transfert de points a été utilisé comme méthode plus rationalisée pour détecter la présence de MOMP et de tNLP. L’anticorps MAb40 a été utilisé pour détecter le MOMP total. L’anticorps MAbHIS ciblant le marqueur His sur l’échafaudage Δ49ApoA1 de la TNLP a été utilisé pour évaluer la présence de tNLP. La co-signalisation des anticorps MAb40 et MAbHIS a indiqué la formation de MOMP-tNLP. La réaction de contrôle a produit une PNLT vide, qui n’a montré qu’un signal positif de MAbHIS (Figure 3C). Pour tester l’immunogénicité des MOMP-tNLP produites dans la réaction acellulaire, nous avons adjuvanté MOMP-tNLP avec CpG + FSL-1 et injecté par voie intramusculaire (i.m.) à des souris dans un régime prime-boost comme décrit ci-dessus. Des sérums ont été prélevés sur les souris immunisées, et les anticorps IgG spécifiques du MOMP ont été mesurés à l’aide d’un test Western blot (Figure 4). Les sérums de souris injectées avec adjuvanté MOMP-tNLP ont montré une forte liaison MOMP, indiquant que MOMP-tNLP pourrait provoquer une réponse immunitaire in vivo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig01.jpg"> Figure 1 : Expression et purification de MOMP-tNLP. (A) Image de tubes contenant de petites aliquotes d’une réaction acellulaire qui a exprimé avec succès des contrôles GFP éclairant sous source de lumière UV (à droite) par rapport à des lysats sans plasmide GFP (à gauche). (B) Le gel de protéines coloré avec SYPRO Ruby après SDS-PAGE montre le profil de purification de MOMP-tNLP. MOMP migre à 40 kDa et le 49ApoA1 migre à 22 kDa. Abréviations : MOMP = protéine de la membrane externe majeure chlamydiale; tNLP = particule de nanolipoprotéine télodendrimère; MOMP-tNLP = complexe MOMP-tNLP; GFP = plasmide fluorescent vert codant pour les protéines; MW = marqueur de poids moléculaire; T = lysat total acellulaire; FT = accréditive; R1-R3 = aliquotes de réaction acellulaire; W1, W6 = Lavages 1 et 6; E1-E7 = Élutions 1 à 7; Δ49ApoA1 = Dérivé ApoA1 de souris marqué. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig02.jpg"> Figure 2 : Quantification de MOMP dans des échantillons MOMP-tNLP. (A) Gel SDS-PAGE coloré avec SYPRO Ruby pour la quantification de MOMP. Le MOMP recombinant avec concentration connue a été chargé sur le gel pour obtenir la courbe standard. Chaque voie contenait 0,1 μg, 0,5 μg, 1,0 μg, 2,0 μg et 4,0 μg de MOMP. Les échantillons MOMP-tNLP quantifiés ont été chargés sur le même gel. (B) La courbe étalon de concentration MOMP a été générée par densitométrie. Une équation reliant la densité de bande normalisée et la quantité de MOMP a été établie. L’équation a été utilisée pour calculer la teneur en MOMP dans les échantillons inconnus. Abréviations : MOMP = protéine de la membrane externe majeure chlamydiale; tNLP = particule de nanolipoprotéine télodendrimère; MOMP-tNLP = complexe MOMP-tNLP; SDS-PAGE = électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium et de polyacrylamide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig03.jpg"> Figure 3 : La MOMP-tNLP produite sans cellules permet à MOMP de former des structures d’ordre supérieur. (A) Gel SDS-PAGE de MOMP-tNLP avec et sans traitement thermique et agent réducteur DTT, coloré au rubis SYPRO. Avec la chaleur et la TNT, MOMP est principalement apparu comme une bande monomère à ~40 kDa, car la chaleur et l’agent réducteur ont brisé la majorité de la structure MOMP d’ordre supérieur. En l’absence de chaleur et de TNT, les bandes d’ordre supérieur étaient présentes, indiquant une conformation d’oligomères MOMP. (B) Western blot de MOMP-tNLP et MOMP seul, non traité et traité à la chaleur et au DTT. Après transfert, la membrane a été sondée avec MAb40 (dilution 1:1 000). Un motif de bandes similaire au gel coloré SYPRO Ruby a été observé, confirmant que les bandes de poids moléculaire plus élevées étaient bien des oligomères MOMP. (C) Transfert de points d’échantillons MOMP-tNLP et tNLP vides (en double) sondés avec MAb40 et MAbHIS. Abréviations : MOMP = protéine de la membrane externe majeure chlamydiale; tNLP = particule de nanolipoprotéine télodendrimère; MOMP-tNLP = complexe MOMP-tNLP; SDS-PAGE = électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium polyacrylamide; DTT = dithiothreitol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63028/63028fig04.jpg"> Figure 4 : La MOMP-tNLP produite sans cellules est hautement immunogène. Le sérum de souris immunisées a montré un fort signal d’IgG anti-MOMP. L’adjuvant MOMP-tNLP avec CpG + FSL-1 a été utilisé pour immuniser les souris. Les sérums de six souris immunisées ont été collectés, regroupés et utilisés pour sonder MOMP-tNLP. Le sérum a pu se lier au MOMP lors d’un test Western blot et a montré un fort signal IgG (à gauche). Le transfert Western utilisant MAb40 comme anticorps primaire (à droite) a montré des bandes similaires, indiquant que le sérum contenait des IgG spécifiques de MOMP. Abréviations : MOMP = protéine de la membrane externe majeure chlamydiale; tNLP = particule de nanolipoprotéine télodendrimère; MOMP-tNLP = complexe MOMP-tNLP; CpG = adjuvant CpG modifié par le cholestérol; FSL-1 = adjuvant lipophile. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63028/63028fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nom de la mémoire tampon</td>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>NaCl</td>
			<td>Imidazole</td>
			<td>pH</td>
		</tr><tr><td>Tampon de liaison</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>300 mM</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>Tampon de lavage</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>300 mM</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>Tampon d’élution 1</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>300 mM</td>
			<td>250 mM</td>
			<td>8.0</td>
		</tr><tr><td>Tampon d’élution 2</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>300 mM</td>
			<td>500 mM</td>
			<td>8.0</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Liste des tampons nécessaires à la purification par affinité du nickel, détaillant les concentrations de chaque composant et le pH.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Duree</td>
			<td>50 min</td>
		</tr><tr><td>Débit</td>
			<td>6,0 mL/min</td>
		</tr><tr><td>Type de dégradé</td>
			<td>Binaire</td>
		</tr><tr><td>Tampon A</td>
			<td>10 mM TEAA en H20</td>
		</tr><tr><td>Tampon B</td>
			<td>MeCN</td>
		</tr><tr><td>Pente</td>
			<td>% Tampon B</td>
		</tr><tr><td>0 min</td>
			<td>25%</td>
		</tr><tr><td>30 min</td>
			<td>60%</td>
		</tr><tr><td>30,5 min</td>
			<td>100%</td>
		</tr><tr><td>40 min</td>
			<td>100%</td>
		</tr><tr><td>40,5 min</td>
			<td>25%</td>
		</tr><tr><td>50 min</td>
			<td>25%</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Conditions pour la purification par CLHP en phase inversée de CpG modifié par le cholestérol. Abréviations : TEAA = acétate de triéthylammonium; MeCN = acétonitrile.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Lysat sans cellules (mL)</td>
			<td>Lipide DMPC (mg)</td>
			<td>Télodendrimère (mg)</td>
			<td>MOMP plasmide (μg)</td>
			<td>Rendement MOMP purifié (mg)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>0.4</td>
			<td>15</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>8</td>
			<td>0.8</td>
			<td>30</td>
			<td>1.1</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>12</td>
			<td>1.2</td>
			<td>45</td>
			<td>1.6</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>75</td>
			<td>2.7</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 3 : La quantité de lipides, de télodendrimères et de plasmides utilisés pour des réactions acellulaires à différentes échelles et les rendements correspondants. Abréviations : MOMP = protéine de la membrane externe majeure chlamydiale; DMPC = 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Ratios d’entrée plasmidique, MOMP : Δ49ApoA1</td>
			<td>1:1</td>
			<td>5:1</td>
			<td>10:1</td>
			<td>25:1</td>
			<td>50:1</td>
			<td>100:1</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Rapports de la quantité de protéines produites, MOMP : Δ49ApoA1</td>
			<td>0.02</td>
			<td>0.32</td>
			<td>0.64</td>
			<td>3.46</td>
			<td>6.55</td>
			<td>20.04</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Nombre estimé d’insertion de MOMP par tNLP</td>
			<td>0.03</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.75</td>
			<td>4.04</td>
			<td>7.65</td>
			<td>23.39</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 4 : Les rapports plasmidiques dans une réaction acellulaire et les taux d’insertion MOMP qui en résultent. Abréviations : MOMP = protéine de la membrane externe majeure chlamydiale; tNLP = particule de nanolipoprotéine télodendrimère; Δ49ApoA1 = Dérivé ApoA1 de souris marqué.

Ce protocole décrit l’utilisation de kits commerciaux d’expression protéique acellulaire pour produire des protéines membranaires supportées dans des nanodisques qui peuvent être utilisées comme antigènes dans les vaccins sous-unitaires.

Production à l’échelle sans cellules et ajout d’adjuvant à une protéine recombinante de la membrane externe majeure de Chlamydia muridarum pour le développement d’un vaccin

Subunit vaccines offer advantages over more traditional inactivated or attenuated whole-cell-derived vaccines in safety, stability, and standard ...

De nombreux antigènes vaccinaux sous-unitaires candidats sont des protéines membranaires. Historiquement, ceux-ci ont été difficiles à produire et à purifier en quantités suffisantes. Avec cette technique, nous sommes en mesure de créer des antigènes d’intérêt intégrés dans une membrane lipidique pour aider à assurer une confirmation de type natif.Ce processus facilite également la formulation avec des adjuvants d’intérêt. L’expression acellulaire permet la production rapide de protéines d’intérêt dans leur structure native sans étiquette. Cette technique est également évolutive et nous travaillons déjà avec des sociétés commerciales pour développer des formulations vaccinales utilisant ce processus.Nous démontrons ici le processus pour un antigène de chlamydia, mais le processus pourrait être facilement adapté pour produire des antigènes d’intérêt, qu’il s’agisse ou non de protéines membranaires. Ce processus peut s’appliquer à la fois à la mise au point d’agents pathogènes et de vaccins contre le cancer. Pour commencer, préparez les MOMP-tNLP en utilisant une méthode sans cellule.Décongelez le tampon de reconstitution du kit d’expression protéique acellulaire deux heures avant de régler la réaction et ajoutez un inhibiteur de protéase sans EDTA au tampon. Utilisez un kit conçu pour exécuter cinq réactions d’un millilitre. Pour chaque réaction d’un millilitre, ajoutez 525 microlitres de tampon de reconstitution dans le flacon de lysat d’E. coli et roulez-le pour le dissoudre.Ajouter 250 microlitres du tampon de reconstitution dans le flacon de réaction contenant l’additif et dissoudre par roulage. Ensuite, ajoutez 8,1 millilitres de tampon de reconstitution au flacon d’alimentation à réaction et roulez-le pour le dissoudre. Dans une bouteille de mélange d’acides aminés, ajoutez trois millilitres de tampon de reconstitution pour le dissoudre.À une autre bouteille de méthionine, ajoutez 1,8 millilitre de tampon de reconstitution, dissolvez-la et stockez-la sur de la glace. Ajouter 225 microlitres du mélange reconstitué, 270 microlitres du mélange d’acides aminés reconstitués sans méthionine et 30 microlitres de méthionine reconstituée dans le flacon de lysat E. coli. En outre, ajoutez 400 microlitres du mélange DMPC / télodendrimère, 15 microgrammes de plasmide MOMP et 0,6 microgramme de delta-49ApoA1 au mélange et mélangez-le.Aliquote 20 microlitres de la solution totale dans un tube de 1,5 millilitre Pour une réaction de contrôle exprimant la GFP. Préparer une solution alimentaire en ajoutant 2,65 millilitres du mélange d’acides aminés reconstitué sans méthionine et 300 microlitres de méthionine reconstituée. Transférez un millilitre de la solution réactionnelle dans la chambre de réaction interne du kit de réaction sans cellule et scellez-le.Remplissez la chambre extérieure de la cuve de réaction avec 10 millilitres de solution d’alimentation et fermez-la. Ajouter 0,5 microlitre du plasmide témoin GFP aux aliquotes de 20 microlitres du mélange réactionnel. Mettez la réaction dans un agitateur à 300 rotations par minute pendant 18 heures à 30 degrés Celsius.Surveillez la réaction sous une lumière UV après 15 minutes pour la fluorescence due à la synthèse de GFP. Purifier le complexe de nanoparticules MOMP-tNLP du mélange réactionnel acellulaire par chromatographie d’affinité au nickel immobilisée à l’aide du marqueur HIS sur la protéine delta-49ApoA1. Transférer un millilitre de la boue à 50% de la résine de purification HIS-tag dans une colonne de chromatographie jetable de 10 millilitres et ajouter trois millilitres de tampon de liaison pour équilibrer.Ensuite, vidangez le tampon et ajoutez 250 microlitres de tampon de liaison à la résine. Extraire 20 microlitres du mélange réactionnel acellulaire pour l’analyse SDS-PAGE. Ajouter le reste du mélange réactionnel acellulaire avec la résine équilibrée et incuber sur une bascule de laboratoire pendant une heure à quatre degrés Celsius.Retirez le capuchon de colonne et lavez-le avec 500 microlitres de tampon de liaison. Ajouter le liquide de lavage à la colonne et recueillir le flux pour l’analyse SDS-PAGE. Laver la colonne avec un millilitre de tampon de lavage avec de l’imidazole 20 millimolaires six fois et recueillir les fractions.Pendant le lavage pour la deuxième fois, utilisez une pipette d’un millilitre pour agiter la résine. Éluer les MOMP-tNLP dans six fractions de 300 microlitres du tampon d’élution I contenant 250 millimolaires d’imidazole et une élution finale avec 300 microlitres de tampon d’élution II contenant 500 millimolaires d’imidazole. Lors de la deuxième élution, agiter vigoureusement la résine en pipetant de haut en bas à l’aide d’une pipette d’un millilitre.Utilisez un imageur gel pour capturer les images à 600 nanomètres. Ensuite, quantifier la quantité de protéines différentes dans les nanoparticules grâce à l’analyse SDS-PAGE à l’aide d’un étalon protéique. Tracez une courbe standard en utilisant les densités des bandes MOMP.Ensuite, déterminez le composant MOMP des nanoparticules avec l’étalon. Résoudre les échantillons par SDS-PAGE et transférer les piles de gel à l’aide d’un système commercial de transfert à sec pour l’analyse par transfert Western. Retirez les taches de la pile et incuberez-les pendant une nuit à quatre degrés Celsius dans un tampon de blocage contenant 0,2% TWEEN 20 et 0,5 microgrammes par millilitre MAb40, ou 0,2 microgramme par millilitre d’anticorps antiHIS-tag MAbHIS dirigé contre le HIS-tag de la protéine delta-49ApoA1.Lavez chaque tache avec du PBST trois fois pendant cinq minutes par lavage. Incuber les transferts pendant une heure dans un tampon de blocage contenant un anticorps secondaire conjugué à un fluorophore dans une dilution de 1:10 000. Répétez les lavages avec PBST et capturez l’image à l’aide d’un imageur à fluorescence après le lavage final.À l’aide d’un appareil de transfert de points, éponger trois microgrammes de MOMP-tNLP et de tNLP vide. Développer et bloquer les transferts en utilisant la même méthode pour le Western blot. Congeler la solution mélangée sur de la glace sèche et la lyophiliser pendant la nuit à l’aide d’un lyophilisateur.Conservez les formulations séchées à moins 20 degrés Celsius. Au besoin, reconstituez les tNLP lyophilisés avec de l’eau exempte d’endotoxines et roulez-les pour les dissoudre et les réhydrater. Dialyser la solution avec du PBS et retirer le tréhalose avec une membrane de dialyse coupée de 3,5 kilodaltons.Centrifuger la solution de nanoparticules dans un concentrateur sous vide avant d’ajouter l’adjuvant. Surveillez le volume de l’échantillon après 20 à 30 minutes pour éviter un séchage complet. Dans une enceinte de biosécurité, ajouter l’adjuvant dans des conditions stériles.À l’aide de la chromatographie analytique d’exclusion de taille, analyser la formulation pour une incorporation réussie. Conservez les MOMP-tNLP avec adjuvant et videz la TNLP à quatre degrés Celsius pendant 14 jours maximum. Analyser la stabilité de la formulation tNLP avec chromatographie d’exclusion de taille.L’analyse SDS-PAGE de MOMP-tNLP a été réalisée par chromatographie d’affinité au nickel, qui a démontré que le mélange réactionnel acellulaire a des niveaux élevés d’expression pour les protéines MOMP et delta-49ApoA1. En utilisant la densitométrie sur gel, la concentration de MOMP a été quantifiée à l’aide d’un MOMP recombinant purifié avec une concentration connue comme étalon. Pour déterminer la formation d’oligomères, SDS-PAGE MOMP et MOMP-tNLP ont été traités avec de la chaleur et du DTT, qui ont montré des bandes distinctes pour MOMP et delta-49ApoA1.L’analyse par transfert Western utilisant un anticorps MAb40 a été utilisée contre la protéine MOMP, qui a révélé un schéma de bandes confirmant la formation d’oligomères par la protéine MOMP dans son état non dénaturé. Un test par transfert de points a été effectué en présence d’anticorps MAb40 et MAbHIS, ce qui a indiqué la formation de MOMP-tNLP. Cependant, la TNLP vide a montré un signal positif pour MAbHIS.Les sérums des souris immunisées injectées avec adjuvant MOMP-tNLP ont démontré une forte liaison MOMP et ont indiqué que MOMP-tNLP pouvait provoquer une réponse immunitaire. Étant donné que ce protocole génère des protéines à partir de l’ADN, il est essentiel d’éviter de contaminer la réaction avec la DNase, la RNase, ainsi que l’ADN et l’ARN étrangers. Tous les matériaux ou réactifs utilisés dans les réactions doivent être exempts de ce type de molécules.Après expression, purification et ajout d’adjuvants, ces candidats vaccins peuvent être évalués dans des modèles animaux appropriés pour les agents pathogènes d’intérêt afin d’évaluer les marqueurs d’activation immunitaire ou d’évaluer la protection lors d’une provocation. Pour la chlamydia, la principale protéine de la membrane externe, ou MOMP, est considérée comme l’un des principaux antigènes candidats pour les vaccins sous-unitaires depuis de nombreuses années, mais elle a été difficile à produire aux échelles nécessaires à l’application du vaccin. La co-expression acellulaire de cette protéine membranaire est un moyen viable de commencer à faire passer cette protéine à l’évaluation dans des modèles animaux tels que les souris, et éventuellement à des tests humains.

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