Boîte à outils intégrative pour analyser les signaux cellulaires: forces, mouvement, morphologie et fluorescence

Les cellules adhérentes exercent des forces sur leur environnement, et ces forces comprennent les forces que les cellules exercent sur le substrat, montrées ici en vert, et les forces que les cellules exercent sur leurs voisines, montrées en rouge. Ces forces peuvent être mesurées dans des monocouches cellulaires à l’aide d’une technique appelée microscopie à contrainte monocouche. En bref, la technique consiste à préparer des hydrogels contenant de minuscules perles fluorescentes, juste sous la surface supérieure, et de grosses perles fluorescentes collées au verre.

Sur cet hydrogel, on voit les cellules et on les cultive jusqu’à la confluence ou n’importe quel état que l’on désire mesurer les forces. La mesure des forces nécessite l’imagerie de la monocouche cellulaire, la prise d’images lumineuses transmises des cellules et d’images de lumière fluorescente des perles minuscules et grandes. Chacune de ces images est acquise dans le même plan vocal.

Ces images sont acquises lorsque les cellules sont attachées et détachées de l’hydrogel. Et une comparaison de ces deux ensembles d’images nous fournit les données nécessaires pour quantifier toutes ces forces. C’est là qu’AcTrM et AnViM entrent en jeu.

Après avoir plaqué les cellules, pour que vous puissiez acquérir des images exactement au même endroit, à n’importe quelle instance souhaitée, ce protocole est programmé dans AcTrM, puis pour analyser ensuite ces données et visualiser les résultats, c’est le but d’AnViM. Dans les prochaines minutes, nous vous guiderons à travers le processus d’acquisition d’images pour une monocouche de cellule de confluence. L’étape zéro de l’action invite l’utilisateur à sélectionner le type d’acquisition.

Une nouvelle acquisition pour commencer une nouvelle expérience, ou une acquisition continue pour reprendre une expérience antérieure. Cliquez sur Nouvelle acquisition pour créer une liste de positions. La première étape de l’action répertorie toutes vos étapes suivantes.

Et ces actions seront prises dans la fenêtre de liste des positions de scène ici. Cliquez sur Live in Micro-Manager pour visualiser l’exemple pour les ajustements manuels. En direct, nous examinerons la phase.

Ici, c’est clair. Maintenant, il faudra regarder les perles. Ici, les perles peuvent être visualisées en fluorescence.

Sélectionnez donc le canal approprié pour les perles supérieures. Il est également important que vous puissiez voir quelques perles inférieures, alors regardons un canal pour les perles inférieures. Ce que vous voyez ici est une image floue de perles du bas, et c’est tout à fait bien tant que vous pouvez dire que les perles du bas sont là, ce que vous pouvez dans cette image.

Liste des positions, cliquez sur Marquer. C’est ainsi que vous créez une liste de postes. Après avoir créé une liste de positions, qui a été abordée dans la vidéo précédente, suivez les étapes répertoriées dans l’action étape deux à l’aide de la fenêtre d’acquisition multidimensionnelle.

Disons que nous voulons effectuer un long time-lapse. Ici, je vais indiquer le nombre d’images que nous voulons prendre. Le premier canal va être le canal de phase.

Le prochain sera celui des perles supérieures et celui d’après sera celui des perles inférieures. Cliquez sur Fermer dans la fenêtre d’acquisition multidimensionnelle et cliquez sur OK dans acTrM étape deux. La sortie sera enregistrée dans le répertoire identifié dans la fenêtre d’acquisition multidimensionnelle.

La troisième étape de l’action demandera si l’expérience a besoin d’être récupérée. La réponse sera généralement oui. Ici, iTACS demande, voulons-nous effectuer une récupération affinée?

Cette première partie va nous rapprocher d’une reprise raffinée, mais la partie inférieure va nous rapprocher encore plus d’une plus grande précision de repositionnement. Si la récupération doit être effectuée en utilisant un champ de vision limité, cette option est proposée, mais pour cette expérience, nous ne sélectionnerons pas cette option. À ce stade, l’acquisition d’un ensemble d’images de référence est terminée et Micro-Manager peut être fermé.

Pour l’acquisition d’images, on va démarrer AcTrM. Sélectionnez l’agrandissement et choisissez le répertoire qui contient les dossiers de données. Sélectionnez les choix de repositionnement de la plaque ainsi que le canal utilisé pour le repositionnement.

Une interface est fournie pour faire correspondre ce qui est actuellement vu dans l’appareil photo avec les images enregistrées. S’il y a chevauchement, les images afficheront une couleur rouge et verte avec du noir, et un réglage manuel peut être effectué. Sinon, appuyez sur accepter et l’acquisition se poursuivra.

Nous pouvons maintenant commencer FIJI. Sélectionnez la première option dans le menu déroulant MSM intitulée prétraitement. Ensuite, sélectionnez le dossier contenant le dossier tnimgs.

Ensuite, nous devrons définir quel canal correspond à quelle image. Pour cet exemple, le canal 0 est l’image de lumière transmise qui est l’image de contraste de phase des cellules. L’image de perle inférieure est le canal 2 et l’image de perle supérieure est le canal 1.

Et puis, il vous demande où les cellules se croisent et de quel côté de l’image. Dans ce cas, les cellules sont une monocouche avançant vers le bord droit, nous allons donc désélectionner Droite et continuer. Ici, une petite région de perles supérieures, située loin de la monocouche, sert le même but que les images de perles inférieures qui sembleraient plus clairsemées et plus grandes que celles montrées ici.

Maintenant, il nous demande si nous voulons changer la luminosité et le contraste afin que les perles apparaissent bien en évidence. Nous ajustons donc à l’aide des barres de défilement dans le menu, et une fois que les perles apparaissent bien en évidence, cliquez sur OK. Et maintenant, nous allons faire la correction de position. S’il y a un changement, il s’en débarrassera.

Et une fois cela fait, il créera le dossier d’analyse. À l’intérieur du dossier d’analyse, il créera le dossier de position, P0, et les choix que nous avons faits dans les menus de prétraitement précédents sont stockés dans les choix d’analyse, tels que les bords croisés, la taille des pixels et l’image à contraste de phase et autres. Dans le menu déroulant Microscopie à contrainte monocouche ou MSM, sélectionnez Déformation du gel MSM.

À partir de là, nous sélectionnerons l’option qui convient à notre distribution de perles. Et au fur et à mesure que les données sont en cours de traitement, vous pouvez voir qu’un nouveau dossier de déplacement est apparu dans le dossier de position. C’est là que tous les fichiers de sortie seront stockés.

Cela indique que l’analyse est terminée. Nous allons examiner comment calculer les forces qui s’exercent à travers la jonction cellule-ECM et la jonction cellule-cellule et aussi le cytosquelette des cellules individuelles de la monocouche. Pour cela, sélectionnez la troisième option.

Et on va choisir le répertoire qui contient tnimgs et le dossier d’analyse, ce qui signifie que l’on sélectionnera l’exemple de répertoire plutôt que l’un de ces répertoires. Appuyez sur sélectionner, et il vous demandera, quel est le module de cisaillement de ce gel? Le module de cisaillement est de 1250 et l’épaisseur de l’hydrogel dans cet exemple est de 118 microns.

Le niveau de bruit prévu est fourni ici. Ensuite, il y a le déplacement moyen est zéro drapeau, qui n’est pas vérifié dans ce cas. Sélectionnez OK, et l’implémentation qui calcule la traction s’exécute via une fonction MATLAB, c’est ainsi qu’elle est implémentée dans cette version d’AnViM.

Maintenant, il est prêt à faire le calcul des forces cellule-cellule ou cytosquelette. Et la première question à se poser est, est-ce que la monocouche est confluente? Dans ce cas particulier, nous avons une monocouche qui avance et il n’y a pas de région cellulaire sur le côté droit du cadre.

Donc, la réponse est que la monocouche n’est pas confluente, donc nous allons dire non. Maintenant, on nous demande de dessiner un polygone autour du plus grand objet non cellulaire. Nous sélectionnons les méthodes appropriées pour la segmentation.

Ici, il nous demande d’indiquer la couleur des cellules dans les méthodes trois et quatre, donc ici les cellules sont noires donc nous choisirons le noir. La segmentation produite à partir de ces différentes méthodes se termine par des trous dans la monocouche cellulaire et des régions blanches dans la zone sans cellule. Ici, nous pouvons choisir, remplir les taches automatiquement et appuyer sur OK.So maintenant toutes les taches sont remplies dans la monocouche et aucune zone cellulaire.

Et puis, nous allons ensuite calculer les contraintes mécaniques dans la monocouche cellulaire. Nous avons déjà effectué la première partie où nous avons segmenté les cellules de la région sans cellule, nous commençons donc cette étape par la deuxième partie qui est la segmentation des cellules individuelles et des images. On va sélectionner la segmentation pour les cellules individuelles.

Et ici, il nous demande de choisir le répertoire de positions. Et il y a plus d’informations données ici pour ces paramètres. Ensuite, il vous demande de dessiner un polygone autour de la plus petite cellule normale.

Donc, ce que vous dessinez ici est utilisé pour calculer la surface et il va stipuler que tout ce qui est plus petit que cela n’est pas défini comme une cellule. Et ensuite, il demande la plus grande cellule. Alors nous dessinons un polygone autour de la plus grande cellule normale, puis il demande, lequel est le plus lumineux?

L’interface cellule-cellule est-elle plus lumineuse ou les centres cellulaires sont-ils plus lumineux ? Donc, dans ce cas, l’interface cellule-cellule est plus lumineuse, donc je vais sélectionner l’interface cellule-cellule. Cela indique donc que le calcul est terminé.

Commençons par sélectionner la carte sur les intensités des cellules. Tout d’abord, iTACS demande à l’utilisateur de sélectionner le répertoire de position, également connu sous le nom de dossier P0. Lorsque vous avez terminé, cliquez sur Sélectionner.

Ensuite, il est demandé à l’utilisateur s’il souhaite que l’iTACS détecte la division cellulaire ou quantifie la fluorescence cellulaire. Dans ce cas, nous n’avons pas de protéines fluorescentes à l’intérieur de la cellule, c’est pourquoi nous choisirons de détecter la division cellulaire. La diapositive suivante permet à l’utilisateur de définir la taille de la région voisine, il s’agit d’une analyse unique qu’AnViM effectue où il examine les propriétés des cellules individuelles ainsi que les propriétés de la région voisine des cellules.

Ici, l’utilisateur peut choisir la largeur d’une région voisine des cellules. Dans ce cas, nous définissons les régions voisines avec 60 pixels. La première case à cocher demande si nous voulons qu’iTACS collecte les propriétés des cellules, oui nous le faisons, et cette case à cocher demande si nous voulons qu’iTACS collecte les propriétés des voisins, oui, nous voulons qu’iTACS le fasse aussi.

Sous ces cases à cocher, iTACS fournit plus d’informations sur les cases à cocher si l’utilisateur souhaite plus de détails sur chaque case à cocher. Cela indique que l’analyse est terminée. Encore une fois, iTACS demande à l’utilisateur de sélectionner le répertoire de position.

Ensuite, l’utilisateur a le choix de mapper les données de force, de créer des images des données de force, de cartographier les données de vitesse et de créer des images des données de vitesse. Il est important de noter que la création d’images prend du temps, on peut donc choisir de le faire maintenant ou d’attendre de le faire plus tard. C’est pourquoi l’utilisateur a la possibilité de sélectionner les choix ou non.

Ici, iTACS demande à l’utilisateur de déterminer à nouveau la taille de la région voisine, et vous pouvez utiliser la même taille que celle que vous avez déterminée pour les intensités de mappage, qui était de 60 pixels, dans notre cas. Et encore une fois, l’utilisateur est invité à collecter les propriétés des cellules ainsi que de sa région voisine. Cela indique que l’analyse est terminée.

Dans le menu déroulant Microscopie à contrainte monocouche ou MSM, sélectionnez les données de suivi des résultats. Tout d’abord, iTACS demande à l’utilisateur de sélectionner le répertoire de position, également connu sous le nom de dossier P0. Lorsque vous avez terminé, cliquez sur Sélectionner.

Ici, iTACS demande à partir de quel numéro de trame l’utilisateur veut qu’iTACS commence à suivre les données. Il est assez sûr de commencer le suivi à partir de l’image numéro deux, car la vitesse ne peut pas être déterminée pour l’image numéro un. Ici, iTACS demande à l’utilisateur d’indiquer le nombre maximum de tracés à remplir simultanément.

Et essentiellement, c’est un moyen d’accélérer le suivi des données. Lorsque vous avez terminé, cliquez sur OK et les options de choix des variables pendant le suivi sont présentées de la même manière que les options de génération de cartes thermiques. Les propriétés d’intérêt courantes sont fournies dans la zone de texte en haut de la fenêtre.

Mais si vous souhaitez personnaliser vos variables, il vous suffit de tout supprimer dans la zone de texte et de sélectionner les propriétés spécifiques répertoriées ci-dessous. Dans le menu déroulant Microscopie à contrainte monocouche ou MSM, sélectionnez le diagramme des résultats. Après cela, iTACS demande à l’utilisateur s’il souhaite limiter le traçage aux cellules avec une piste ininterrompue.

Si vous ne souhaitez pas limiter le traçage aux pistes ininterrompues, cliquez sur Non.Mais si vous souhaitez limiter le traçage aux cellules avec des pistes ininterrompues, cliquez sur Oui Ici iTACS demande combien de variables l’utilisateur souhaite que le programme trace. iTACS est capable de tracer jusqu’à trois variables, et dans ce cas, nous ne tracerons que deux variables pour voir la relation entre ces facteurs. Dans le menu déroulant Microscopie à contrainte monocouche ou MSM, sélectionnez l’image des résultats.

Voici le répertoire de position et, une fois terminé, cliquez sur Sélectionner. iTACS nous demande ensuite de choisir le cadre de départ. Ici, nous avons sélectionné l’image numéro deux.

Les options de création de cartes thermiques sont présentées de la même manière que les options de traçage des traces temporelles de cellules individuelles. Avec cela, nous concluons comment faire une carte thermique. Ici représente la trace temporelle de la vitesse cellulaire dans la tension cytosquelettique pour la cellule numéro un.

Les propriétés sont affichées sur un axe vertical partagé et l’axe horizontal indique le numéro d’instance temporelle, où les images sont acquises à des intervalles de 15 minutes. La deuxième sortie est un tableau de cartes thermiques une heure après le début de l’expérience. Les propriétés présentées ici comprennent la zone d’étalement, l’orientation, la circularité, la vitesse, la direction du mouvement, l’orientation de la tension maximale, la tension cytosquelettique, les tractions du substrat et l’anisotropie de tension des cellules individuelles.

Il s’agit donc d’un aperçu d’un ensemble d’expériences. Il existe plusieurs autres situations expérimentales où AnViM et AcTrM peuvent aider l’utilisateur à faire l’expérience de manière reproductible et ces contacts sont répertoriés dans le manuscrit. Certaines des principales caractéristiques d’iTACS incluent l’automatisation du protocole expérimental, l’analyse automatisée des données et aucune formation en ingénierie n’est requise.